WO2017023194A1 - Способ диагностики иммунной системы и набор для оценки днк молекул trec, krec и количество геном эквивалентов днк - Google Patents

Способ диагностики иммунной системы и набор для оценки днк молекул trec, krec и количество геном эквивалентов днк Download PDF

Info

Publication number
WO2017023194A1
WO2017023194A1 PCT/RU2016/000514 RU2016000514W WO2017023194A1 WO 2017023194 A1 WO2017023194 A1 WO 2017023194A1 RU 2016000514 W RU2016000514 W RU 2016000514W WO 2017023194 A1 WO2017023194 A1 WO 2017023194A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
trec
dna
krec
molecules
il17ra
Prior art date
Application number
PCT/RU2016/000514
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Мария Александровна ГОРДУКОВА
Андрей Петрович ПРОДЕУС
Максим Леонидович ФИЛИПЕНКО
Илья Анатольевич КОРСУНСКИЙ
Original Assignee
Общество С Ограниченной Ответственностью "Абв -Тест"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество С Ограниченной Ответственностью "Абв -Тест" filed Critical Общество С Ограниченной Ответственностью "Абв -Тест"
Publication of WO2017023194A1 publication Critical patent/WO2017023194A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B70/00—Tags or labels specially adapted for combinatorial chemistry or libraries, e.g. fluorescent tags or bar codes

