CN103255209A - 用于检测人类白细胞hla-b27抗原基因的引物组及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种适合中国人群的用于检测人类白细胞HLA-B27抗原基因的引物组及试剂盒。用于HLA-B27基因测定的引物组包括HLA-B*27引物对、HLA-B*2702引物对、HLA-B*2704引物对、HLA-B*2705/07引物对、HLA-B*2706引物对和内参引物对。本发明的试剂盒的应用有助于临床对强直性脊柱炎的诊断，为临床监测HLA-B*27基因分型指导临床治疗提供了有力工具。

Description

用于检测人类白细胞HLA-B27抗原基因的引物组及试剂盒

技术领域  本发明属于生物技术领域，特别涉及一种用于检测HLA-B*27低/高分辨基因分型测定试剂盒(PCR-SSP法)。 

背景技术  HLA-B*27是B基因座编码的MHC I类表面抗原，位于第6染色体上，并递呈微生物抗原到T细胞，HLA-B*27亚型为B*2701-2752。HLA-B*27同一系列自免疾病血清学阴性的强直性关节炎相关(ankylosing spondylitis，AS)。早在1973年Schlosstein和Brewerton等发现HLA-B*27抗原与AS呈高度相关，是迄今为止所知的HLA与疾病相关性中最强的。HLA-B*27的检测有助临床对强直性脊柱炎的诊断。 

随着国内外对HLA-B*27的不断深入研究，现已发现79种HLA-B*27亚型(B*2701-2752)，但各亚型与AS间的相关性却存在着许多不同。迄今为止，在AS患者中已检测到B*2701、2702、2703、2704、2705、2706、2707、2708和2710亚型。其中，白种人AS患者与B*2705、2707相关，亚洲人AS患者与B*2705、2704和2706、2707关联，B*2703则仅见于西非AS患者。目前比较肯定的易感基因有B*2705、2704、2702而B2701、2707和2710与AS的关系因样本量不大，需进一步证实。如果某些HLA-B*27亚型与AS的相关性较其他亚型强，就可能提示这些亚型的共有多肽在AS发病机制上更为重要。强直性脊柱炎又名Marie-strümpell病、Von Bechterew病、类风湿性脊柱炎、畸形性脊柱炎、类风湿中心型等，现都称AS。遗传因素在AS的发病中具有重要作用。据流行病学调查，AS病人HLA-B*27阳性率高达90％～96％，普通人群HLA-B*27阳性率仅4％～9％；HLA-B*27阳性者AS发病率约为10％～20％，而普通人群发病为1‰～2‰，相差约100倍。有报道，AS一组亲属患AS的危险性比一般人高出20～40倍，国内调查AS一级亲属患病率为24.2％，比正常人群高出120倍。HLA-B*27阴性健康者，亲属发生AS的机率远比HLA-B*27阳性AS病人亲属低。所有这些说明HLA-B*27在AS发病中是一个重要因素。 

目前中国发病率0.3％，中国有上千万的强直性脊柱炎患者，因此强直性脊柱炎常见的疾病.HLA-B*27检测成为强直性脊柱炎极其重要的诊断标准.因此中国对于HLA-B*27检测试剂的市场需求非常大。经济效益巨大。因此人类白细胞抗原B*27血型基因检测试剂盒研制与开发具有巨大的经济效益与社会效益。 

2009年起欧美、印度、日本等国家与地区均采用HLA-B*27高分辨等位基因分型技术。多家欧美公司可提供商业试剂盒，如Inno-Train等，但其设计基础都是基于欧美人群的HLA-B*27等位基因分布频率。 

我国对检测HLA-B*27高分辨等位基因的试剂处于空白状态，目前检测HLA-B*27常用的血 

清学方法(微量淋巴细胞毒CDC)、流式细胞术(FCM)均为低分辨HLA-B*27基因分型，不能满足临床诊断和鉴别诊断的需要，不能实现对AS患者预后不良的预测和药物治疗指导。而序列特异引物-聚合酶链式反应(PCR-SSP)检测技术灵敏度高、特异性强、检验周期短、操作简便。但是目前尚无应用此种方法实现对HLA-B*27基因的快速检测。 

发明内容

本发明的目的是：克服现有技术中的不足，提供一种适合中国人群的用于检测HLA-B*27基因分型的引物组； 

本发明的第二个目的是提供一种适合中国人群的具有灵敏、特异、经济、简便、快速的用于检测人类白细胞HLA-B*27抗原基因的试剂盒。 

一种适合中国人群的用于检测HLA-B*27基因引物组，包括HLA-B*27引物对和内参引物对，所述HLA-B*27位于EXON2148-167和EXON2272-291的引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列； 

