CN101838710A - 甲型肝炎病毒核酸荧光定量rt-pcr检测试剂盒及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基于RT-PCR方法的试剂盒及其使用方法。一种甲型肝炎病毒核酸荧光定量RT-PCR检测试剂盒，它的引物和探针序列如下：上游引物：5’-GAAGAGATGCCTTGGATAGGGTAA-3’下游引物：5’-AAAACCATTCAACGCCGG-3’探针：5’-FAM-AGCGGCGGATATTGGTGAGTTGTTAAGAC-TAMRA-3’本发明方法对甲型肝炎病毒的检测有高度的特异性，灵敏度达0.1TCID₅₀，可直接双壳贝类如毛蛤、牡蛎等生物等标本中检测甲型肝炎病毒核酸，从病毒核酸提取至完成检测仅需3h左右。

Description

甲型肝炎病毒核酸荧光定量RT-PCR检测试剂盒及使用方法

技术领域

本发明涉及甲型肝炎病毒的检测试剂盒及其使用方法，具体涉及基于RT-PCR方法的试剂盒及其使用方法。

背景技术

甲肝病毒(hepatitis Avires，HAV)是广泛传播的肝炎致病因子，它主要通过粪一口消化道途径引起人类感染。是全球急性传染性肝炎的主要原因，它可以引起甲型肝炎暴发与流行。甲肝传染源为急性期的病人和亚临床感染者，他们的粪便、尿液、呕吐物都可能污染周围环境、食物、水源等，被污染过的食物、水、各种物品充当传染媒介。因近岸贝类养殖区和海水浴场受到陆源生活污染水污染引发甲肝流行的事件，在国内外都有过许多报道。

由于甲型肝炎是由甲型肝炎病毒感染引起，为了对该病迅速查明病因，及时采取控制措施，急需进行实验室快速诊断，但传统甲肝病毒的检测方法是通过细胞培养，可是甲肝病毒不仅增殖周期长、增殖能力低，且不形成细胞病变，难以满足检测的要求，不适合早期诊断。

申请号为200910010804.9的中国专利公开了水产品中3种食源性病毒检测试剂盒及其检测方法。该试剂盒中包括浓度为5U/μL的反转录-TagDNA聚合酶、浓度为5U/μL的反转录酶及RT-PCR反应液；其中的RT-PCR反应液中含有10mM Tris·HCl、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP各10mM、RNA酶抑制剂40U/μL及3种食源性病毒的上下游引物对各20μM；所述的引物序列如下：

该发明专利的缺点是特异性程度不高，会出现假阳性。

发明内容

本发明的发明目的是针对上述技术缺陷，提供一种快速检测甲型肝炎病毒的甲型肝炎病毒核酸荧光定量RT-PCR检测试剂盒，本发明具有特异性程度高的优点。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案实现的：

一种甲型肝炎病毒核酸荧光定量RT-PCR检测试剂盒，它的引物和探针序列如下：

上游引物：5’-GAAGAGATGCCTTGGATAGGGTAA-3’

下游引物：5’-AAAACCATTCAACGCCGG-3’

探针：5’-FAM-AGCGGCGGATATTGGTGAGTTGTTAAGAC-TAMRA-3’。

此外本试剂盒中还包括dNTP，MgCl₂，RNase抑制剂，AMV逆转录酶，Taq酶等，这些组分对于本领域技术人员来说属于公知常识，可根据需要选用。

本发明的另外一个目的是提供一种上述甲型肝炎病毒核酸荧光定量RT-PCR检测试剂盒的使用方法。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

一种上述甲型肝炎病毒核酸荧光定量RT-PCR检测试剂盒的使用方法，它包括以下步骤：

(1)根据甲型肝炎病毒基因序列，设计引物和探针序列如下：

上游引物：5’-GAAGAGATGCCTTGGATAGGGTAA-3’

下游引物：5’-AAAACCATTCAACGCCGG-3’

探针：5’-FAM-AGCGGCGGATATTGGTGAGTTGTTAAGAC-TAMRA-3’；

(2)提取待测样品RNA，以待测样品RNA为模板、在包括步骤(1)所述引物和探针序列的RT-PCR反应体系中进行RT-PCR反应；

(3)对RT-PCR反应产物进行荧光检测，根据荧光检测的最低Ct值和最高荧光强度判断结果，荧光RT-PCR反应呈阳性，则待测样品含有甲型肝炎病毒核酸。

本发明关键在于引物和探针序列的设计，荧光RT-PCR反应体系组成、反应条件选择和反应结果判断均可按本领域常规方法进行。

优选的，所述荧光定量RT-PCR反应体系每25μL组成如下：

RT-PCR缓冲液          终浓度为1×

ExTaq HS(5U/μL)      (0.1U/μL)

RT Enzyme Mix II      (0.1U/μL)

上游与下游引物        各1.60μM

探针                  1.20μM

模板RNA               8μL

DEPC水补足至25μL。

所述RT-PCR缓冲液为one step RT-PCR缓冲液，其终浓度为1×，是指缓冲液各组分在反应体系中的终浓度与1×one step RT-PCR中各组分的浓度相同。通常采用反应体系1/2体积的2×one step RT-PCR。

