CN110923307A

CN110923307A - 用于检测hla-b*27等位基因的试剂盒、组合物及方法

Info

Publication number: CN110923307A
Application number: CN201911273423.XA
Authority: CN
Inventors: 林锦骠; 汤纪丰; 欧启水; 林隽宇
Original assignee: First Affiliated Hospital of Fujian Medical University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Fujian Medical University
Priority date: 2019-12-12
Filing date: 2019-12-12
Publication date: 2020-03-27

Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种用于检测HLA‑B*27等位基因的试剂盒、组合物及方法。所述的试剂盒包含用于检测HLA‑B*27等位基因的探针以及引物对，可以特异性检测HLA‑B*27等位基因，且灵敏度高，重复性好。

Description

用于检测HLA-B*27等位基因的试剂盒、组合物及方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种用于检测HLA-B*27等位基因的试剂盒、组合物及方法。

背景技术

HLA-B*27是人类主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex，MHC)的表达产物，位于人类第6号染色体的短臂上。其在人类免疫系统中发挥着重要作用，参与免疫细胞之间的相互识别、抗原提呈、调节免疫应答等多种免疫学功能。根据HLA抗原的结构、功能与组织分布的不同，可分为三类：Ⅰ类分子包括HLA-A、-B、-C系列抗原，广泛分布于各组织有核细胞表面，包括血小板和网织红细胞；Ⅱ类分子为HLA-D/DR、-DP、DQ系列抗原，主要在表达于B细胞和抗原提呈细胞；Ⅲ类分子主要为补体成分。HLA-B*27属Ⅰ类抗原，具有高度多态性，其等位基因间的差异主要由编码蛋白质氨基酸的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)组成，其亚型分布呈区域和种族差异性，中国汉族主要以B*2704为主。

强直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis，AS)是一种以脊柱和骶髂关节及周围大关节附着炎症为主要临床表现的自身免疫性关节炎。AS可致患者出现永久性的关节功能丧失，病变甚至可累及心脏、肺部、眼部等器官，造成患者伤残并导致生活质量严重低下。目前，AS的早期诊断还依据1984年纽约修订的诊断标准^[1]，该标准要求AS诊断需要有肯定的关节炎表现并结合影像学检查进行确诊。但AS起病隐匿，早期可无任何临床表现，当存在明确的临床表现时疾病往往已进展至中期，已经造成了不可逆的关节损伤。因此，基于早期诊断基础之上的干预治疗对减少AS的致残率及提高患者的生活质量有着十分重要的意义。

早在1973年，人们就已发现HLA-B*27抗原的表达与AS具有高度相关性。据报道，在AS患者有超过90％的HLA-B*27抗原表达为阳性，普通人群中仅占5-10％。结合临床表现及影像学检查可极大地提高诊断AS的阳性预测值，降低误诊率，且HLA-B*27抗原阳性除了与AS有关外，还与其他如Reiter综合症、葡萄膜炎、溃疡性结肠炎等多种疾病发生相关，因此HLA-B*27抗原的检测在临床上具有很高的检验价值。

现阶段，临床上常用的HLA-B*27检测方法有流式细胞术法(flow cytometry，FCM)、基于聚合酶链式反应(polyrnerase Chain Reaction，PCR)发展而来的PCR-单链构象多态性(PCR-single-strand conformation polymorphism，PCR-SSCP)、PCR-直接碱基序列分析基因分型技术(PCR-sequence based genotyping，PCR-SBT)等等，传统的微量淋巴细胞毒实验因分型错误率高在临床上已停止使用。

FCM法采用HLA-B*27单克隆抗体直接结合免疫细胞HLA-B*27抗原，不仅能快速分离出淋巴细胞的亚群，还可计算HLA-B*27抗原阳性淋巴细胞的百分比，具有操作简便、特异性高、结果重复性好等优点，在临床上使用效果良好。但FCM也存在诸多局限，如对标本质量要求高；流式仪昂贵无法在基层医院普及；与HLA-B*07抗原存在交叉反应等诸多缺点，且FCM是基于HLA-B*27抗原蛋白表达的检测，与基因表达检测的结果并不一定总是一致^[2]。多种文献显示基于基因表达检测的PCR法具有更高的敏感度。

