KR101352470B1

KR101352470B1 - 인간 백혈구 항원 ｂ２７과 ｂ５１ 유전자형 진단을 위한 프라이머 및 프로브, 이를 이용한 검사 방법 및 이를 포함하는 검사 키트

Info

Publication number: KR101352470B1
Application number: KR1020110049595A
Authority: KR
Inventors: 정운원; 김현숙
Original assignee: 김현숙; 정운원
Priority date: 2011-05-25
Filing date: 2011-05-25
Publication date: 2014-01-16
Also published as: KR20120131435A

Abstract

본 발명은 HLA B27 또는 B51 유전자형의 증폭에 사용되는 프라이머 또는 프로브, 이를 이용한 HLA B27 또는 B51 유전자형의 검사 방법, 및 이를 포함하는 B27 또는 B51 유전자형 검사용 키트에 대한 것이다. 본 발명은 HLA B27과 B51 유전자형을 각각 그리고 동시에 분석할 수 있고 높은 민감도(sensitivity)와 특이도(specificity)를 가지고 검사할 수 있는 장점이 있다.

Description

인간 백혈구 항원 Ｂ２７과 Ｂ５１ 유전자형 진단을 위한 프라이머 및 프로브, 이를 이용한 검사 방법 및 이를 포함하는 검사 키트{PRIMEMRS AND PROBES FOR ANALYSING HLA B27/B51 GENOTYPES, ANALYSIS METHODS USING THE SAME, AND ANALYSIS KIT COMPRISING THE SAME}

본 발명은 인간 백혈구 항원(HLA) B27과 B51 유전자형 진단을 위한 프라이머 및 프로브, 이를 이용한 검사 방법 및 이를 포함하는 검사 키트에 관한 것이다.

인간 염색체 6번 단완에 존재하는 주 조직적합성 복합체(Major Histocompatibility Complex, MHC) 유전자에서 생성되는 인간 백혈구 항원(Human Leukocyte Antigen, HLA)은 세포표면에 발현되는 세포막 당단백 분자로 많은 다형성이 존재하고 그 특성에 따라 일반적으로 클래스 I, 클래스 II 및 클래스 III로 나뉜다. 클래스 I은 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C로 나뉘고 모든 조직의 유핵세포 표면에 존재하며, 클래스 II는 HLA-DR, HLA-DQd 및 HLA-DP로 나뉘고 항원제시세포인 B-림프구, 대식세포, T림프구 등의 표면에 존재하며, 클래스 III는 보체나 각종 사이토카인과 관련된 유전자를 포함하고 있다. 이러한 HLA는 면역과 관련된 염증이나 조직이식분야에서 그 역할이 가장 잘 규명되어 있지만 일부 HLA는 그 종류에 따라 류마티스 관절염 등의 자가면역질환, 만성간염, 피부염, 사구체신염 등의 특정 질환과 높은 연관성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다.

그 중 HLA-B27은 강직성 척추염(ankylosing spondylitis)에서 높은 연관성을 보이며 그 외에도 포도막염, 건선, 아밀로이드증, 대동맥염, 혈액암 등과 연관되어 있다. 강직성 척추염은 인대부위 염증으로 시작하며 척추 주변의 근육을 강하게 수축시켜 통증을 유발하며 염증이 사라져도 염증으로 인해 파괴된 연골이나 관절이 육아조직으로 변하고 다시 석회화되면서 뼈와 뼈가 붙어 운동성을 잃게 된다. 일반적으로 남성이 우위를 보이나 남녀에게 모두 나타나며 10대 후반에서 50대에 척추관절병증(spondyloarthropathy)을 일으키는 척추와 천장골 관절을 침범하는 전신성 염증성 질환이며 일부에서는 심장과 장피부에도 염증을 일으킨다. HLA-B27을 갖는 경우 직계가족 중 강직성 척추염 환자가 있다면 발병 위험도가 3배 정도 증가하며 일반인에게는 8% 정도 양성으로 나타나나 강직성 척추염 환자에서는 90% 이상 양성을 나타낸다고 알려져 있다(Khan MA, et al., Autoimmun . Rev., 2007; 6:183-9).

강직성 척추염을 일으키는 특별한 원인은 알려지지 않았지만, 1973년 강직성 척추염과 HLA-B27 간에 강한 연관성이 있음이 발견된 이후로 HLA-B27은 요통 환자에 있어서 감별 진단을 위해 임상적으로 많이 사용되고 있으며 라이터 관절염(Reiter’s arthritis), 전포도막염, 감염후 관절염 등과도 밀접한 연관성을 보여 관련 질환의 진단 및 연구 목적으로 사용되고 있다. EMBL-EBL(European Bioinformatics Institute)에 따르면, HLA-B27은 현재까지 65종(B*2701-B*2765)의 대립 유전자가 주로 엑손2와 엑손3 부위에 위치한 핵산 염기서열의 차이로 인해 다양성이 존재하는 것으로 밝혀져 있다. 이러한 아형의 분포는 민족적 차이를 보이고 또한 강직성 척추염 등의 질병 감수성도 차이를 보이며, 한국인에 있어서 김 등의 보고에 의하면 HLA-B27의 항원빈도와 유전자 빈도는 각각 6.3%, 3.2%로 알려져 있다(Kim HS et al., Korean J. Clin . Pathol ., 1997;17:1109-23). 또한 일부 연구에서 요도염이나 장염후 강직성 척추염과 유사한 라이터 증후군이 나타나며 이들 중 일부는 강직성 척추염으로 진행하여 특정한 균과 관련이 있었고 폐렴막대균(klebsiella pneumoniae)과 같은 장내세균에 노출되었을 때 혈액 내의 항체 수치가 상승됨을 보여 강직성 척추염이 특정한 장내세균에 노출되는 것과 관련하여 자신의 조직에 대해 비정상적인 자가면역반응을 일으키는 베체트병(Behcet’s Disease)과도 연관이 있음을 보고하고 있다(Konno Y, et al., Invest . Ophthalmol . Vis. Sci ., 1999;40:1838-44; Taurog JD, et al., J. Exp . Med ., 1994;180:2359-64).