一种用于检测HLA-B*27基因的引物组，还包括HLA-B*2702引物对、HLA-B*2704引物对、HLA-B*2705/07引物对、HLA-B*2706/04引物对、HLA-B*2706引物对和内参引物对；所述HLA-B*2702位于EXON154-72和EXON2437-456的引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列； 

所述HLA-B*2704位于EXON154-72和EXON2429-445的引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列； 

所述HLA-B*2705/07位于EXON276-97和EXON2301-318的引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列； 

所述HLA-B*2706/04位于INTRON2244-EXON3363和EXON2527-545的引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列； 

所述HLA-B*2706位于INTRON2244-EXON3363和EXON3411-431的引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列； 

一种用于检测HLA-B*27基因的试剂盒，包括包被有HLA-B*27引物对和内参引物对的引物板和浓缩dNTP-Buffer，所述HLA-B*27位于EXON2148-167和EXON2272-291的引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列； 

一种用于高分辨检测HLA-B*27基因的试剂盒，包括包被有HLA-B*27引物对、HLA-B*2702引物对、HLA-B*2704引物对、HLA-B*2705/07引物对、HLA-B*2706/04引物对、HLA-B*2706引物对、内参引物对的引物板和浓缩dNTP-Buffer； 

所述HLA-B*27位于EXON2148-167和EXON2272-291的引物对的上、下游引物分别是序 列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列； 

所述HLA-B*2702位于EXON154-72和EXON2437-456的引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列； 

所述HLA-B*2704位于EXON154-72和EXON2429-445的引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列； 

所述HLA-B*2705/07位于EXON276-97和EXON2301-318的引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列； 

所述HLA-B*2706/04位于INTRON2244-EXON3363和EXON2527-545的引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列； 

所述HLA-B*2706位于INTRON2 244-EXON3 363和EXON3 411-431的引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列； 

本发明的试剂盒的应用实现了对HLA-B*27基因分型，在强直性脊柱炎应用中对AS患者预后不良的预测和药物治疗指导具有重要意义。 

附图说明

图1高分辨检测HLA-B*27基因特异引物孔位图 

图2低分辨筛查HLA-B*27基因特异引物孔位图 

图3实验结果阴阳性判读图 

图4HLA-B*27基因高分辨检测试剂盒分型读板纸 

图5HLA-B*27基因高分辨检测试剂盒电泳结果胶图 

图6HLA-B*27基因低分辨筛查试剂盒电泳结果胶图 

具体实施方案

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明 

实施例1 

依据美国国立生物技术信息中心基因库(NCBI Gene Bank)公开的HLA等位基因序列，设计出用于高分辨检测HLA-B*27基因的引物组，该引物组包括HLA-B*27引物对、HLA-B*2702引物对、HLA-B*2704引物对、HLA-B*2705/07引物对、HLA-B*2706/04引物对、HLA-B*2706引物对和内参引物对。 

实施例2 

依据美国国立生物技术信息中心基因库(NCBI Gene Bank)公开的HLA等位基因序列，设 计出用于低分辨筛查检测HLA-B*27基因的引物组，该引物组包括HLA-B*27引物对和内参引物对。 

实施例3 

一种用于高分辨检测HLA-B*27基因的试剂盒，包括包被有HLA-B*27引物对、HLA-B*2702引物对、HLA-B*2704引物对、HLA-B*2705/07引物对、HLA-B*2706/04引物对、HLA-B*2706引物对、内参引物对的引物板和浓缩dNTP-Buffer。 

用于高分辨检测HLA-B*27基因的试剂盒的制备方法是： 

(1)依据高分辨检测HLA-B*27基因特异引物孔位图(见图1)，分别将HLA-B*27引物对、HLA-B*2702引物对、HLA-B*2704引物对、HLA-B*2705/07引物对、HLA-B*2706/04引物对、HLA-B*2706引物对和内参引物对包被至引物板的相应位置上，干燥处理； 

(2)依据配220mM dNTP、3.5mM Mg2+、500mM KCL、100mM Tris-HCL、1％TritonX-100制备出440μl浓缩dNTP-Buffer； 

(3)将包被有引物对的引物板每人份检测包括6孔特异性引物孔，浓缩dNTP-Buffer组成一种用于高分辨检测HLA-B*27基因的试剂盒。 

实施例4 

一种用于低分辨筛查检测HLA-B*27基因的试剂盒。其特征是包括包被有HLA-B*27引物对和内参引物对的引物板和浓缩dNTP-Buffer。 

用于低分辨筛查HLA-B*27基因的试剂盒的制备方法是： 

(1)依据低分辨筛查检测HLA-B*27基因特异引物孔位图(见图2)，分别将HLA-B*27引物对和内参引物对包被至引物板的相应位置上，干燥处理； 

(2)依据配220mM dNTP、3.5mM Mg2+、500mM KCL、100mM Tris-HCL、1％TritonX-100制备出440μl浓缩dNTP-Buffer； 