Definitions

  • the invention relates to the field of immunology and medicine and is intended to diagnose the state of the patient’s immune system in order to determine impaired immune system functions, including the presence of primary and secondary immune deficiency, evaluate the effectiveness of treatment methods and drugs used, and predict the effectiveness of disease prevention.
  • a known method for the diagnosis of spontaneous forms of secondary immune deficiency in children with primary peritonitis in which the relative content of activated classical monocytes with the CD14 br ' 9ht CD16HLA-DR + phenotype of the total number of monocytes with the CD14 br ' 9ht phenotype by multicolor flow cytometry is determined in a venous blood sample and with an increased relative content of activated classical monocytes (more than 68.8%), a spontaneous form of secondary immune deficiency is diagnosed (patent RU2527332, priority from 05.24.20130).
  • the proposed method improves the accuracy of identifying the characteristics of the immune response in children with primary peritonitis, however, due to its specificity, it is of limited use and requires a whole range of additional studies to obtain a more complete assessment of the state of the immune system.
  • a more accurate assessment of the state of the immune system provides methods based on determining the number of naive T-lymphocytes and B-lymphocytes, i.e. cells that are not yet in contact with the antigen and have not entered into an immune response. It is known that during maturation in the thymus, when the T-cell receptor genes are rearranged in thymocytes, a circular DNA sequence or TREC (signal joint T-cell receptor rearrangement excision circle: sjTREC or TREC) is formed.
  • TREC signal joint T-cell receptor rearrangement excision circle: sjTREC or TREC
  • TRECs are non-chromosomal non-replicating circular DNA products of the recombination of variable segments of genes encoding the TCR a and b chains in the process of T-cell maturation, which is present in naive peripheral blood T-lymphocytes. It is assumed that this non-chromosomal ring DNA does not replicate in mitosis and, in the process of cell division, passes to only one of the daughter cells.
  • Measurement of the amount of TREC by quantitative polymerase chain reaction allows the identification of cells that have recently emerged from the thymus, and thus evaluate functional activity of the thymus [Douek DC, McFarland RD, Keiser PH, Gage EA, Massey JM, Haynes BF, Polis MA, Haase AT, Feinberg MB, Sullivan JL, Jamieson BD, Zack JA, Picker LJ, Koup RA. Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection. Nature. 1998 Dec 17; 396 (6712): 690-5].
  • TREC Quantitative analysis of TREC is actively used to assess the function of the thymus and neogenesis of T cells. It has been used to diagnose immunodeficiencies [Amariglio N, Lev A, Simon A, Rosenthal E, Spirer Z, et al. (2010) Molecular assessment of thymus capabilities in the evaluation of T-cell immunodeficiency. Pediatr Res 67 (2): 211-216], for neonatal screening of PID in newborns [Puck JM (2007) SCID Newborn Screening Working Group. Population-based newborn screening for severe combined immunodeficiency: steps toward implementation.
  • TREC quantification is used to assess the contribution of thymopoiesis to peripheral T-cell pool restoration after allogeneic transplantation of hematopoietic stem cells or bone marrow [Farge D, Henegar C, Carmagnat M, Daneshpouy M, Marjanovic Z, Rabian C, Hie D, Douay C, Mounier N, Clave E, Bengoufa D, Cabane J, Marolleau JP. GIuckman E, Charron D, Toubert A. Analysis of immune reconstitution after autologous bone marrow transplantation in systemic sclerosis. Arthritis Rheum. 2005 May; 52 (5): 1555-63.].
  • a known method for determining the replicative history of a subpopulation of T cells or B cells based on the quantitative analysis of TREC and BREC - B receptor excision ring (B - cell receptor excision circle) using polymerase chain reaction (PCR) (patent EP1849877, priority 24.04. 2006).
  • the proposed method unlike the previous analogue, does not contain obstacles for practical use, but also does not have sufficient accuracy necessary for diagnosing the condition immune system the method does not stipulate the need for the simultaneous amplification of TREC, KREC DNA molecules using PCR performed in a common tank under the same conditions for all amplified molecules, which reduces the comparability of the information received and, accordingly, its value for subsequent analysis.
  • there is no precise control over the number of amplification cycles which also affects the accuracy of the analysis results and does not allow making appropriate corrections.
  • the objective of the present invention is to provide a method for diagnosing the state of the patient’s immune system, which allows, on the basis of estimating the number of TREC and KREC of naive T and B cells in blood samples and the selected set of primers and probes, to increase the accuracy of diagnosis of the patient’s immune system to the level required in clinical practice by time of analysis and providing the ability to automatically interpret the results.
  • the standard DNA sample is a recombinant plasmid carrying the sequence of the amplified DNA fragment, the exact concentration of which was measured using digital PCR with the appropriate primers and oligonucleotide samples.
  • the IL17RA gene is used as the normalization locus.
  • the number of copies of TREC, KREC DNA molecules is calculated per 10 5 nuclei containing leukocyte cells, taking into account the internal control carried out by the normalizing IL17RA locus, according to the formulas:
  • real-time analytical PCR sensitivity is at least 7 TREC, KREC, or IL17RA DNA molecules in the reaction.
  • Simultaneous amplification of sections of TREC, KREC DNA molecules and a normalization locus which is constantly present in a single copy in each amplification cycle, carried out by polymerase chain reaction (PCR) and carried out in a common container under the same conditions for all amplified molecules, can improve the accuracy of measurements and the reliability analysis results, as well as reduce analysis time.
  • PCR polymerase chain reaction
  • oligonucleotide fluorescently labeled probes carrying at the 5'-end of the fluorophore and at the 3'-end of a non-fluorescent quencher, complementary to the central part of the amplified fragments, facilitates the detection process.
  • IL17RA gene as a normalization locus allows one to eliminate errors in determining the number of amplification cycles.
  • FIG. 2 results of quantification of standard KREC DNA, detection channel - HEX, target - KREC;
  • FIG. 3 results of quantification of standard IL17RA DNA, detection channel - ROX, target - IL17RA;
  • FIG. 4 is a table of standards and calibrators.
  • the proposed diagnostic method can be implemented on the basis of the existing level of technology with the following sequence of actions.
  • test material samples of the test material are sampled.
  • the test material may be liquid blood samples or dry blood stains on paper, for example, peripheral blood (PC) of patients with suspected immunodeficiency or dry blood stains of newborns on any suitable medium.
  • PC peripheral blood
  • Taking PK is carried out in tubes with EDTA (anticoagulant that prevents blood coagulation) at a final concentration of 2 mg / ml.
  • EDTA anticoagulant that prevents blood coagulation
  • AmpliPrim RIBO-prep kits are used for DNA extraction (FBUN CRI).
  • a DNA extraction method can be based on lysis of samples (blood or dry blood stains on paper) in a 4M solution of guanidine thiocyanate, and precipitation of nucleic acids with isopropanol in the presence of a precipitant, followed by washing with ethanol, and dissolving the DNA residue in 50 ⁇ l of water.
  • the IL17RA gene is used, which allows obtaining the most accurate data on the amplification process.
  • Amplification is carried out with the participation of oligonucleotide fluorescently labeled probes of the TaqMan type, carrying fluorophores at the 5'-end (FAM, HEX, ROX, etc.) and a non-fluorescent quencher at the 3'-end (BHQ, FTQ, etc.).
  • Primers and probes for PCR were selected taking into account the structures of TREC and KREC in such a way as to exclude annealing on the matrix of genomic DNA (rearranged and not rearranged in T and B cells), as well as minimizing the primer dimers formed in the multiplex reaction.
  • a “hot start” was used, which is ensured by the use of chemically modified Taq polymerase.
  • the optimum temperature for annealing the primers and probes was selected experimentally using the “temperature gradient” mode; the optimum temperature was 62 ° C.
  • Example 1 Obtaining standard plasmid samples.
  • KREC3 5'-GTTCTCTTTCCCTTAGTGGCA-3 '
  • KREC4P 5'-R6G-CCAGCTCTTACCCTAGAGTTTCTG-BHQ-3 '
  • a 50 ⁇ l PCR reaction mixture contained: 1x Taq polymerase buffer (65 mM Tris-HCI (pH 8.9); 16 mM (NH 4 ) 2 S0 4 ; 0.05% Tween 20; 3, 5 mM MgCl 2 ), 0.2 mM dNTP, 50 ng of human genomic DNA, 1 ea Taq polymerase (Biosan), 0.5 ea Pfu polymerase (Biosan).
  • Amplification was carried out in a Tercik thermocycler (DNA technology) according to the following program: 3 min at 95 ° C for initial denaturation, 35 cycles: 10 s at 95 ° C for denaturation, 10 s at 60 ° C for hybridization of primers, 40 s at 72 ° C for elongation.
  • Amplification products with primers TREC3 REC4 1 192 bp long, IL17-Ra3 / IL17-Ra4 455 bp long and bp and KREC3 / KREC4 482 bp long hydrolyzed with a Hindlll restriction endonuclease (Sibenzyme, Novosibirsk) and ligated with the pBluscriptll SK (+) vector hydrolyzed with the same endonuclease for 3 hours with 100 units of act.
  • T4 DNA ligase Biosan).
  • the competent cells of E. coli strain XL1-Blue (Stratagene) were transformed with a ligase mixture.
  • Plasmid DNAs (pST-TREC, pST-KREC and pST-IL17RA) were isolated from 100 ml of overnight culture in LB medium using QIAGEN Plasmid Midi Kit (QIAGEN) according to the manufacturer's instructions.
  • the concentration of the obtained standard plasmid DNAs was determined spectrophotometrically and fluorometrically (Qubit TM BR kit, Invitrogen). 2 ⁇ g of DNA was digested with EcoRI restriction endonuclease for linearization. The obtained linear standards were diluted to a concentration of 10 7 -10 1 copies of plasmid DNA per ⁇ l in sterile buffer containing 10 mM TrisHCI pH7.6 and lambda phage DNA 5 ng per ⁇ l. The DNA concentration in the obtained standards was refined using digital PCR on the QX100 TM Droplet Digital TM PCR System platform (BioRad, Hercules, CA) according to the manufacturer's instructions.
  • Samples of standard samples 8 ⁇ l were mixed with 2X PCR mixture and primers and probes. Drops were formed using a Droplet Generator (DG) using 70 ⁇ DG Oil per well of a DG8 cartridge and 20 ⁇ full PCR mixture. The resulting drops (40 ⁇ _) were transferred to a 96-well PCR plate, sealed, and PCR was performed. Further, the fluorescent signal generated during the hydrolysis of Taqman samples in droplets was read using the Droplet Reader, the concentration of TREC, KREC, and IL17RA molecules was determined using QuantaSoft software. The concentration of the obtained standard samples was adjusted taking into account the data of digital PCR.
  • DG Droplet Generator
  • Example 2 Analytical characterization of the developed system for quantitative analysis of TREC and KREC.
  • IL17RA was determined by PCR on dilutions of standard plasmids from 10 9 kopecks / ml to 10 3 kopecks / ml, while attention was paid to the coefficient R 2 and the spread of Ct values for repeats. It was shown that in the concentration range from 10 9 kopecks / ml to 5x10 4 kopecks / ml for all three targets, a linear range of Ct changes in concentration with a correlation coefficient of R 2 not worse than 0.98 is observed. The smallest number of copies reliably detected in one PCR reaction with a volume of 25 ⁇ l was. 10 for TREC, 5 for KREC and 5 for IL17RA.
  • the determination of reference values for TREC and KREC depending on age is carried out on the basis of DNA analysis of a representative sample of the corresponding age group (50-60 people) of people of the same generation with normal immunological parameters using known methods and equipment.
  • determining the reference values for TREC and KREC depending on age below are the data for children aged 0-17 years, for the preparation of which DNA from a group of 56 healthy (29 boys and 27 girls) with normal immunological parameters was used (Table 1).
  • Table 1 To determine the reference values for TREC and KREC in adults, the same clinical, laboratory, and statistical approaches were used as in children.
  • Table 1 Description of the immunological parameters of the children selected to determine the reference values of TREC and KREC.
  • TREC in the blood from the heart cavity is 1, 81x10 * 3 copies
  • concentration of TREC in the blood from the heart cavity is 1, 89x10 * 2 copies, which indicates a high probability of the intravital course of severe combined immunodeficiency with a low content of T and B cells.
  • Post-mortem diagnosis after genetic testing severe combined immune deficiency with a low content of T and B cells.
  • Using the group of inventions allows to increase the reliability of the diagnosis of the state of the patient’s immune system, to reduce the errors in determining the concentration of TREC and KREC molecules, especially in the low range, and also to reduce the number of reactions required for analysis due to multiplexing.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Группа изобретений относиться к области медицинской клинической диагностики и может быть использована для количественной оценки молекул TREC, KREC, являющихся маркерами наивных Т и В клеток, соответственно, для определения состояния иммунной системы пациента. Способ предусматривает выделение ДНК из анализируемого образца крови, одновременную амплификацию участков молекул ДНК TREC, KREC и нормировочного локуса, постоянно присутствующего в единичном экземпляре в каждом цикле амплификации, осуществляемой с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). При этом регистрируют полученные результаты посредством гибридизационно- флуоресцентной детекции, определяют в режиме реального времени абсолютное количество молекул TREC, KREC и нормировочного локуса в анализируемом образце ДНК с помощью калибровочных кривых, и по результатам оценки их количества производят диагностику состояния иммунной системы пациента. Разработан набор для количественной оценки ДНК молекул TREC, KREC и количества геном эквивалентов ДНК методом ПЦР в режиме реального времени, а также набор стандартных плазмидных ДНК образцов с точно определенной абсолютной концентрацией. Изобретение позволяет уменьшить ошибки определения концентрации молекул TREC и KREC, особенно в области низких значений, а также уменьшает количество необходимых для анализа реакций за счет мультиплексирования.