베체트병은 히포크라테스에 의해 구강 및 외음부 궤양을 동반한 포도막염이 기술된 후 1937년 터키의 피부과 의사인 훌루시 베체트에 의해 알려진 질환으로서 만성적으로 여러 장기를 침범하는 원인불명의 반복적인 염증 반응을 특징으로 하는 질환이다. 재발성 구강 및 외음부 궤양, 포도막염의 3대 증상군으로 처음 기술되었으나, 현재는 3대 증상 외에 관절, 중추신경계, 심맥관계, 비뇨기계 및 소화기계를 침범하는 증후군으로 알려져 있다(Kaklamani VG, et al., Semin . Arthritis Rheum ., 1998;27:197-215).

베체트병은 전 세계적인 질환의 분포도를 보이나 지역적 차이가 있어 지중해 연안지역, 중동지역 및 극동지역에서 높은 발생율을 보이는데 중동 지역에서 질병의 유병률이 가장 높아 만 명당 1명이 발생하는 것으로 추정되고 있으며, 터키에서는 인구 만 명 당 8-42명의 환자가 보고되고 있고, 일본에서는 전국적인 역학조사를 통해 인구 만 명당 1-2명으로 보고되고 있다. 서양의 경우 미국은 인구 만 명당 0.012-0.033명, 영국에서는 만 명당 0.064명에서 발생하는 것으로 알려져 있다(Akpolat T, et al., Eur . J. Med ., 1992;1:391-5; Lovisetto P, et al.. Minerva . Med ., 1984;75:2263-82).

한국에서는 대규모의 역학조사가 이뤄지지 않아 유병률은 아직 보고가 없는데 류마티스 내과에 내원한 환자수를 보면 만 명당 5-10명 정도라 추정할 수 있다. 또한 한국에서 발생하는 베체트병 환자는 중동 지역에서 발생하는 환자의 임상적 특징과 차이가 있다. 질병이 30대 초반에 발병하고, 여자가 남자보다 1.5-2 배 정도 많다. 또한 페설지 반응은 30-40% 가량에서 양성이며, 위장관 궤양의 발생빈도가 15-20% 정도로 비교적 흔하지만 안구나 중요한 혈관을 침범하는 환자는 적은 것으로 알려져 있다(Chang, HK, et al., J. Korean Med . Sci ., 2002;17:371-74). 베체트병의 정확한 발병 원인이나 기전은 밝혀지지 않았으나 오래 전부터 유전적인 소인이 있는 환자에서 환경적인 요인이 가세하여 면역 반응을 활성화시켰고 결과적으로 여러 임상 증상이 유발된다고 추정되고 있다. 바이러스설, 연쇄상 구균의 항원에 대한 알러지설, 구리나 유기인제 등에 의한 중독설, 면역기전설 등이 보고되고 있으며, 최근 특정한 HLA 항원이 여러 다른 유전적 영향이나 환경적 요인과 결합하여 질병의 발현에 중요한 역할을 한다고 보고되고 있다.

즉, 6번 염색체의 단완에 위치하는 주조직적합 복합체뿐 만 아니라, 다른 염색체에 위치하는 비-MHC 유전자인 내피 이산화질소 합성효소(eNOS), 인터루킨-18(IL-18), 용질 운반체 11A1(SLC11A1), 세포내 유착 분자-1(ICAM-1), 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 등의 유전자 다형성이 베체트병 발생에 기여한다고 보고되고 있다(Park SB, et al., J. Kor . Chem . Soci ., 2007;51:536-72). 많은 연구에서 HLA-B51은 현재까지 베체트병과 가장 연관성이 있다고 알려져 있는 유전인자이며 HLA-B51과 베체트 병의 연관성이 여러 인종에서 보고된 바 있어 HLA-B51 대립유전자를 가지고 있다는 것이 반드시 베체트병을 발병한다는 의미는 아니나 베체트병에 걸릴 가능성이 높다는 것을 의미한다. HLA-B51은 EMBL-EBL(European Bioinformatics Institute)에 따르면 현재까지 95종(B*5101-B*5195)의 대립 유전자가 있으며 우리나라의 경우 베체트병 환자의 약 50%가 HLA-B51 양성이다.