(3)将包被有引物对的引物板、每人份检测包括1孔特异性引物孔，浓缩dNTP-Buffer组成一种用于低分辨筛查HLA-B*27基因的试剂盒。 

实施例5 

使用操作流程 

一、2.5％琼脂糖凝胶的准备： 

1.将加入2.5g琼脂糖加入100ml1×TBE溶液(Tris-硼酸盐-EDTA溶液)，加热直到形成均匀的凝胶溶液。再加入适量电泳染色剂，混合均匀。 

2.将凝胶槽置于水平位置，向凝胶槽中加入适量凝胶溶液，插入电泳梳。前后水平移动凝胶槽，确保凝胶溶液覆盖均匀。 

3.待凝胶完全凝固后，竖直拔出电泳梳。 

二、PCR循环参数见表1： 

1	96℃/2min	1cycle
			2	96℃/20sec，68℃/60sec	5cycles
3	96℃/20sec，65℃/50sec，72℃/45sec	10cycles
			4	96℃/20sec，62℃/50sec，72℃/45sec	15cycles
5	72℃/3min	1cycle
			6	4℃保存

表1扩增参数特征表 

三、必须满足的试验条件： 

1.从冷冻室取出Taq聚合酶，放置冰上备用。 

2.根据实验所需数量，将包被引物的干燥冷冻保存的引物板取出，放置室温解冻，备用。 

3.根据实验所需数量，将冷冻的DNA样本、浓缩dNTP-Buffer取出，彻底融化，混匀离心。 

四、实验过程中的注意事项： 

1.PCR扩增前后使用的加样器具要分开，不得混用。 

2.所有血液制品均应按照潜在的传染物处理。 

3.当观察和拍摄胶凝体时，要戴防紫外光的保护镜，不要直视紫外光源。 

4.试剂和样本应加样到微孔板的底部。 

5.为避免交叉污染，在不同样本和试剂之间要更换加样枪头。 

6.在检测前应准备好所有试剂和样本，一旦开始试验，为确保得到可靠结果不可中断操作。 

7.Taq聚合酶粘性很大，在分装过程中必须小心操作确保准确。 

8.严格按照指定的顺序操作。 

五、操作步骤：选用实施例3制备的一种用于高分辨检测HLA-B*27基因的试剂盒 

1.配制dNTP-Buffer工作液： 

440μl浓缩dNTP-Buffer+560μl无菌水＝1000μl dNTP-Buffer工作液 

2.配制Buffer-酶混合液： 

每人份用量：60μl dNTP-Buffer工作液+0.5μl Taq酶(5units/μl)+6μlDNA＝66.5μl 

3.漩涡混匀Buffer-酶混合液，并瞬时离心，，使液体位于管底。 

4.分别向每个引物孔(1-6)加入10μl上述混合液。 

5.每孔再分别加入15-20μl石蜡油，用密封膜封好PCR反应板(引物板)。 

6.将引物板放入设置好循环参数的PCR仪内，配合使用适当的板架适配器。PCR循环参数见上文。 

7.反应板顶部置PCR密封压力垫，以防止液体蒸发，关上PCR仪，启动程序直至循环结束。 

8.启动PCR程序，直到循环结束。 

9.取出引物板，轻轻地撕掉密封膜，防止样品溅出。或者如果不立即电泳，置于4℃可保存48小时。 

10.按照照引物孔位图的顺序，将每个PCR反应产物(5-10μl)转移到2.5％琼脂糖凝胶孔中。 

11.140-150V电泳15-20分钟，内参带和阳性带清晰分开即可停止电泳。 

12.紫外光下观察结果并拍摄成像。 

13.根据提供的读板纸解释分型结果。 

六、质量控制程序： 

内参质控带(缓慢迁移的)作为成功扩增的质控手段，在阴性孔应该总是可见的；阳性孔的内参质控带可能会很弱或者不存在，这是因为特异性引物扩增过程中与内参引物竞争Taq酶等反应原料的结果。 

七、实验结果的判读： 

HLA-B*27基因高分辨检测试剂盒电泳结果胶图(见图5：图5(一)结果为B*27(+)，图5(二)结果为B*2702，图5(三)结果为B*2704，图5(四)结果为B*2705，图5(五)结果为B*2706)，实验结果阴阳性判读图(见图3)，实验结果阳性基因分型读板纸(见图4)。 

预期结果： 

阳性孔：有两条带，一条是内参带，另一条是特异性扩增带 

阴性孔：只有一条带，是内参带，无特异性扩增带 

产物大小和孔位：见高分辨检测HLA-B*27基因特异引物孔位图(见图1) 