PCR法中，PCR-SBT检测最为准确，具有很高的灵敏度与特异度。但其检测条件要求高且检测周期长，测序的费用也较高；PCR-SSCP方法是一种经典的分析方法，但其需要通过电泳来检测，步骤繁琐、周期长、且存在潜在的污染环节多，临床上已较少使用；而基于SYBRgreen染料的荧光定量PCR法特异性不足且缺乏内控。

[1]van der Linden S；Valkenburg HA；Cats A.Evaluation of diagnosticcrite ria for ankylosing spondylitis.A proposal for modification of the NewYork crit eria[J].Arthritis and Rheumatism，1984，27(04):361-368.DOI:10.1002/art.1780270401.

[2]滕凤猛，高峰，余清，et al.流式细胞仪检测HLA-B27的性能评价及其影响因素的探讨[J].国际检验医学杂志，2013(20):2752-2754.

发明内容

本发明针对现有的HLA-B*27等位基因检测技术存在的费用昂贵、周期长、特异度灵敏度不足等特点，提供了一种用于检测HLA-B*27等位基因的试剂盒、组合物及方法，

本发明涉及一种试剂盒，其包含用于检测HLA-B*27等位基因的探针以及引物对；

所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述引物对包括SEQ ID NO：2所示的正向引物和SEQ ID NO：3所示的反向引物。

该试剂盒可以特异性检测HLA-B*27等位基因，且灵敏度高，重复性好。本发明所提供的技术方案适用范围广，在基层医院可替代FCM法，大大节约检测成本；敏感度高于FCM法，适合人群HLA-B*27基因的大范围筛查；同FCM法联合检验更可显著提高HLA-B*27的检测准确度，提高检验能力。

本发明还提供组合物，其由如上所述的试剂盒中的物质与受试者基因组DNA混合得到。

根据本发明的再一方面，本发明还涉及一种检测HLA-B*27等位基因的方法，所述方法是诊断或非诊断目的，其包括如下步骤：

获取如上所述的组合物，并在合适的条件下进行PCR扩增反应。

本方法操作简便，无需测序，成本低廉，迎合了临床具体工作情况和要求，方法快速，可以只需一步PCR反应，无需纯化和预处理可直接上机检测，通量高，结果清晰容易判断，在临床上极具推广价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中本发明所采用的阳性对照质粒的质粒图谱；

图2为本发明一个实施例中所构建的阳性质粒标准品标准曲线；

图3为本发明一个实施例中待检样品的扩增曲线。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。

所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

在一些实施方式中，所述试剂盒还包含用于检测看家基因的内标引物对和内标探针。

在一些实施方式中，所述看家基因为GAPDH。

在一些实施方式中，所述内标探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述内标引物对包括SEQ ID NO：5所示的正向引物和SEQ ID NO：6所示的反向引物。

在一些实施方式中，所述探针和/或内标探针包含可检测的标记。

如本文所用的术语“可检测的标记”指可用于提供可检测的(优选可定量的)效果且可以连接至核酸或蛋白的任何原子或分子。标记包括但不限于染料；放射性标记，诸如32P；结合部分诸如生物素；半抗原诸如地高辛；发光、发磷光或发荧光部分；和单独的荧光染料或与可以通过荧光共振能量转移(FRET)抑制或移动发射光谱的部分组合的荧光染料。标记可以提供可通过荧光、放射性、比色、重量测定、X射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。标记可以是带电荷的部分(正电荷或负电荷)或可选地，可以是电荷中性的。标记可以包括核酸或蛋白序列或由其组合，只要包含标记的序列是可检测的。在一些实施方案中，核酸在没有标记的情况下直接检测(例如，直接读取序列)。