HLA 아형별 판정에는 크게 혈청학적 검사법과 분자유전학적 검사법의 두 가지 방법이 이용되어왔다. 전통적으로 널리 사용되어온 혈청학적 검사법으로는 미량독성림프구법, 유세포 분석법, ELISA를 이용한 수용성 항원 검출법 등을 들 수 있으나, 세포표면 HLA 항원의 표현량, 분리된 림프구의 순도 및 활성도에 대한 의존도가 높아서 장기간의 혈액투석을 받은 신이식 대기환자나 항암 화학요법을 받은 골수이식 기환자에서는 결과에 영향을 줄 수 있고 교차반응과 모노클로날 항체의 부재로 아형의 구별이 어려운 단점이 있다. 분자유전학적 검사법으로는 PCR-서열 특이적 프라이머(SSP), PCR-서열 특이적 올리고뉴클레오타이드(SSO)와 함께 PCR-단일 가닥 구조 다형성(SSCP), PCR 제한효소 단편 길이 다형성(RFLP), 직접염기서열분석법(direct sequencing) 등의 방법을 들 수 있다. 전세계적으로는 PCR-SSP와 PCR-SSO 방법이 가장 널리 이용되고 있으며, 국내에서는 PCR-SSO 방법의 상품화된 키트가 가장 많이 이용되고 있다. 유전자 검사법은 혈청학적 방법에 비해 일반적으로 오류가 낮고 해상도가 높다는 장점을 갖고 있다. HLA 클래스 II(DR, DQ)에 대한 유전자형별 검사는 매우 보편화되어 쓰이고 있으나 이에 비해 클래스 I(A, B, C)에 대한 유전자형별 검사는 덜 보편화되어 있고 아직까지도 혈청검사법이 비교적 널리 이용되고 있다. 그러나 최근엔 HLA-A, B형별 판정시 혈청학적 검사법의 높은 오류와 함께 유전자 검사법의 우수성이 보고되고 있다. 국내에서도 상품화된 HLA 유전자 아형 검사키트의 보급이 확대됨에 따라 HLA-DR 뿐 아니라 HLA-A, B형별 진단에도 유전자 검사법의 이용이 점차 늘고 있다.

HLA-B27과 HLA-B51의 진단에 있어서도 미량독성림프구법, 유세포 분석법, ELISA를 이용한 수용성 항원 검출법과 분자생물학적 방법인 유전자 증폭법(polymerase chain reaction, PCR) 등이 사용되고 있으며, 그 중에서도 혈청학적 방법으로 테라사키(Terasaki) 등이 개발한 미량독성 림프구법(MCT) 및 최근 유세포분석기(flow cytometry, FCM)를 이용한 방법이 많이 사용하고 있다. 그러나 이러한 혈청학적 방법은 살아있는 세포를 요구하며 특히 HLA-B7 교차반응군 B7(Cross-reactive group; CREG: B7,B27, B22(55+56), B42, B40(60+61))에 대한 교차반응을 보여 이로 인한 임상적 오류를 범할 소지가 있다. 나아가 미량독성림프구법은 재현성이 좋고 특별한 장비를 필요로 하지 않으나 시간이 약 3시간 정도 걸리고 판독이 주관적인 단점이 있으며, 유세포분석기를 이용하는 방법은 결과 판정이 상대적으로 객관적이고 검사과정이 간단하며 신속하다는 장점이 있지만 세포에 HLA-B27 항원이 적게 표현되는 경우 또는 항원의 마스킹에 의한 위음성의 단점이 있고 상기한 대로 HLA-B27 검사법들은 타항원에 대한 교차반응으로 인해 위양성 결과를 보일 수 있는 단점이 있다.

분자생물학적 방법인 PCR은 HLA-B27과 HLA-B51 대립인자와 아형을 결정할 수 있는 장점이 있고 높은 민감도를 보이고 항원결정기(Epitope) 변형에 의한 혈청학적 방법에서의 HLA 아형구분에 있어 위음성 또는 위양성을 제거할 수 있는 방법으로 알려져 있다. 이러한 PCR은 대용량의 검체적용이 가능하고 수시간 내에 결과를 낼 수 있으며 유전자 형태로 검체를 보존할 수 있고 검사당 단가가 저렴하고 또한 유세포분석시 경계치(cut-off) 부근의 결과 등 판정이 어려울 때에도 도움을 줄 수 있다. 하지만, PCR 수행 후, 증폭 산물을 아가로즈 겔에서 전기영동 및 에티디움 브로마이드(Ethidium bromide, EtBr)로 염색한 후, 이미지 분석기로 밴드의 강도를 분석하여야 하기 때문에, 많은 시간과 인력이 소요되며 결과 분석도 주관적이어서 정확한 결과를 얻기 어렵다는 문제점이 있다.

또한, HLA-B27과 HLA-B51을 동시에 검사하기 위해서는 두 검사법의 조건이 동일해야 하는데, 이 경우 어느 한쪽의 조건이 맞지 않는 경우가 많아 조건 확보에 많은 시간이 소요되는 문제가 있다. 나아가, 서로 간에 교차 반응성이 있어서 HLA-B27과 HLA-B51을 구별하여 검출하는 것이 쉽지 않으며, 특히 HLA처럼 극히 일부의 염기서열만이 다른 경우 조건을 만족시키기 어려운 단점이 있다.