Description

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ И НАБОР ДЛЯ ОЦЕНКИ ДНК
МОЛЕКУЛ TREC, KREC И КОЛИЧЕСТВО ГЕНОМ ЭКВИВАЛЕНТОВ ДНК
Область техники
Изобретение относится к области иммунологии и медицины и предназначено для осуществления диагностики состояния иммунной системы пациента с целью определения нарушения функций иммунной системы, в том числе, наличие первичной и вторичной иммунной недостаточности, оценки эффективности методов лечения и применяемых лекарственных средств, прогнозирования эффективности профилактики заболеваний.
Уровень техники
Контроль состояния иммунной системы пациента позволяет своевременно диагностировать нарушения иммунного статуса организма человека, оценивать эффективность методов лечения и лекарственных средств, а также противопоказания к их применению, прогнозировать развитие заболеваний и эффективность вакцинации и т.п., что имеет большое значение для различных областей медицины.
Известен экспресс-способ определения нарушения иммунного статуса организма человека путем проведения реакции лизиса эритроцитов барана 25% сывороткой крови человека с использованием эндогенных гетерофильных антител при температуре 37,0±0,5°С в течение 10 мин в присутствии 0.288М NaCI в буферном растворе. посредством оценки иммунного статуса (патент RU2422831 , приоритет от 19.10.2009). Степень ингибирования лизиса определялась как разность показателей лизиса в контрольной пробе (с использованием стандартизированных эритроцитов барана в вероналовом солевом буфере) и в опытных пробах, содержащих возрастающие концентрации NaCI. Предлагаемый способ отличается относительной простотой и доступностью, а также сокращает время на проведение анализа до 25 минут, однако не обеспечивает достаточной точности и полноты диагностики нарушения иммунного статуса.
Известен способ диагностики спонтанной формы вторичной иммунной недостаточности у детей с первичным перитонитом, при котором в пробе венозной крови определяют относительное содержание активированных классических моноцитов с фенотипом CD14br'9ht CD16HLA-DR+ от общего количества моноцитов с фенотипом CD14br'9ht методом многоцветной проточной цитометрии и при повышенном относительном содержании активированных классических моноцитов (более 68,8%) диагностируют спонтанную форму вторичной иммунной недостаточности (патент RU2527332, приоритет от 24.05.20130). Предлагаемый способ позволяет повысить точность выявления особенностей иммунного ответа у детей с первичным перитонитом, однако, в силу своей специфичности, имеет ограниченное применение и требует проведения целого комплекса дополнительных исследований для получения более полной оценки состояния иммунной системы.
Известен способ оценки тяжести больных с постнекротическими свищами поджелудочной железы путем исследования крови больного, при котором оценку состояния больного производят на основе показателя клеточного иммунитета - иммунорегуляторного индекса (RU2442162, приоритет от 02.07.2010). При проведении исследований определяют методом проточной цитометрии субпопуляционный состав лимфоцитов, рассчитывают соотношение CD3+4+ Т-хелперов к CD3+8+ Т-цитоксическим лимфоцитам (иммунорегуляторный индекс) и при его уровне 0,5-0,3 оценивают состояние больного как тяжелое. Предложенный способ позволяет оценить уровень клеточного иммунитета больного и по полученным результатам определить состояние больного, однако, также имеет ограниченное применение и не обладает достаточной точностью.
Известны способы определения состояния иммунной системы пациента по определению количественного содержания Т-лимфоцитов и В-лимфоцитов (Иммунодефициты: принципы диагностики и лечения, Сетдикова Н.Х. и др., ФАРМУС ПРИНТ, М., 2006). Указанные способы имеют широкую область применения, но не обеспечивают достаточно точной оценки изначального состояния иммунной системы пациента, поскольку не учитывают качество и функциональную зрелость лимфоцитов, а количество лейкоцитов в момент проведения анализа может зависеть не только от общего состояния иммунной системы пациента, но и от наличия других факторов, влияющих на иммунную систему, в том числе, от характера и интенсивности воздействия чужеродных антигенов и/или наличия вредных электромагнитных излучений, загрязнений атмосферы и прочих сопутствующих факторов, которые могут оказать негативное воздействие на иммунную реакцию.
С учетом данных причин более точную оценку состояния иммунной системы обеспечивает способы основанные на определении количества наивных Т-лимфоцитов и В-лимфоцитов, т.е. клеток еще не контактирующих с антигеном и не вступивших в иммунный ответ. Известно, что во время созревания в тимусе при перестройке генов Т- клеточного рецептора в тимоцитах образуется последовательность кольцевой ДНК, или TREC (signal joint T-cell receptor rearrangement excision circle: sjTREC или TREC). TRECs представляют собой нехромосомные нереплицирующиеся кольцевые ДНК продукты рекомбинации вариабельных сегментов генов, кодирующих TCR а и b цепи, в процессе созревания Т- клеток, которая присутствует в наивных Т-лимфоцитах периферической крови. Предполагается, что эта нехромосомная кольцевая ДНК не реплицируется в митозе и в процессе деления клетки переходит лишь к одной из дочерних клеток. Измерение количества TREC методом количественной полимеразной цепной реакции позволяет выявить клетки, недавно вышедшие из тимуса, и, таким образом, оценить функциональную активность тимуса [Douek DC, McFarland RD, Keiser PH, Gage EA, Massey JM, Haynes BF, Polis MA, Haase AT, Feinberg MB, Sullivan JL, Jamieson BD, Zack JA, Picker LJ, Koup RA. Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection. Nature. 1998 Dec 17; 396(6712):690-5].
Количественный анализ TREC активно применяется для оценки функции тимуса и неогенеза Т-клеток. Он был использован для диагностики иммунодефицитов [Amariglio N, Lev A, Simon A, Rosenthal Е, Spirer Z, et al. (2010) Molecular assessment of thymus capabilities in the evaluation of T-cell immunodeficiency. Pediatr Res 67(2): 211-216], для неонатального скрининга ПИД у новорожденных [Puck JM (2007) SCID Newborn Screening Working Group. Population-based newborn screening for severe combined immunodeficiency: steps toward implementation. J Allergy Clin Immunol 120(4): 760-768] и как предиктор восстановления Т-клеточной функции после пересадки костного мозга [Roifman СМ, Somech R, Grunebaum Е (2008) Matched unrelated bone marrow transplant for T+ combined immunodeficiency. Bone Marrow Transplant 41 (11): 947-952]. Квантификация TREC с помощью real-time PCR и конструирование плазмиды, несущей фрагмент TREC, необходимой для построения калибровочной кривой, была описана Douek D.C, с соавторами еще в 1998 году. В дальнейшем различные варианты real-time PCR (моноплексные и мультиплексные с мишенью отражающей количество геном эквивалентов в исследуемой ДНК) были предложены, для некоторых была проведена достаточно тщательная аналитическая и клиническая валидация.