在一些实施方式中，所述标记是荧光团、比色标记、量子点、生物素以及其他可以用于探测的标签分子(如用于拉曼衍射成像的炔烃基团，用于click反应的环烯烃，用于聚合物标记的引发集团)，也可以选自多肽/蛋白分子，LNA/PNA，非天然氨基酸及其类似物(比如拟肽)，非天然核酸及其类似物(拟核苷酸)和纳米结构(包括无机纳米颗粒，NV-center，聚集/组装诱导发光分子，稀土离子配体分子，多金属氧簇等)。

在一些实施方式中，所述探针和/或内标探针为荧光探针。

在一些实施方式中，所述探针和/或内标探针具有荧光报告基团，所述荧光报告基团独立地选自FAM、HEX、TET、NED、ROX、CY5、CY3、Texas Red、TFAM、SYBR Green I、VIC以及JOE中的任一种。

在一些实施方式中，当HLA-B*27和内标的探针在同一反应体系下进行杂交时，要求HLA-B*27和内标探针荧光报告基团发光的波长范围没有交叉。在一个具体的实施例中，HLA-B*27荧光报告基团选自FAM，内标探针荧光报告基团选自VIC。

在一些实施方式中，所述探针和/或内标探针具有淬灭基团，所述淬灭基团独立地选自TAMRA、BHQ、Dabcyl、Eclipse以及NFQ-MGB中的任一种。

在一些实施方式中，所述试剂盒中还包含用于PCR反应的扩增缓冲液、核酸提取试剂、阳性对照品、阴性对照品、可溶性镁盐、dNTP，DNA聚合酶以及水中的一种或多种。

在一些实施方式中，所述阳性对照品中包含SEQ ID NO：7所示核苷酸序列。

在一些实施方式中，所述DNA聚合酶选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4DNA聚合酶、Klenow片段中的任一种。

在一些实施方式中，所述水通常为核酸和/或无核酸酶的水，例如蒸馏水、去离子水、反渗水。

在一些实施方式中，所述受试者基因组DNA来自于血液(全血)、血浆、细胞培养上清、唾液、精液、羊水、绒毛、组织或组织裂解液、骨骼或毛发。

在一些实施方式中，所述受试者为哺乳动物。

在一些实施方式中，所述受试者为灵长类动物。

在一些实施方式中，所述受试者基因组DNA通过酚氯仿法、NaOH法、树脂提取法、盐析法、十六烷基三甲基溴化胺法、硅胶膜吸附法、FTA卡法、硅珠法或磁珠提取法提取。

HLA-B*27的表达与强直性脊柱炎、Reiter综合症、葡萄膜炎、溃疡性结肠炎等疾病有很高的相关性，因而本发明所提供的方法在临床上具有很高的检验价值。

此外，HLA-B*27具有高度多态性，因而也可以用于社会学等领域的研究(例如人种分布等)。

在一些实施方式中，所述PCR扩增反应的退火温度为55℃～65℃，优选60℃。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

实施例

在本实施例中，提供了一种检测HLA-B*27等位基因的试剂盒及方法。

HLA-B*27具有高度多态性。其亚型众多，截止至2019年11月，命名依次从HLA-B*27:01至HLA-B*27:221(B*27:22除外，B*27:22序列已被更正为B*27:06:01:01(April2002))。研究发现并非所有的亚型都与AS存在相关性，其中B2702、B2704、B2705、B2707、B*2708、B*2710、B*2714、B*2715、B*2719等亚型可能与AS呈正相关。

HLA-B*27同时具有地域差异性。在亚洲人群中，最常见B*2704、B*2705、B*2707，中国汉族人群中，B2704是数量最具有优势的亚型，其次是B*2705，B*2707、B*2711等，各地区和各民族的亚型的分布又各具特点。