根据检测HLA-B*27基因特异引物孔位图(见图1)或该试剂配套软件进行分型结果的判定。 

该实验为定性试验，特异性扩增带强弱将不影响结果判读；扩增产物大小请参见高分辨检测HLA-B*27基因特异引物孔位图(见图1)；并符合人类基因座位规则。 

实施例6 

步骤一、二、三、四、六同实施例5 

五、操作步骤：选用实施例4制备的一种用于低分辨筛查HLA-B*27基因的试剂盒 

1.配制dNTP-Buffer工作液： 

440μl浓缩dNTP-Buffer+560μl无菌水＝1000μl dNTP-Buffer工作液 

2.配制Buffer-酶混合液： 

每9人份用量：100μl dNTP-Buffer工作液+0.9μl Taq酶(5units/μl)＝100.9μl混合液 

3.漩涡混匀Buffer-酶混合液，并瞬时离心。 

4.分别向每个引物孔加入9μl上述混合液。 

5.每孔加入1μl样本DNA。 

6.每孔再分别加入15-20μl石蜡油，用密封膜封好PCR反应板(引物板)。 

7.将引物板放入设置好循环参数的PCR仪内，配合使用适当的板架适配器。PCR循环参数见实施例5步骤二表1。 

8.反应板顶部置PCR密封压力垫，以防止液体蒸发，关上PCR仪，启动程序直至循环结束。 

9.启动PCR程序，直到循环结束。 

10.取出引物板，轻轻地撕掉密封膜，防止样品溅出。或者如果不立即电泳，置于4℃可保存48小时。 

11.按照照引物孔位图的顺序，将每个PCR反应产物(5-10μl)转移到2.5％琼脂糖凝胶孔中。 

12.140-150V电泳15-20分钟，内参带和阳性带清晰分开即可停止电泳。 

13.紫外光下观察结果并拍摄成像。 

七、实验结果的判读： 

HLA-B27基因低分辨筛查试剂盒电泳结果胶图(见图6：图6(一)结果为 

B*27(+)，B*27(+)、图6(二)结果为B*27(+)，B*27(-)、图6(三)结果为B*27(-)，B*27(+)、图6(四)结果为B*27(-)，B*27(-))，实验结果阴阳性判读图(见图3)。 

预期结果： 

阳性孔：有两条带，一条是内参带，另一条是特异性扩增带 

阴性孔：只有一条带，是内参带，无特异性扩增带 

产物大小和孔位：见低分辨筛查HLA-B*27基因特异引物孔位图(见图2) 

根据低分辨筛查HLA-B*27基因特异引物孔位图(见图2)或该试剂配套软件进行分型结果的判定。 

该实验为定性试验，特异性扩增带强弱将不影响结果判读；扩增产物大小请参见低分辨 

筛查HLA-B*27基因特异引物孔位图(见图2)；并符合人类基因座位规则。 

Claims (4)

1.一种用于检测HLA-B*27基因的引物组，其特征是包括HLA-B*27引物对及内参引物对；

所述HLA-B*27位于EXON2148-167和EXON2272-291的引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的一种用于检测HLA-B*27基因的引物组，其特征是包括HLA-B*2702引物对、HLA-B*2704引物对、HLA-B*2705/07引物对、HLA-B*2706/04引物对、HLA-B*2706引物对及内参引物对；

所述HLA-B*2702位于EXON154-72和EXON2437-456的引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；

所述HLA-B*2704位于EXON154-72和EXON2429-445的引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；

所述HLA-B*2705/07位于EXON276-97和EXON2301-318的引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；

所述HLA-B*2706/04位于INTRON2244-EXON3363和EXON2527-545的引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列；

所述HLA-B*2706位于INTRON2244-EXON3363和EXON3411-431的引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列。

3.一种用于低分辨筛查检测HLA-B*27基因的试剂盒，包括包被有HLA-B*27引物对和内参引物对的引物板和浓缩dNTP-Buffer；

所述HLA-B*27位于EXON2148-167和EXON2272-291的引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ IDNO.1、SEQ IDNO.2。

4.一种用于高分辨检测HLA-B*27基因的试剂盒，包括包被有HLA-B*27引物对、HLA-B*2702引物对、HLA-B*2704引物对、HLA-B*2705/07引物对、HLA-B*2706/04引物对、HLA-B*2706引物对、内参引物对的引物板和浓缩dNTP-Buffer；

所述HLA-B*27位于EXON2148-167和EXON2272-291的引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

所述HLA-B*2702位于EXON154-72和EXON2437-456的引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；

所述HLA-B*2704位于EXON154-72和EXON2429-445的引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；

所述HLA-B*2705/07位于EXON276-97和EXON2301-318的引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；

所述HLA-B*2706/04位于INTRON2  244-EXON3363和EXON2527-545的引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列；

所述HLA-B*2706位于INTRON2244-EXON3363和EXON3411-431的引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列。

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