Кроме того, определение количества TREC используют для оценки вклада тимопоэза в восстановление Т-клеточного пула на периферии после аллогенной трансплантации стволовых кроветворных клеток или костного мозга [Farge D, Henegar С, Carmagnat М, Daneshpouy М, Marjanovic Z, Rabian С, Hie D, Douay C, Mounier N, Clave E, Bengoufa D, Cabane J, Marolleau JP.GIuckman E, Charron D, Toubert A. Analysis of immune reconstitution after autologous bone marrow transplantation in systemic sclerosis. Arthritis Rheum. 2005 May;52(5): 1555-63.].
В работе [Baker MW, Grossman WJ, Laessig RH, Hoffman GL, Brokopp CD, Kurtycz DF, Cogley MF, Litsheim TJ, Katcher ML, Routes JM. Development of a routine newborn screening protocol for severe combined immunodeficiency. J Allergy Clin Immunol. 2009 Sep;124(3):522-7] Baker и др. пытались оценить возможность применения количественного анализа TREC в ДНК выделенной из Guthrie - карточек (примерно 3 мкл крови). Авторы показали, что тест адекватен для выявления новорожденных детей с ПИД и в настоящее время он применяется для этих целей в штате Висконсин (США). Для анализа авторы использовали систему, предложенную в работе Douek DC, Vescio RA, Betts MR, Brenchley JM, Hill BJ, Zhang L, Berenson JR, Collins RH, Koup RA. Assessment of thymic output in adults after haematopoietic stem-cell transplantation and prediction of T-cell reconstitution. Lancet. 2000 May 27;355(9218): 1875-81. Применение известных способов и тест-систем, использующих количественный анализ TREC, позволяет, до определенного уровня, повысить точность оценки количества наивных Т-лимфоцитов, однако этого недостаточно для получения приемлемого уровня точности диагностики состояния иммунной системы. В связи с этим для повышения точности диагностики количественные методы дополняются иными методами, т.е. являются, по существу, «полуколичественными», но все равно не обеспечивают достаточной точности и способны выявлять только грубые отклонения от нормы. Кроме того, оценка состояния иммунной системы только по количеству наивных Т- лимфоцитов, без учета количества наивных В - лимфоцитов, в принципе не в состоянии обеспечить полную и точную диагностику состояния иммунной системы.
Известны способы и тест-системы, использующие для оценки количества наивных Т-лимфоцитов и наивных В-лимфоцитов, количественный анализ TREC и KREC - рекомбинационного кольца каппа-делеционного рецептора (kappa-deleting recombination excision circle), описанные в работах [Borte S, von Dobeln U, Fasth A, Wang N, Janzi M, Winiarski J, Sack U, Pan-Hammarstrom Q, Borte M, Hammarstrom L. Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR. Blood. 2012 Mar 15; 119(11 ):2552-5], где предложено одновременное определение TREC и KREC, но в дуплексном варианте и только с использованием прибора 7500 Fast Real-Time PCR (Applied Biosystems). Авторы декларировали аналитическую чувствительность не менее 10 молекул TREC и KREC в реакции. Однако авторы не привели аналитических характеристик их варианта системы и также использовали только приборы ABI 7500 и ViiA7 от Applied Biosystems. Более того, работа содержит явные ошибки и разночтения. Так авторы используют праймеры и зонды для KREC, АСТВ и TREC. А в качестве стандартов используют плазмиды TREC, KREC и TRAC. В то же время авторы выставляют довольно низкие уровни отсечения - 15 TRECs/mkL и 10 KRECs/mkL для скрининга врожденных иммунодефицитов. Таким образом, описанный авторами способ и тест-система не могут быть использованы на практике без дальнейшего улучшения и соответствующей доработки.
Известны способы и тест-системы, использующие для оценки количества наивных Т-лимфоцитов и наивных В-лимфоцитов, количественный анализ TREC и KREC - рекомбинационного кольца каппа-делеционного рецептора (kappa-deleting recombination excision circle).
Известен способ определения репликативной истории субпопуляции Т-клеток или В-клеток на основе количественного анализа TREC и BREC - В-рецепторного эксционного кольца (В - cell receptor excision circle) с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) (патент ЕР1849877, приоритет от 24.04.2006). Предложенный способ, в отличие от предыдущего аналога, не содержит препятствий для практического использования, но также не обладает достаточной точностью, необходимой для диагностики состояния иммунной системы, т.к. в способе не оговорена необходимость одновременной амплификации молекул ДНК TREC, KREC с помощью ПЦР, проводимой в общей емкости при одинаковых условиях для всех амплифицируемых молекул, что снижает сопоставимость получаемой информации и, соответственно, ее ценность для последующего анализа. Кроме того, отсутствует точный контроль за количеством циклов амплификации, что также сказывается на точности результатов анализа и не позволяет вносить соответствующие поправки.
Раскрытие изобретения
Задачей настоящего изобретения является создание способа диагностики состояния иммунной системы пациента позволяющего на основе оценки количества TREC и KREC наивных Т и В клеток в образцах крови и выбранного для него набора праймеров и зондов повысить точность диагностики состояния иммунной системы пациента до необходимого в клинической практике уровня при сокращении времени проведения анализа и обеспечении возможности автоматической интерпретации полученных результатов.
Решение указанной задачи обеспечивается тем, что, в отличие от известных способов диагностики состояния иммунной системы пациента на основе оценки количества наивных Т и В клеток новым является то, что выделяют ДНК из анализируемого образца крови, затем производят одновременную амплификацию участков молекул ДНК TREC, KREC и нормировочного локуса, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), проводимой в общей емкости при одинаковых условиях для всех амплифицируемых молекул и в присутствии олигонуклеотидных флуоресцентно меченых зондов, несущих на 5'-конце флуорофоры и на З'-конце не флуоресцентный тушитель, комплементарных центральной части амплифицируемых фрагментов, регистрируют полученные результаты посредством гибридизационно-флуоресцентной детекции, определяют в режиме реального времени абсолютное количество молекул TREC, KREC и нормировочного локуса в анализируемом образце ДНК с помощью калибровочных кривых, построенных при амплификации стандартных образцов ДНК, взятых не менее чем в 4-х последовательно убывающих десятикратных разведениях известных концентраций, и по результатам оценки их количества производят диагностику состояния иммунной системы пациента.
Кроме того, стандартный образец ДНК представляет собой рекомбинантную плазмиду, несущую последовательность амплифицируемого фрагмента ДНК, точная концентрация которой измерена с помощью цифровой ПЦР с соответствующими праймерами и олигонуклеотидными пробами.
Кроме того, в качестве нормировочного локуса используют ген IL17RA. Кроме того, количество копий молекул ДНК TREC, KREC рассчитывается на 105 ядер содержащих клеток лейкоцитов с учетом внутреннего контроля, осуществляемого нормировочным локусом IL17RA, по формулам:
количество TREC = (количество копий TREC /количество копий IL17RA)*200000; количество ^ЕС=(количество копий KREC/количество копий IL17RA)*200000
Кроме того, аналитическая чувствительность ПЦР в режиме реального времени составляет не менее 7 молекул ДНК TREC, KREC или IL17RA в реакции.
Кроме того, решение указанной задачи обеспечивается набором праймеров, зондов и стандартных образцов для оценки количества ДНК молекул TREC, KREC и количества геном эквивалентов ДНК, включающий:
олигонуклеотидные праймеры и пробы для амплификации при помощи одной triplex-ПЦР в реальном времени молекул ДНК TREC, KREC и IL17RA, соответственно, TREC2fo 5'-GTGATGCCACATCCCTTTCAA-3'
TREC2re 5'-ACGGTGAATGAAGAGCAGACA-3'
TRECp2 5'-FAMCTCTGG I I I I I GTAAAGGTGCC-BHQ-3'
KREC3 S'-GTTCTCTTTCCCTTAGTGGCA-S'
KREC4P 5'-R6G-CCAGCTCTTACCCTAGAGTTTCTG-BHQ-3'
KREC4 5 -CTGGGTGGGACTCCAGGA-3'
IL17RA-U 5'-CTTGATGCTCTCGCTCTTCG-3'
IL17RA-R 5'-TGTAGCCCTGGTCAGACTG-3'
и набор стандартных плазмидных ДНК образцов для TREC, KREC и IL17RA с концентраций 104, 103, 102, 5 копий на мл.
Подробное раскрытие изобретения
Одновременная амплификация участков молекул ДНК TREC, KREC и нормировочного локуса, постоянно присутствующего в единичном экземпляре в каждом цикле амплификации, осуществляемой с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и проводимой в общей емкости при одинаковых условиях для всех амплифицируемых молекул позволяет повысить точность проводимых измерений и достоверность результатов анализа, а также сократить время проведения анализа.
Использование олигонуклеотидных флуоресцентно меченых зондов несущих на 5'- конце флуорофоры и на З'-конце не флуоресцентный тушитель, комплементарных центральной части амплифицируемых фрагментов, облегчает процесс детектирования.
Использование для регистрации полученных результатов гибридизационно- флуоресцентной детекции и определение в режиме реального времени абсолютного количества молекул ДНК TREC, KREC и нормировочного локуса в анализируемом образце ДНК с помощью калибровочных кривых, построенных при амплификации стандартных образцов ДНК, взятых в 4-х последовательно убывающих десятикратных разведениях известных концентраций, позволяет повысить точность и достоверность результатов количественного анализа.
Использование оценки абсолютного количества молекул ДНК TREC, KREC и нормировочного локуса в анализируемом образце ДНК повышает достоверность диагностики состояния иммунной системы пациента, а также сокращает время проведения диагностики.
Применение предложенных стандартных образцов ДНК позволяет повысить точность и достоверность результатов количественного анализа.
Использование в качестве нормировочного локуса гена IL17RA позволяет исключить ошибки при определении количества циклов амплификации.
Использование предложенного набора праймеров, зондов и стандартных образцов для оценки количества ДНК молекул TREC, KREC и количества геном эквивалентов ДНК, включающего:
олигонуклеотидные праймеры и пробы для амплификации при помощи одной triplex-ПЦР в реальном времени молекул ДНК TREC, KREC и IL17RA, соответственно,
TREC2fo 5'-GTGATGCCACATCCCTTTCAA-3'
TREC2re 5'-ACGGTGAATGAAGAGCAGACA-3'
TRECp2 5'-FAMCTCTGG I I I I I GTAAAGGTGCC-BHQ-3'
KREC3 5'-GTTCTC I I I CCCTTAGTGGCA-3'
KREC4P 5'-R6G-CCAGCTCTTACCCTAGAG I I I CTG-BHQ-3'
KREC4 5'-CTGGGTGGGACTCCAGGA-3'
IL17RA-U 5'-CTTGATGCTCTCGCTCTTCG-3'
IL17RA-R 5'-TGTAGCCCTGGTCAGACTG-3'
и набор стандартных плазмидных ДНК образцов для TREC, KREC и IL17RA с концентраций 104, 103, 102, 5 копий на мл,
обеспечивает оптимизацию реализации способа и получение заявленного технического результата.
Результаты исследований иллюстрируются графическими изображениями:
Фиг.1 - результаты квантификации стандартной ДНК TREC, канал детекции - FAM, мишень - TREC;
Фиг. 2 - результаты квантификации стандартной ДНК KREC, канал детекции - HEX, мишень - KREC;
Фиг. 3 - результаты квантификации стандартной ДНК IL17RA, канал детекции - ROX, мишень - IL17RA;
Фиг. 4 - таблица стандартов и калибраторов. Предлагаемый способ диагностики может быть реализован на базе существующего уровня техники следующей последовательностью действий.
Первоначально производят взятие проб исследуемого материала. Материалом для исследования могут являться образцы крови в жидком виде или сухие пятна крови на бумаге, например, периферическая кровь (ПК) больных с подозрением на иммунодефицит или сухие пятна крови новорожденных на любом подходящем носителе. Взятие ПК осуществляется в пробирки с ЭДТА (антикоагулянт, препятствующий свертыванию крови) в конечной концентрации 2мг/мл. ПК берут из вены обычным способом.
Для выделения ДНК используют наборы «АмплиПрайм РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ
Эпидемиологии Роспотребнадзора) или любые другие с близкими характеристиками.
Например, метод выделения ДНК может быть основан на лизисе образцов (кровь или сухие пятна крови на бумаге) в 4М растворе гуанидинтиоционата, и осаждении нуклеиновых кислот изопропанолом в присутствии соосадителя, с последующими отмывками этанолом, растворении осадка ДНК в 50 мкл воды.
В качестве нормировочного локуса используют ген IL17RA, позволяющий получить наиболее точные данные о процессе амплификации.
Амплификацию осуществляют с участием олигонуклеотидных флуоресцентно меченых зондов типа TaqMan, несущих на 5'-конце флуорофоры (FAM, HEX, ROX и др.) и на З'-конце не флуоресцентный тушитель (BHQ, FTQ и др.).
Праймеры и зонды для ПЦР подобраны с учетом структур TREC и KREC таким образом, чтобы исключить отжиг на матрице геномной ДНК (перестроенной и не перестроенной в Т и В клетках), а также с учетом минимизации образуемых в мультиплексной реакции праймер-димеров.
Для повышения чувствительности и специфичности ПЦР был применен «горячий старт», который обеспечивается использованием химически модифицированной Taq- полимеразы.
Оптимальную температуру отжига праймеров и зондов подбирали экспериментально с использованием режима «градиент температур», оптимальная температура составила 62°С.
Пример 1. Получение стандартных плазмидных образцов.
Фрагменты TREC, KREC и гена IL17RA для конструирования стандартных образцов амплифицировали с помощью праймеров:
TREC2fo 5'-GTGATGCCACATCCCTTTCAA-3'
TREC2re 5'-ACGGTGAATGAAGAGCAGACA-3'
TRECp2 5'-FAMCTCTGG I I I I I GTAAAGGTGCC-BHQ-3'
KREC3 5'-GTTCTCTTTCCCTTAGTGGCA-3' KREC4P 5'-R6G-CCAGCTCTTACCCTAGAGTTTCTG-BHQ-3'
KREC4 5'-CTGGGTGGGACTCCAGGA-3'
IL17RA-U 5'-CTTGATGCTCTCGCTCTTCG-3'
IL17RA-R 5 -TGTAGCCCTGGTCAGACTG-3'
в следующих условиях: реакционная смесь ПЦР объемом 50 мкл содержала: 1х буфер для Taq-полимеразы (65 мМ Tris-HCI (рН 8,9); 16 мМ (NH4)2S04; 0,05% Tween 20; 3,5 мМ MgCI2), 0,2 мМ дНТФ, 50 нг геномной ДНК человека, 1 е.а. Taq-полимеразы (Биосан), 0,5 е.а. Pfu-полимеразы (Биосан). Амплификацию проводили в амплификаторе «Терцик» (ДНК-технология) согласно следующей программе: 3 мин при 95°С начальной денатурации, 35 циклов: 10 с при 95°С для денатурации, 10 с при 60°С для гибридизации праймеров, 40 с при 72°С для элонгации.