따라서, 기존의 방법보다 진단에 시간과 인력을 적게 필요하면서도 정량적 측정이 가능한 검사 방법의 필요성이 대두되고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 PCR에 비해 보다 간편하게 HLA B27 및 B51 유전자를 측정하고자 노력한 결과, 특이적인 프로브를 사용하는 실시간 중합효소 연쇄반응법(RT-PCR)을 통해 HLA B27과 B51 유전자형을 각각 그리고 동시에 정량적으로 진단할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 RT-PCR에 사용될 수 있는, HLA B27 또는 B51 유전자형을 증폭시킬 수 있는 프라이머와 프로브를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 또는 프로브를 이용하여 HLA B27 또는 B51 유전자형을 검사하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 또는 프로브를 포함하는 RT-PCR을 위한 HLA B27 및 B51 유전자형 검사 키트를 제공하기 위한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 염기서열을 갖는, HLA B27 또는 B51 유전자형을 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브를 제공한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 혈액으로부터 DNA를 추출하는 단계; 및 상기 추출된 DNA를 상기 프라이머 또는 프로브를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응법(RT-PCR)으로 증폭하는 단계를 포함하는 HLA B27 또는 B51 유전자형의 검사 방법을 제공한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 프라이머 또는 프로브를 포함하는 HLA B27 또는 B51 유전자형을 진단할 수 있는 검사 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 프라이머 및 프로브 및 이를 포함하는 키트는 HLA B27 및 B51 유전자형을 정량적으로 검사할 수 있으며, 민감도 및 특이도(specificity)가 높은 장점이 있다. 또한, 검체로부터 HLA-B27 및 HLA-B51 유전자형을 각각 또는 동시에 약 1시간 이내에 확인할 수 있어, 짧은 시간 안에 검사할 수 있는 장점이 있다.

도 1은 본 발명의 HB 27 프라이머 세트를 이용한 실시간 유전자 증폭 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 HB 51 프라이머 세트를 이용한 실시간 유전자 증폭 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 HB 27 프라이머 세트와 HB 51 프라이머 세트를 동시에 이용한 실시간 유전자 증폭 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 HLA B27 및 B51 유전자형 표준물질의 염기서열 및 사용된 프라이머를 나타낸 것이다.
도 5는 HLA B27 및 B51 유전자형 표준물질에 대한 염기서열 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따라 제작된 HLA 유전자 검사 키트를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 프라이머인 HB 27 세트를 이용하여 실시간 유전자 증폭 후 HLA B27 유전자에 대한 염기서열 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에 따른 프라이머인 HB 51 세트를 이용하여 실시간 유전자 증폭 후 HLA B51 유전자에 대한 염기서열 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명에 따른 HLA B27/B51 진단키트와 A사의 HLA B27 진단키트를 이용하여 HLA 유전자형을 검사한 결과로서, 불일치하는 결과만을 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명에 따른 HLA B27/B51 진단키트와 B사의 HLA B51 진단키트를 이용하여 HLA 유전자형을 검사한 결과로서, 불일치하는 결과만을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 염기서열을 갖는, HLA B27 또는 B51 유전자형을 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브를 제공한다.

상기 본 발명의 프라이머 또는 프로브에서, 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 프라이머 또는 프로브는 HLA B27 유전자형을 증폭하는 것을 특징으로 하며, 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 프라이머 또는 프로브는 HLA B51 유전자형을 증폭할 수 있는 것을 특징으로 한다.

구체적으로, 상기 서열번호 1의 올리고뉴클레오타이드는 HLA B27을 증폭시키기 위한 정방향(forward) 프라이머로서, 상기 서열번호 2의 올리고뉴클레오타이드는 HLA B27을 증폭시키기 위한 역방향(reverse) 프라이머로서, 그리고 상기 서열번호 3의 올리고뉴클레오타이드는 HLA B27을 증폭을 검출할 수 있는 프로브로서 사용된다. 상기 서열번호 1 및 2의 프라이머와 서열번호 3의 프로브는 HLA B27을 검사하기 위한 실시간 PCR(RT-PCR)용 프라이머 및 프로브 세트('HB27세트’라 명명함)로 사용될 수 있다.

또한, 상기 서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드는 HLA B51을 증폭시키기 위한 정방향(forward) 프라이머로서, 상기 서열번호 5의 올리고뉴클레오타이드는 HLA B51을 증폭시키기 위한 역방향(reverse) 프라이머로서, 상기 서열번호 6의 올리고뉴클레오타이드는 HLA B51을 증폭을 검출할 수 있는 프로브로서 사용된다. 상기 서열번호 4 및 5의 프라이머와 서열번호 6의 프로브는 HLA B51을 검사하기 위한 실시간 PCR(RT-PCR)용 프라이머 및 프로브 세트('HB51세트'라 명명함)로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 서열 번호 3 또는 6의 염기서열을 갖는 프로브는 유전자 증폭 산물의 검출을 용이하게 하기 위하여 5' 말단에 리포터(reporter dye)로 작용하는 형광물질로 표지될 수 있으며, 이와는 별개로 3' 말단에는 소광물질(quencher dye)로 표지될 수 있다. 상기 5' 말단의 형광물질은 당해 기술 분야에서 사용되는 형광물질이라면 제한없이 사용될 수 있다. 형광물질의 구체적인 예로는 Sybergreen, Evagreen, Cy3, Cy5, 비오틴 결합물질, 알렉사 647(Alexa 647), 알렉사 555(Alexa 555), 5-(2-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌 황산(EDANS), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트(TMRITC), x-로다민, 텍사스레드 또는 록스(ROX)를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 3' 말단의 소광물질은 당해 기술 분야에서 사용되는 소광물질이라면 제한없이 사용될 수 있다. 소광물질의 구체적인 예로는 DABCYL, BHQ-0, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, Eclipse, QSY7 또는 QSY9를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 혈액으로부터 DNA를 추출하는 단계; 및 상기 추출된 DNA를 상기 프라이머 또는 프로브를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응법(RT-PCR)으로 증폭하는 단계를 포함하는 HLA B27 또는 B51 유전자형의 검사 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 검사 방법에서, 상기 제1단계는 혈액으로부터 DNA를 추출하는 단계이다. 상기 검체로서 혈액, 혈청 또는 혈액지(paper)를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 DNA 추출 방법은 당해 기술분야에 널리 알려져 있으며, 예를 들어 세포 용해 용액으로 세포를 용해한 후 통상적인 DNA 추출 방법으로 DNA를 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 검사 방법에서, 상기 제2단계는 상기 추출된 DNA를 전술한 본 발명에 따른 프라이머 또는 프로브를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응법(RT-PCR)으로 유전자를 증폭하는 단계이다. 상기 단계에서, HLA B27 유전자형을 검사하기 위해서는 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 프라이머 또는 프로브를 사용할 수 있으며, HLA B51 유전자형을 검사하기 위해서는 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 프라이머 또는 프로브를 사용할 수 있다. 나아가, HLA B27 및 HLA B51 유전자형을 동시에 검사하고자 하는 경우에는, 상기 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 프라이머 또는 프로브와 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 프라이머 또는 프로브를 조합하여 사용할 수 있다.