基于以上因素，在比对全部B*27亚型序列的同时(序列比对工具DNAMAN软件)，本发明以能很好的分辨出以上所述亚型为主要出发点设计上、下游引物及探针序列，同时选择B*270401为阳性质粒标准品的参考序列。

本发明在设计上、下游引物运用了等位基因特异性PCR技术，设计探针运用了Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR技术，通过对HLA-B族的所有亚型进行比对，找出B*27与其他亚型的差异碱基，通过上、下游引物和探针单独或共同的分型能力达到对B*27检出的目的。其中参与比对的HLA-B族基因包括：HLA-B*07、HLA-B*08、HLA-B*13、HLA-B*14、HLA-B*15、HLA-B*18、HLA-B*35、HLA-B*37、HLA-B*38、HLA-B*39、HLA-B*40、HLA-B*41、HLA-B*42、HLA-B*44、HLA-B*45、HLA-B*46、HLA-B*47、HLA-B*48、HLA-B*49、HLA-B*50、HLA-B*51、HLA-B*52、HLA-B*53、HLA-B*54、HLA-B*55、HLA-B*56、HLA-B*57、HLA-B*58、HLA-B*59、HLA-B*67、HLA-B*73、HLA-B*78、HLA-B*82、HLA-B*83共34种。同时为了弥补流式细胞术对B*07和B*27分辨能力的不足，本发明重点比对了B*07和B*27，在设计引物和探针序列过程中重点对二者的分辨能力作出了进一步要求。通过上述设计，本发明所提供的引物和探针具有更好的特异性。

本发明最终确定的HLA-B*27引物及探针如下：

荧光探针：MGB-HLA-B*27:5’-ACGACACGCTGTTC-3’(SEQ ID NO：1)；

正向引物：HLA-B*27F：5’-GAGCCCCGCTTCATCACC-3’(SEQ ID NO：2)；

反向引物：HLA-B*27R：5’-GTCTGTGCCTTGGCCTTGC-3’(SEQ ID NO：3)。

同时为了保证PCR反应的准确性和真实性本发明，同时还提供了内控的引物和Taqman-MGB探针，序列如下：

荧光探针：MGB-hsa-GAPDH：5’-CAGCAAGCATTCCT-3’(SEQ ID NO：4)；

正向引物：hsa-GAPDH F：5’-CTGCCCTTTGAGTTTGATGATG-3’(SEQ ID NO：5)；

反向引物：hsa-GAPDH R：5’-CAGTCTGGGCACAAGCTTTG-3’(SEQ ID NO：6)。

其中HLA-B*27和GAPDH探针的5’端设置有荧光报告基团，HLA-B*27荧光报告基团选自FAM，GAPDH探针荧光报告基团选自VIC；的3’端设置有淬灭基团，均采用NFQ。

在本实施例中，引物和探针由人工DNA合成仪合成，可由多种方式纯化，其中引物推荐使用ULTRAPAGE方法纯化；探针推荐使用HPLC法纯化。

在本实施例中，试剂盒中还提供HLA-B*27阳性质粒标准品用以构建标准曲线以及阳性对照，质粒克隆载体pUC57(图1)，克隆位点EcoRV，质粒抗性Ampicillin，插入的基因片段长度为272bp，其插入序列如下：

GGCTCCCACTCCATGAGGTATTTCCACACCTCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCACCGTGGGCTACGTGGACGACACGCTGTTCGTGAGGTTCGACAGCGACGCCGCGAGTCCGAGAGAGGAGCCGCGGGCGCCGTGGATAGAGCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGACCGGGAGACACAGATCTGCAAGGCCAAGGCACAGACTGACCGAGAGAGCCTGCGGACCCTGCTCCGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCGG(SEQ ID NO：7)

(以上序列来自IMGT/HLA数据库(https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html)公开的HLA-B*270401参考序列)。

试剂盒中还提供PCR反应所用的DNA聚合酶、缓冲液、dNTP及Mg²⁺等，它们以混合液的方式配制成反应液：

Probe PCR Mix(2X)