Продукты амплификации с праймерами TRECЗ REC4 длиной 1 192 п.н., IL17-Ra3/ IL17-Ra4 длиной 455 п.н. и bp и KREC3/KREC4 длиной 482 п.н. гидролизовали эндонуклеазой рестрикции Hindlll (Сибэнзим, Новосибирск) и лигировали с вектором pBluscriptll SK(+), гидролизованным той же эндонуклеазой, в течение 3-х часов с 100 ед.акт. Т4 ДНК-лигазы (Биосан). Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки Е. coli штамма XL1-Blue (Stratagene). У плазмиды клонов, отобранных по результатам рестрикционного анализа, для подтверждения структуры определяли нуклеотидную последовательность вставки секвенировали методом Сенгера. Секвенирование было выполнено на автоматическом секвенаторе ABI 3130XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) с использованием набора Big dye 3.1 (Центр коллективного пользования «Геномика», ИХБФ СО РАН). Плазмидные ДНК (pST-TREC, pST-KREC и pST-IL17RA), выделяли из 100 мл ночной культуры в среде LB с помощью QIAGEN Plasmid Midi Kit (QIAGEN) согласно инструкции фирмы производителя. Концентрацию полученных стандартных плазмидных ДНК определяли спектрофотометрически и флюорометрически (набор Qubit™ BR, Invitrogen). 2 мкг ДНК подвергали гидролизу эндонуклеазой рестрикции EcoRI для линеаризации. Полученные линейные стандарты разводили до концентрации 107-101 копий плазмидной ДНК на мкл в стерильном буфере, содержащем 10 мМ TrisHCI рН7.6 и ДНК фага лямбда 5 нг на мкл. Концентрацию ДНК в полученных стандартах уточняли с использованием цифровой ПЦР на платформе QX100™ Droplet Digital™ PCR System (BioRad, Hercules, CA) согласно инструкциям производителя. Образцы стандартных образцов 8 мкл смешивали с 2Х ПЦР смесью и праймерами и зондами. Капли формировали с помощью Droplet Generator (DG) используя 70 μΙ_ DG Oil на лунку картриджа DG8 и 20 μΙ_ полной PCR смеси. Полученные капли (40 μΙ_) переносили в 96-луночный ПЦР планшет, запечатывали и проводили ПЦР. Далее флуоресцентный сигнал, генерируемый в процессе гидролиза Taqman проб в каплях был считан с помощью Droplet Reader, концентрация молекул TREC, KREC и IL17RA была определена с помощью математического обеспечения QuantaSoft. Концентрация полученных стандартных образцов было скорректирована с учетом данных цифровой ПЦР.
Пример 2. Аналитическая характеризация разработанной системы для количественного анализа TREC и KREC.
Для проверки специфичности использовались ДНК клеточных линий нелимфоидного происхождения, несущих неперестроенные Т и В клеточные рецепторы, а именно - НЕК293, HeLa, Н460, а также образцы ДНК из мочи и слюны. По результатам проведенного тестирования специфичность составила 100% .
Линейный диапазон количественного определений копийности TREC, KREC и
IL17RA определялся с помощью ПЦР на разведениях стандартных плазмид от 109 коп/мл до 103 коп/мл, при этом обращалось внимание на коэффициент R2 и разброс значений Ct для повторов. Было показано, что в области концентраций от 109 коп/мл до 5x104 коп/мл для всех трех мишеней наблюдается линейный диапазон изменения Ct от концентрации с коэффициентом корреляции R2 не хуже 0.98. Наименьшее количество копий, надежно детектируемых в одной ПЦР реакции объемом 25 мкл было. 10 для TREC, 5 для KREC и 5 для IL17RA.
Пример 3. Определение референсных значений для TREC и KREC в зависимости от возраста
Определение референсных значений для TREC и KREC в зависимости от возраста осуществляется на основе анализа ДНК представительной выборки соответствующей возрастной группы (50-60 чел.) людей одного поколения, имеющих нормальные иммунологические параметры, с использованием известных методов и оборудования. В качестве примера определения референсных значений для TREC и KREC в зависимости от возраста ниже приведены данные для детей возраста 0-17 лет, для получения которых использовали ДНК группы 56 здоровых (29 мальчиков и 27 девочек) с нормальными иммунологическими параметрами (Таблица 1). Для определения референсных значений для TREC и KREC у взрослых были использованы те же клинико-лабораторные и статистические подходы, что и у детей.
Полученные референсные значения приведены в Таблицах 2 и 3.
Таблица 1. Описание иммунологических параметров детей, выбранных для определения референсных значений TREC И KREC.
характеристика значения
1 Возраст детей 0-17 лет
2 CD3+ 58-60%
1300-4800 кл/мкп
3 CD4+ 31-54% 700-3500 кл/мкл
4 CD8+ 16-38%
500-1040 кл/мкл
5 CD19 16-27%
400-1600 кл/мкл
Таблица 2. Возрастные нормы TREC на 10 клеток лейкоцитов.
Figure imgf000013_0001
Таблица 3. Возрастные нормы KREC на 10 клеток лейкоцитов.
Figure imgf000013_0002
Пример 4. Клинические примеры
Пациент N& 1
Мальчик 4-х месяцев с диагнозом двусторонняя аспирационная пневмония, врождённый порок сердца (тетрада Фалло), состояние после наложения подключично- легочного анастамоза слева, ларингомаляция, хронический микроаспирационный синдром, недостаточность питания смешанного генеза, последствия перинатального поражения ЦНС. Концентрация TREC - на момент обследования показатели 4,04x1 О*4 копий, концентрация KREC 1 ,38x104 копий. Дальнейшая оценка состояния иммунной системы методом проточной цитометрии свидетельствует о течении иммунодефицита, связанного с другими уточнёнными значительными дефектами.
Пациент Ns 2
Девочка 17 лет. Концентрация TREC 1 ,04χ104 копий, концентрация KREC - на момент обследования показатели 3,18x1 О*2. Дальнейшие исследования иммунной системы методом проточной цитометрии свидетельствуют о снижении выхода в периферическую кровь зрелых В-лимфоцитов. Диагноз после генетического исследования: общая вариабельная иммунодефицитная недостаточность (ОВИН). Пациент Ns 3
Мальчик, 1 месяц. Концентрация TREC в крови из полости сердца 1 ,81x10*3 копий, концентрация KREC в крови из полости сердца 1 ,89x10*2 копий, что указывает на высокую вероятность прижизненного течения тяжелого комбинированного иммунодефицита с низким содержанием Т- и В- клеток. Посмертный диагноз после генетического исследования: тяжёлый комбинированный иммунный дефицит с низким содержанием Т- и В- клеток.
Пациент Ns 4
Мужчина 36 лет, носитель ВИЧ с возраста 30 лет. Последние несколько месяцев состояние здоровья резко ухудшилось, самочувствие страдает. Показатели общего анализа крови в пределах возрастных норм. Концентрация TREC в крови на момент обследования составляет 4,11 *101 копий, концентрация KREC 2,33х103 копий. Дальнейшее обследование методом проточной цитометрии показало крайне низкое содержание субпопуляции Т-хелперов, что, в свою очередь, требует незамедлительного проведения антиретровирусной терапии.
Использование группы изобретений позволяет повысить достоверность диагностики состояния иммунной системы пациента, уменьшить ошибки определения концентрации молекул TREC и KREC, особенно в области низких значений, а также уменьшить количество необходимых для анализа реакций за счет мультиплексирования.