또한, 내부표준물질인 베타 글로빈을 증폭시키기 위한 프라이머 또는 프로브로서, 서열번호 7 내지 9 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 프라이머 또는 프로브'BG세트'라 명명함)를 본 발명에 따른 프라이머 또는 프로브와 동시에 사용할 수 있다.

본 발명의 상기 검사방법은, HLA B27 또는 B51 유전자형의 증폭을 실시간으로 정량화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이는 실시간 유전자 검사를 위한 공지의 방법이라면 어느 것이나 사용가능하다. 예를 들면, 실시간 중합효소 연쇄반응법(RT-PCR)을 통해 유전자 증폭시, 실시간으로 모니터링하여 얻게 되는 증폭 곡선으로부터 Ct 값(threshold cycle, PCR 증폭 산물이 일정량 증폭되었을 때의 사이클(cycle) 수를 말함)을 산출하고 이를 이용하여 유전자 증폭 산물 내에 목표하는 유전자의 존재유무나 증폭 산물을 정량하는 단계를 더 포함할 수 있다.

구체적으로, RT-PCR에서는 1사이클 반응이 추가될 때마다 DNA가 2배로 지수함수적으로 증가해 일정 이상의 사이클을 반복하면 목표하는 유전자의 양은 정체기(plateau)에 도달하게 되고, 이렇게 증폭한 유전자의 양을 실시간으로 모니터링하여 증폭 곡선을 얻을 수 있다. 초기의 DNA 주형농도가 많을수록 증폭 산물량은 빠르게 검출 가능한 양에 다다르게 되어 증폭 곡선이 가파르게 상승한다.

이러한 증폭곡선의 적당한 곳에 반응을 일으키는 최소의 역가(threshold)를 설정하면, 반응을 일으키는 최소의 역가와 증폭 곡선이 만나는 점, 즉, Ct 값이 산출된다. 이러한 Ct 값은 목표하는 유전자의 존재유무나 농도별 검량선을 작성될 경우 이를 통해 최초의 주형농도를 정량할 수 있다.

나아가, 본 발명은 전술한 프라이머 또는 프로브를 포함하는 HLA B27 또는 B51 유전자형을 진단할 수 있는 검사 키트를 제공한다.

상기 검사 키트는 서열번호 7 내지 9 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 프라이머 또는 프로브를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머 또는 프로브 외에도 통상적인 검사 키트에 사용되는 시약, 예를 들어, DNA 추출 시약, DNA 증폭 시약 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, HLA B27 또는 B51 유전자형을 각각 또는 동시에 진단할 수 있는 검사 키트(도 6 참고)는 다음과 같은 시약, 기구 및 장치로 구성될 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다:

1) 프라이머 및 프로브 세트 각 20p㏖/㎕;

2) 10X PCR 완충용액;

3) Taq. DNA 폴리머라아제 250 유니트(솔젠트, 한국);

4) 2.5 mM dNTP(dATP, dGTP, dCTP, dTTP);

5) 증류수; 및

6) 실시간 유전자 증폭분석장치(LC480, Roche 또는 7500, ABI 또는 RotergeneQ, Qiagen 또는 CFX86, Biorad).

상기 시약, 기구 및 장비들로 HLA B27과 B51 유전자형을 각각 또는 동시에 정량적으로 검사할 수 있다. 그리고 이를 바탕으로 하기와 같은 구성으로 HLA B27과 B51 유전자형을 각각 또는 동시에 정량적으로 검사할 수 있는 키트를 구성할 수 있다. 하기 내용은 본 발명의 일 실시예에 불과하며, 본 발명은 하기 예에 국한되지 않는다.

HLA B27과 B51 유전자형을 동시 진단하기 위한 키트:

1) HB27 세트, HB51 세트와 BG 세트 각각 프라이머 세트 (20 p㏖/㎕), 10X PCR 완충용액, dNTP(dATP, dGTP, dCTP, dTTP), Taq. 폴리머라제 250 유니트(솔젠트)이 들어 있는 프리믹스(premix)의 1.5㎖ 튜브;

2) HLA-B27 유전자와 HLA-B51 유전자가 각각 10ng/ul이 들어있는 양성대조용액의 1.5㎖ 튜브; 및

3) HLA-B27 유전자와 HLA-B51 유전자가 포함되지 않은 음성대조용액의 1.5㎖ 튜브.