ExTaq DNA Polymerase	1.25U/25μl
		Buffer	2×conc.
dNTP Mixture	2×conc.；各0.4mM
		Mg<sup>2+</sup>	4mM

HLA-B*27的等位基因可通过以下方法检测：

1)：核酸的提取

a.从待检测者抽取抗凝血样本；

b.从抗凝血样本中获取DNA，推荐使用商品化的试剂盒和核酸提取仪；

c.测定DNA样本的浓度和纯度，建议浓度至少大于10ng/μl，纯度OD_260nm/OD_280nm＝1.7～2.0之间；

2)：荧光PCR扩增

a.组份配制PCR反应液(反应液配制在冰上进行)

试剂	使用量	终浓度
			Probe PCR Mix	15μl	1×
HLA-B*27 Forward Primer(10μM)	1.2μl	12pmol
			HLA-B*27 Reverse Primer(10μM)	1.2μl	12pmol
hsa-GAPDH Forward Primer(10μM)	1μl	10pmol
			hsa-GAPDH Reverse Primer(10μM)	1μl	10pmol
Probe-MGB-HLA-B*27(10μM)	1μl	10pmol
			Probe-MGB-has-GAPDH(10μM)	0.8μl	8pmol
DNA template		100pg～1μg
			ddH<sub>2</sub>O	up to 30μl

同时使用阳性质粒标准品作为本次反应的阳性对照，推荐使用阳性质粒标准品构建标准曲线监测扩增效率(图2)并进行绝对定量。

绝对定量的标准曲线制作方法如下：

已知:平均分子质量(MW)dsDNA＝碱基数×660dolton/碱基；1mol＝6.02×10²³摩尔分子(拷贝数)；DNA length：2710+272＝2982bp；本实施例使用的质粒标准品浓度为500ng/μl；

由此可以推断出拷贝数计算公式(copies/ml)＝6.02×10²³拷贝数/摩尔×(浓度)/(MW g/mol)

即：(6.02×10²³)×(g/ml)/(DNA length×660)＝copies/ml，

(6.02×10²³)×(ng/μl×10^-9)/(DNAlength×660)＝copies/μl

将本质粒标准品的浓度及长度代入可得：

Copy number＝1.53×10¹¹copies/μl

将原液以10为倍数进行倍比稀释，依照上述方法上机检测得出C_T值(图3)，并根据上样量(本示例为2μl)转换为拷贝数得到：

C<sub>T</sub>	copy number	log<sub>10</sub>(copy number)
			7.23	3.06×10<sup>10</sup>	10.486
11.19	3.06×10<sup>9</sup>	9.486
			14.37	3.06×10<sup>8</sup>	8.486
17.70	3.06×10<sup>7</sup>	7.486
			21.61	3.06×10<sup>6</sup>	6.486
24.35	3.06×10<sup>5</sup>	5.486
			27.81	3.06×10<sup>4</sup>	4.486

以C_T值为横坐标，log₁₀(copy number)为纵坐标制作方程式：

若样本C_T值为25.23，则将C_T值代入线性方程式：

即y＝-0.2934×25.23+12.69＝5.287518

即Quantity＝10^5.287518＝193873.2988copies

b.根据不同PCR仪器类型设置反应参数，针对上述反应液已优化的PCR扩增条件如下:

预变性阶段

二步法循环数：40cycles

推荐设置复孔以校正误差，也可在部分PCR仪加入ROX Reference Dye用以校正孔间差异。

(3)：结果分析：

在上述PCR反应体系和扩增程序下，观察标准曲线的扩增效率是否在90％～110％之间，在此前提下观察特异性PCR反应体系内的目的基因和内控基因荧光信号是否形成对数扩增的“S”型曲线，并结合C_T值判断如下：

1.若内控基因荧光信号呈对数扩增的“S”型曲线且C_T值≤35，目的基因荧光信号呈对数扩增的“S”型曲线，同时C_{T目的基因}-C_{T内控基因}≤8，则代表待检测者HLA-B*27阳性。