Claims

Формула изобретения
1. Способ диагностики состояния иммунной системы пациента на основе оценки количества наивных Т и В клеток, при котором выделяют ДНК из анализируемого образца крови, затем производят одновременную амплификацию участков молекул ДНК TREC, KREC и нормировочного локуса, постоянно присутствующего в единичном экземпляре в каждом цикле амплификации, осуществляемой с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), проводимой в общей емкости при одинаковых условиях для всех амплифицируемых молекул и с участием олигонуклеотидных флуоресцентно меченых зондов, несущих на 5'-конце флуорофоры и на З'-конце не флуоресцентный тушитель, комплементарных центральной части амплифицируемых фрагментов, регистрируют полученные результаты посредством гибридизационно-флуоресцентной детекции, определяют в режиме реального времени абсолютное количество молекул TREC, KREC и нормировочного локуса в анализируемом образце ДНК с помощью калибровочных кривых, построенных при амплификации стандартных образцов ДНК, взятых не менее чем в 4-х последовательно убывающих десятикратных разведениях известных концентраций, и по результатам оценки их количества производят диагностику состояния иммунной системы пациента.
2. Способ по п.1 , отличающийся тем, что стандартный образец ДНК представляет собой рекомбинантную плазмиду, несущую последовательность амплифицируемого фрагмента ДНК, точная концентрация которой измерена с помощью цифровой ПЦР с соответствующими праймерами и олигонуклеотидными пробами.
3. Способ по п.1 , отличающийся тем, что в качестве нормировочного локуса используют ген IL17RA.
4. Способ по п.1 , отличающийся тем, что количество копий молекул ДНК TREC, KREC рассчитывается на 105 ядер содержащих клеток лейкоцитов с учетом внутреннего контроля, осуществляемого нормировочным локусом IL17RA, по формулам:
количество TREC = (количество копий TREC /количество копий IL17RA)*200000; количество ^ЕС=(количество копий KREC/количество копий IL17RA)*200000.
5. Способ по п.1 , отличающийся тем, что аналитическая чувствительность ПЦР в режиме реального времени составляет не менее 7 молекул ДНК TREC, KREC или IL17RA в реакции.
6. Набор праймеров, зондов и стандартных образцов для оценки количества ДНК молекул TREC, KREC и количества геном эквивалентов ДНК, включающий:
олигонуклеотидные праймеры и пробы для амплификации при помощи одной triplex-ПЦР в реальном времени молекул ДНК TREC, KREC и IL 7RA, соответственно, TREC2fo 5'-GTGATGCCACATCCCTTTCAA-3'
TREC2re 5 -ACGGTGAATGAAGAGCAGACA-3'
TRECp2 5'-FAMCTCTGGTTTTTGTAAAGGTGCC-BHQ-3' KREC3 5 -GTTCTCTTTCCCTTAGTGGCA-3'
KREC4P 5'-R6G-CCAGCTCTTACCCTAGAGTTTCTG-BHQ-3'
KREC4 5 -CTGGGTGGGACTCCAGGA-3'
IL17RA-U 5'-CTTGATGCTCTCGCTCTTCG-3'
IL17RA-R 5'-TGTAGCCCTGGTCAGACTG-3'
и набор стандартных плазмидных ДНК образцов для TREC, KREC и IL17RA с концентраций 104, 103,Ю2, 5 копий на мл.
PCT/RU2016/000514 2015-08-06 2016-08-05 Способ диагностики иммунной системы и набор для оценки днк молекул trec, krec и количество геном эквивалентов днк WO2017023194A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015132823 2015-08-06
RU2015132823/15A RU2587540C1 (ru) 2015-08-06 2015-08-06 Способ диагностики состояния иммунной системы пациента и набор праймеров, зондов и стандартных образцов для количественной оценки днк молекул trec, krec и количества геном эквивалентов днк