상기 키트 중 HLA-B27 유전자와 HLA-B51 유전자를 각각 검사하는 경우에도 상기의 키트를 사용할 수 있으며 그 예로 HLA-B27만을 검사하는 경우 키트 1)항에서 HB51 세트를 제외하여 사용하며 HLA-B51만 검사하는 경우는 그 반대이다. 본 발명의 프라이머 또는 프로브와 키트를 이용하여 RT-PCR로 유전자를 증폭한 후 HLA B27 또는 B51 유전자형을 검사하는 데 대략 1시간이 소요된다.

이하에서는, 본 발명의 구성을 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예로만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: HLA B27 및 B51 유전자형에 특이적인 프라이머 및 프로브의 선정

HLA B27(65종, B*2701-B*2765)과 B51 유전자형(95종, B*5101-B*5195)의 염기서열을 NCBI Genebank와 EMBL-EBL(European Bioinformatics Institute)에서 검색하여 확보하였다. EMBL-EBL 얼라인먼트 프로그램을 이용하여 공통 염기서열 중 각각 돌연변이가 가장 적은 동일 서열을 갖는 프라이머와 프로브를 선정하였고, HLA B27과 B51 이외의 다른 아형의 HLA를 배제하였다. 그 결과 하기 표 1의 서열번호 1 내지 6의 프라이머 및 프로브가 선정되었고, 이를 올리고 합성기로 제작하였다(Polygen, 독일).

실시예 2: HLA B27과 B51 유전자 증폭을 통한 유전자형 분석

<2-1> 혈액으로부터 유전자 추출

혈액 100 ㎕와 TE 용액(10mM Tris-Cl, 1mM EDTA, pH 8.0) 1㎖를 혼합하고 마이크로원심기(microfuge, Sigma)에서 13,000 rpm으로 5분간 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 침전물에 7%(w/v) 킬렉스(chelex) 버퍼(12% chelex, 20 mM Tris HCl, 100 ㎍/ml proteinase K, 10 mM CaCl₂, pH 8.0) 100 ㎕를 1.5 ㎖ 튜브에 넣고 100℃의 항온조에서 20분간 반응시킨 후, 마이크로 원심분리기에서 13,000 rpm으로 4℃에서 10분간 원심분리하고, 상층액을 제거하여 DNA를 수득하였다. 상기 수득된 DNA를 새로운 1.5 ㎖ 튜브에 넣고 사용할 때까지 냉장 보관하였다.

<2-2> 실시간 유전자 증폭 방법을 이용한 HLA 유전자 증폭

상기 실시예 <2-1>에서 획득한 DNA를 증폭시키기 위해 실시예 1에서 제작한 HB 27 세트와 HB 51 세트를 각각 또는 동시에 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다. 대조군으로서 BG 세트(서열번호 7 내지 9)를 각 실험에 동시에 사용하였다.

HLA B27과 B51을 동시 분석하는 경우 실시간 PCR은 0.2 ㎖ PCR 튜브에 프리믹스 9.5 ㎕[10 × PCR 버퍼[750 mM Tris-HCl (pH 9.0), 150 mM (NH₄)₂SO₄, 25 mM MgCl₂, 1 mg/ml BSA], 2.5 mM dNTP 2.0 ㎕, 20 pmol HB 27 세트, 20 pmol HB 51 세트 및 20 pmol BG 세트, Taq DNA 폴리머라아제(5 units)(Solgent Co., 한국) 0.3 ㎕, 주형 DNA 5 ㎕를 증류수로 20.0 ㎕가 되게 하였다. 실시간 유전자 증폭을 위한 혼합물을 95℃에서 10분 동안 전변성(pre-denaturation)시키고 95℃에서 30초, 60℃에서 1분 동안 35회를 반응시켰다(GeneAmp PCR system 9700, Applied Biosystems, USA).

HLA B27과 B51을 각각 분석하는 경우 HB 27 세트와 HB 51 세트 각각과 BG 세트를 조합하여 사용하고 검사방법은 HLA B27과 B51을 동시 분석하는 경우와 동일하게 적용하였다.

도 1에 HB 27 세트를 이용하여 분석한 결과를, 도 2에 HB 51 세트를 이용하여 분석한 결과를, 그리고 도 3에 HB 27 세트와 HB 51 세트를 조합하여 분석한 결과를 나타내었다. 상기 결과들은 HB 27 세트, HB 51 세트와 BG 세트를 각각 또는 동시에 이용하여 유전자를 각각 또는 동시 증폭시 서로 간섭작용없이 분석할 수 있음을 보여준다.

실시예 3: HLA B27 또는 B51 유전자형 검사 키트의 제작

<3-1> HLA B27 및 B51 유전자 표준물질의 제작

HLA B27 또는 B51 유전자형 검사 키트에 대조군으로 사용되기 위한 HLA B27 및 B51 유전자 표준물질을 하기와 같이 제작하였다.