2.若内控基因荧光信号呈对数扩增的“S”型曲线且C_T值≤35，目的基因荧光信号结果显示无扩增信号，或目的基因荧光信号形成对数扩增的“S”型曲线但C_{T目的基因}-C_{T内控基因}＞8均代表待检测者HLA-B*27检测结果阴性。

3.若内控基因荧光信号未形成对数扩增的“S”型曲线或荧光信号呈对数扩增的“S”型曲线但C_T值＞35，无论目的基因荧光信号是否形成对数扩增的“S”型曲线，均无法得出HLA-B*27是否为阳性/阴性的结果。

性能验证：

选取临床流式细胞术检测HLA-B*27抗原的枸橼酸钠抗凝血标本100份，其中结果为阳性和阴性标本各50份。操作步骤及结果判读均如上所述。所使用的PCR仪器为：ABIQuantStudioTM DX

临床流式细胞术检测同本技术方案检测结果如下：

统计结果(统计软件IBM SPSS Statistics 20.0)：

本方案*流式细胞术交叉制表

计数

卡方检验

a.使用的二项式分布。

对称度量

a.不假定零假设。

b.使用渐进标准误差假定零假设。

由上可知，本方案同临床流式细胞术检测HLA-B*27抗原检测结果无统计学差异，且Kappa＝0.940，具有很高的一致性。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 福建医科大学附属第一医院

<120> 用于检测HLA-B*27等位基因的试剂盒、组合物及方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 14

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 1

acgacacgct gttc 14

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 2

gagccccgct tcatcacc 18

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 3

gtctgtgcct tggccttgc 19

<210> 4

<211> 14

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 4

cagcaagcat tcct 14

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 5

ctgccctttg agtttgatga tg 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 6

cagtctgggc acaagctttg 20

<210> 7

<211> 272

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 7

ggctcccact ccatgaggta tttccacacc tccgtgtccc ggcccggccg cggggagccc 60

cgcttcatca ccgtgggcta cgtggacgac acgctgttcg tgaggttcga cagcgacgcc 120

gcgagtccga gagaggagcc gcgggcgccg tggatagagc aggaggggcc ggagtattgg 180

gaccgggaga cacagatctg caaggccaag gcacagactg accgagagag cctgcggacc 240

ctgctccgct actacaacca gagcgaggcc gg 272

Claims

1.试剂盒，其包含用于检测HLA-B*27等位基因的探针以及引物对；

所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其还包含用于检测看家基因的内标引物对和内标探针。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，所述看家基因为GAPDH。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，所述内标探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述内标引物对包括SEQ ID NO：5所示的正向引物和SEQ ID NO：6所示的反向引物。

5.根据权利要求1～4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述探针和/或内标探针包含可检测的标记。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述探针和/或内标探针为荧光探针。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述探针和/或内标探针具有荧光报告基团，所述荧光报告基团独立地选自FAM、HEX、TET、NED、ROX、CY5、CY3、Texas Red、TFAM、SYBR Green I、VIC以及JOE中的任一种。

8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述探针和/或内标探针具有淬灭基团，所述淬灭基团独立地选自TAMRA、BHQ、Dabcyl、Eclipse以及NFQ-MGB中的任一种。

9.根据权利要求1～4、6～8任一项所述的试剂盒，其还包含用于PCR反应的扩增缓冲液、核酸提取试剂、阳性对照品、阴性对照品、可溶性镁盐、dNTP，DNA聚合酶以及水中的一种或多种。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，所述阳性对照品中包含SEQ ID NO：7所示核苷酸序列。

11.组合物，其由权利要求1～10任一项所述的试剂盒中的物质与受试者基因组DNA混合得到。

12.检测HLA-B*27等位基因的非诊断目的方法，包括如下步骤：

获取权利要求11所述的组合物，并在合适的条件下进行PCR扩增反应。