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2017023194A1 true WO2017023194A1 (ru) 2017-02-09

Family

ID=56132227

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2016/000514 WO2017023194A1 (ru) 2015-08-06 2016-08-05 Способ диагностики иммунной системы и набор для оценки днк молекул trec, krec и количество геном эквивалентов днк

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2587540C1 (ru)
WO (1) WO2017023194A1 (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108913770A (zh) * 2018-07-31 2018-11-30 朱智 一种利用数字PCR技术的新生儿TRECs和KRECs基因拷贝数检测试剂盒及其应用
CN108977529A (zh) * 2018-07-31 2018-12-11 朱智 一种利用数字PCR技术的新生儿TRECs和KRECs基因拷贝数检测试剂盒及其应用

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2645089C1 (ru) * 2017-01-09 2018-02-15 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт иммунологии и физиологии Уральского отделения РАН Способ экстракции днк, пригодной для проведения количественной пцр в реальном времени, из сухих пятен крови новорожденных
RU2699189C1 (ru) * 2018-05-07 2019-09-03 Общество с ограниченной ответственностью "НуклеоГен" Набор олигонуклеотидных праймеров и зондов и способ количественного выявления кокковой микрофлоры методом LAMP
RU2756979C2 (ru) * 2019-12-17 2021-10-07 Федеральное бюджетное учреждение науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера) Способ лабораторной персонифицированной диагностики состояния иммунитета новорожденных и набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченных зондов

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013059725A1 (en) * 2011-10-21 2013-04-25 Adaptive Biotechnologies Corporation Quantification of adaptive immune cell genomes in a complex mixture of cells

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1849877A1 (en) * 2006-04-24 2007-10-31 Erasmus University Medical Center Rotterdam Replicative history of T-and B-cell subsets
RU2522801C2 (ru) * 2012-09-27 2014-07-20 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт клинической иммунологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИКИ" СО РАМН) Способ определения уровня транскрипции гена, кодирующего хемокин ccl2 (мср-1) человека и набор для его осуществления

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013059725A1 (en) * 2011-10-21 2013-04-25 Adaptive Biotechnologies Corporation Quantification of adaptive immune cell genomes in a complex mixture of cells

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GORDUKOVA M.A. ET AL.: "Razrabotka nabora reagentov dlia kolichestvennogo opredeleniia molekul DNK TREC i KREC v tselnoi krovi i sukhikh piatnakh krovi metodom multipleksnoi PTSR v rezhime realnogo vremeni", MEDITSINSKAIA IMMUNOLOGIIA, vol. 17, no. 5, September 2015 (2015-09-01), pages 467 - 478 *
SOTTINI A. ET AL.: "Simultaneous quantification of recent thymic T- cell and bone marrow V - cell emigrants in patients with primary immunodeficiency undergone to stem cell transplantation''.", CLINICAL IMMUNOLOGY, vol. 136, no. 2, 2010, pages 217 - 227, XP027122936 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108913770A (zh) * 2018-07-31 2018-11-30 朱智 一种利用数字PCR技术的新生儿TRECs和KRECs基因拷贝数检测试剂盒及其应用
CN108977529A (zh) * 2018-07-31 2018-12-11 朱智 一种利用数字PCR技术的新生儿TRECs和KRECs基因拷贝数检测试剂盒及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
RU2587540C1 (ru) 2016-06-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6235504B1 (en) Methods for identifying genomic equivalent markers and their use in quantitating cells and polynucleotide sequences therein
WO2017023194A1 (ru) Способ диагностики иммунной системы и набор для оценки днк молекул trec, krec и количество геном эквивалентов днк
KR20160004265A (ko) 무세포 dna를 이용하는 신장 상태의 평가를 위한 방법 및 조성물
AU2021290268A1 (en) Immunorepertoire normality assessment method and its use
AU2015204569A1 (en) Methods for defining and predicting immune response to allograft
JP2018511339A (ja) ニューモシスチス肺炎を診断、予測又はモニタリングするための手段
JP2017184642A (ja) 認知症マーカー、それを用いた認知症の評価方法、評価試薬および評価キット
KR20190031072A (ko) 리포칼린-2를 이용한 혈관성 치매의 진단방법
CN111286559B (zh) 检测非洲猪瘟病毒的引物、探针及试剂盒
JPWO2003014395A1 (ja) 気管支喘息の検査方法
KR20210107719A (ko) 자궁내막증과 연관된 미토콘드리아 dna 결실
CN108977529A (zh) 一种利用数字PCR技术的新生儿TRECs和KRECs基因拷贝数检测试剂盒及其应用
WO2020218499A1 (ja) 胎児ＲｈＤ血液型検出用のキット及びその利用
CN108699608A (zh) 用于预测和诊断人巨细胞病毒(hCMV)先天性传播的方法和试剂盒
Illanes et al. Detection of cell‐free fetal DNA in maternal urine
WO2014124253A2 (en) Methods and compositions for assessment of fetal lung maturity
KR20120140069A (ko) 단순포진 바이러스 1형 및 2형의 진단을 위한 프라이머 및 프로브, 이를 이용한 검사 방법 및 이를 포함하는 검사 키트
CN107190074B (zh) hsa_circRNA_103127在唐氏综合征的诊断、治疗及预后中的应用
CN107190073B (zh) hsa_circRNA_104907在唐氏综合征的诊断、治疗及预后中的应用
RU2756979C2 (ru) Способ лабораторной персонифицированной диагностики состояния иммунитета новорожденных и набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченных зондов
KR101352470B1 (ko) 인간 백혈구 항원 ｂ２７과 ｂ５１ 유전자형 진단을 위한 프라이머 및 프로브, 이를 이용한 검사 방법 및 이를 포함하는 검사 키트
RU2786211C1 (ru) Способ лабораторной персонифицированной диагностики состояния иммунитета пациентов и набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров, и флуоресцентно меченых зондов, и стандартных образцов
RU2779085C1 (ru) Способ выявления предрасположенности к развитию метаболического синдрома в виде ожирения у школьников 7-10 лет
CN114410767B (zh) Cmv与prdm9转座子融合作为先天性巨结肠早期诊断标志物及其应用
RU2719411C1 (ru) Способ определения предрасположенности к нарушению репродуктивной функции у женщин в условиях избыточной контаминации фенолом

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 16833400

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

32PN Ep: public notification in the ep bulletin as address of the adressee cannot be established

Free format text: NOTING OF LOSS OF RIGHTS PURSUANT TO RULE 112(1) EPC (EPO FORM 1205A DATED 17/07/2018)

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 16833400

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1