프로메가(Promega, Germany)사의 pGEMT 이지벡터를 이용하여 HLA B270502 유전자와 B510201 유전자의 엑손 2번 270bp 전체 유전자 부위를 유전자 증폭하여 그 증폭 산물을 클로닝하였다. 상기 HLA B27과 B51 유전자 서열 및 사용한 프라이머를 도 4에 나타내었다.

HLA B27과 B51 유전자의 표준 물질로 사용할 유전자 증폭물의 제작은 0.2 ㎖ PCR 튜브에 10 × PCR 버퍼[750 mM Tris-HCl (pH 9.0), 150 mM (NH₄)₂SO₄, 25 mM MgCl₂, 1 mg/ml BSA], 2.5㎕, 2.5 mM dNTP 2.0 ㎕, 20 pmol HLA-B27 5' 프라이머(GCTCCCACTCCATGAGGTAT; 서열번호 10)와 3' 프라이머(CGGCCTCGCTCTGGTTGTAGTA; 서열번호 11) 및 20 pmol HLA-B51 5' 프라이머(GCTGGGACTCCATGAGGTAT; 서열번호 12)와 3' 프라이머(CGGCCTCGCTCTGGTTGTAGTA; 서열번호 13) 각각 1.0 ㎕, Taq DNA 폴리머라아제(5 units)(솔젠트, 한국) 0.3 ㎕ 및 주형 DNA 5.0 ㎕를 넣고 증류수로 25.0 ㎕가 되게 하였다. 유전자 증폭을 위한 상기 혼합물을 95℃에서 10분 동안 전변성(pre-denaturation)하고 95℃에서 1분, 53℃에서 1분, 그리고 72℃에서 1분씩 40회를 반응시켰다(GeneAmp PCR system 9700, Applied Biosystems, USA).

상기 HLA B27 및 B51 유전자 증폭 산물을 겔 추출 키트(gel extraction kit, QIAGEN, Germany)를 사용하여 정제하고 정제한 유전자 증폭 산물 3.0 ㎕에 T₄리가아제 2 X 버퍼 5.0 ㎕, PGEM T 이지벡터 1.0 ㎕ 및 T₄ 리가아제 1.0 ㎕를 혼합하여 실온(25℃)에 2시간 반응시켜 연결(ligatioon)시켰다. 컴피턴트 세포(competent cell)인 JM109 50 ㎕와 연결반응(ligation)이 끝난 벡터 5 ㎕를 혼합한 다음, 얼음 위에서 30분간 방치하고 42℃에서 1분 30초 동안 열처리(heat shock)한 후, 얼음 위에서 3분간 반응시키고 나서, LB 배지(broth) 1 ml에 넣고 37℃에서 1 시간 동안 배양하였다.

그 다음, 800 G, 4℃에서 5분간 원심 분리한 후 상층액을 버리고 남아있는 LB 배지와 침전물을 섞어서 X-gal과 IPTG가 포함된 LB 아가 플레이트(LB agar plate, 앰피실린 20 mg/ml)에 도포하고 37℃에서 14 시간 동안 배양하였다. 배양된 각 콜로니(colony)를 앰피실린이 포함된 1 ml LB 배지에서 하루 동안 배양하고 플라스미드를 정제하였다(QIAGEN, Germany). 상기 정제한 플라스미드의 농도를 나노뷰(NanoVue, USA)에서 측정하고 염기서열 분석을 통해 HLA B27과 B51 유전자가 포함되어 있음을 확인하였다(도 5).

<3-2> 키트의 제작

도 6에 나타낸 바와 같이, 하기와 같은 구성으로 HLA B27 또는 B51 유전자형 검사 키트를 제작하였다. 그 구성은 ① 염기서열 1 내지 6에서 선택되는 HLA B27또는 B51 유전자형 프라이머 또는 프로브 및 염기서열 7 내지 9에서 선택되는 베타글로빈 유전자 프라이머 또는 프로브 각 20 pmol/㎕, ② 10X PCR 완충용액; ③ 2.5 mM dNTP(dATP, dGTP, dCTP, dTTP), ④ Taq. DNA 중합효소(솔젠트, 한국) 250 유니트가 포함된 혼합 용액이 담겨진 1.5 ml 튜브; ⑤ HLA-B27 유전자와 HLA-B51 유전자가 각각 10 ng/ul이 들어있는 양성대조용액의 1.5㎖ 튜브; ⑥ HLA-B27 유전자와 HLA-B51 유전자가 포함되지 않은 음성대조용액이 담겨진 1.5㎖ 튜브였다.

상기 HLA B27 또는 B51 유전자형 검사 키트는 50개의 검체를 처리할 수 있도록 구성하였으며, 사용할 때까지 -20℃ 냉동고에 보관하였다.

실시예 4: 본 발명에 따른 키트를 이용한 HLA B27 또는 B51 유전자형 분석 및 검증

상기 실시예 3에서 제작된 검사 키트의 유용성을 확인하기 위하여, 유전자형이 확인되어 있는 HLA 검체 250건 중 무작위로 선택한 25건의 검체와 HLA B27과 HLA B51 이외의 다른 유전자형 6건을 대상으로 본 발명의 키트를 이용하여 실시예 2에 기재된 과정와 동일하게 RT-PCR을 수행하여 검사한 다음, 상기 결과를 염기서열 분석과 비교하였다.

염기서열 분석은 HLA B27과 B51 유전자 증폭 산물 5 ㎕에 빅다이(Bigdye V3.0, ABI) 8 ㎕과 각 유전자의 5' 프라이머 1 ㎕(서열번호 1 및 3)를 포함하여 총 20 ㎕가 되게 하고, 상기 혼합물을 95℃에서 2분 동안 변성하고 95℃ 20초, 50℃ 5초, 60℃ 2분을 25회 실시한 다음, 자동 염기서열 분석기(ABI3100, Applied Biosystems, USA)를 통해 염기서열을 분석하였다.

도 7 및 8은 자동 염기서열분석기를 이용한 결과를 나타낸 것이다. 그 결과, 본 발명의 HLA B27과 B51 유전자 증폭 결과와 염기서열 분석 결과가 모두 일치함을 확인할 수 있었다. 또한, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 32개 검체의 유전자 증폭 결과와 염기서열 분석 결과가 모두 일치하는 것으로 나타났다.

따라서, 본 발명의 프라이머, 프로브 또는 이를 포함하는 키트는 HLA B27 또는 B51 유전자형을 정확하게 진단할 수 있을 것으로 판단된다.

실시예 5: 본 발명의 키트와 기존 HLA B27 및 B51 분석 키트와의 비교 실험

본 발명의 키트의 효율을 살펴보기 위해, 종래 시판 중인 키트와 비교실험하였다. 본 발명의 키트는 실시예 3에서 제작된 HLA B27 및 B51 유전자형을 동시에 검사할 수 있는 키트를 이용하였다. 한편, 기존 시판 중인 키트 중에 HLA B27과 HLA B51을 동시에 분석할 수 있는 키트가 개발되어 있지 않아 HLA B27과 HLA 51 각각을 진단 할 수 있는 2종의 키트를 사용하여 분석 비교하였다.

<5-1> 본 발명의 키트와 A사의 HLA B27 키트의 비교분석

HLA B27 유전자형에 대한 실시간 유전자 증폭을 이용한 A사와의 키트와 본 발명의 키트를 비교하기 위하여, HLA B27 유전자형 20건과 다른 유전자형 20건을 대상으로 본 발명의 키트의 경우 실시예 2-2의 방법에 따라 분석하였고, A사의 키트의 경우 제조사의 프로토콜에 따라 분석하였다. 분석 결과, 표 3에서와 같이, 본 발명의 키트는 20건 모두 양성의 결과를 보였으나 A사의 키트는 6건에서 음성의 결과를 보여, 본 발명의 키트는 100%, A사의 경우 70%의 민감도를 보였다. HLA B27이외의 다른 유전자형에 대한 비교분석에서, 본 발명의 키트는 100%의 특이도를 보인데 반해, A사의 키트는 80%의 특이도를 보였다. 본 발명의 키트와 A사의 키트의 비교분석에 있어서 결과가 불일치하는 검체의 유전자 증폭 결과를 도 9 에 나타내었다.

<5-2> 본 발명의 키트와 B사의 HLA B51 키트의 비교분석

HLA B51 유전자형에 대한 실시간 유전자 증폭을 이용한 B사와의 키트와 당 키트를 비교하기 위하여, HLA B51 유전자형 20건과 다른 유전자형 20건을 대상으로 본 발명의 키트의 경우 실시예 2-2의 방법에 따라 분석하였고, B사의 키트의 경우 제조사의 프로토콜에 따라 분석하였다. 분석 결과, 표 4에서와 같이, 본 발명의 키트는 20건 모두 양성의 결과를 보인데 반해, B사의 키트는 6건에서 음성의 결과를 보여, 당키트는 100%, A사의 경우 65%의 민감도를 나타내었다. HLA B51 이외의 다른 유전자형에 대한 비교분석에서, 본 발명의 키트는 100%의 특이도를 보인데 반해, B사의 키트는 70%의 특이도를 보였다. 본 발명의 키트와 B사의 키트의 비교분석에 있어서 결과가 불일치하는 검체의 유전자 증폭 결과를 도 10에 나타내었다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1 내지 3의 염기서열을 포함하며, HLA B27 유전자형의 특이적 증폭능을 갖는 프라이머 및 프로브를 포함하는 조성물.
제 1항에 있어서,
서열번호 4 내지 6 중 어느 하나의 염기서열을 추가로 포함하며, HLA B27 및 HLA B51 유전자형의 특이적 증폭능을 갖는 것을 특징으로 하는 프라이머 및 프로브를 포함하는 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
HLA B55, HLA B39 또는 HLA B37 유전자형의 증폭능은 갖지 않는 것을 특징으로 하는 프라이머 및 프로브를 포함하는 조성물.
혈액으로부터 DNA를 추출하는 단계; 및
상기 추출된 DNA를 제1항의 프라이머 및 프로브를 포함하는 조성물을 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응법(RT-PCR)으로 증폭하는 단계;
를 포함하는 HLA B27 유전자형의 검사 방법.
제4항에 있어서,
제1항의 프라이머 및 프로브를 포함하는 조성물 외에, 내부표준물질인 베타 글로빈을 증폭시킬 수 있는 서열번호 7 내지 9 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 프라이머 또는 프로브를 동시에 사용하는 것을 특징으로 하는 HLA B27 유전자형의 검사 방법.
제1항의 프라이머 및 프로브를 포함하는 조성물을 포함하는 HLA B27 유전자형을 진단할 수 있는 검사 키트.
제6항에 있어서, 상기 키트는 서열번호 7 내지 9 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 프라이머 또는 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 검사 키트.