优选的，所述荧光定量RT-PCR反应条件为：42℃30min，95℃2min进行逆转录，然后95℃15s，52℃1min，在52℃进行单点荧光检测，共进行40个循环。

所述样品RNA提取可按常规方法进行，如采用德国QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit或其它试剂盒，按照试剂盒说明书进行提取。

甲型肝炎是由甲型肝炎病毒感染引起，对甲型肝炎爆发疫情尽早作出实验室确诊是及时采取防控措施与对诊治疗的关键。目前甲型肝炎检测的几种方法中常规细胞培养进行病毒分离法虽然正确可靠，但繁杂耗时，不适应早期应急诊断；20世纪80年代建立的RT-PCR和ICC/PCR(integratedcellculture，PCR)检测技术提高了检测的灵敏度和特异性，且大大缩短了检测时间，目前已在甲型肝炎病毒的核酸检测中得到应用，但是需依据放射性物质标记的DNA探针或通过凝胶电泳中的特定DNA条带来判断检测结果，不仅费时费力，且给使用带来很大不便近。而且容易因PCR扩增产物污染而产生假阳性。因此目前对甲肝病毒的检测主要采用酶联免疫吸附实验(ELISA)，而该法只能检测到病毒抗原，对含空泡病毒(无核酸)比例很高(50％左右)的甲肝病毒来说，并不能反应活性病毒的多少，且不能确定HAV在检测时一定存在。况且在临床上患者血清中抗甲肝IgG或IgM于发病数日的黄疸前期才可检出。由于患者临床就诊与采血的时间往往处在发病初期，故在临床上用IgG或IgM抗体作为诊断手段不可避免地形成一定程度上的漏检。然而甲肝最危险的传染源不是明确发病的急性黄疸型肝炎患者，而是无黄疸型、隐性感染者，因症状不明显，常被忽视，这些人群约占甲型肝炎的50％～90％。尤其是儿童几乎都是无黄疸型肝炎，隐蔽性极强，但是他们都在不知不觉中向外界排放甲型肝炎病毒。而采用甲型肝炎病毒核酸检测技术，非常适用于甲型肝炎的早期诊断(不但可用于现症病人的早期诊断，可从含有10～100个病毒颗粒的粪便标本中检测出甲型肝炎病毒的基因组RNA)，还可用于亚临床感染者和隐性感染者的检测以及水、水产品等环境污染HAV的检测，也是进行流行病研究的重要手段，在方法学上能提高甲型肝炎病毒的检出率。

近几年发展起来的以特异性荧光探针为特点的荧光定量PCR技术，实行完全闭管式操作，不仅能大大减少扩增产物污染的机会，而且较常规RT-PCR技术，无论从敏感性，特异性与速度上都更具有优势，当然它对引物和探针的设计也提出了更高的要求。

本申请发明人从美国的NCBI基因库上下载了近几十年来世界各地的甲型肝炎病毒毒株，对其进行了同源性比较，在甲型肝炎病毒的保守区设计若干对引物与Taqman探针，对该区域进行特异性扩增，从中筛选出最佳的引物和探针，并对荧光RT-PCR方法进行优化，验证其敏感性、特异性和重复性。经甲型肝炎病毒标准株、肠道病毒株与实际样本的检测比较，该方法具有高特异性，只能检出甲型肝炎病毒，与其他肠道病毒如脊髓灰质炎病毒、乙型脑炎病毒、腺病毒、新肠道病毒68、艾柯30、柯萨奇A1以及柯萨奇B5病毒株等毒株均无交叉反应，而且比常规RT-PCR法更敏感、快速和简便。甲型肝炎病毒的RT-PCR检测敏感度在1.0TCID₅₀左右，从病毒核酸提取、RT-PCR反应与电泳，整个过程大约需6～7h左右，而采用本方法从核酸提取至完成检测，仅需3h左右，能同时完成多个临床样本的高通量检测，敏感度达0.1TCID₅₀，比普通PCR的灵敏度高10倍左右，可直接从甲型肝炎患者的粪便等临床样本及双壳贝类如毛蛤、牡蛎等生物中检测甲型肝炎病毒核酸。

本发明的有益效果主要体现在：本发明方法对甲型肝炎病毒的检测有高度的特异性，与其他肠道病毒如脊髓灰质炎病毒、乙型脑炎病毒、腺病毒、新肠道病毒68、艾柯30、柯萨奇A1以及柯萨奇B5病毒株等病毒无交叉反应；本发明方法检测的灵敏度达0.1TCID₅₀，可直接从双壳贝类如毛蛤、牡蛎等生物等标本中检测甲型肝炎病毒核酸，从病毒核酸提取至完成检测仅需3h左右。

附图说明

图1为荧光定量RT-PCR法检测甲型肝炎病毒的灵敏度；1～6分别代表不同的病毒浓度，从1至6依次为10⁴、10³、10²、10¹、1、0.1TCID₅₀；

图2为荧光RT-PCR法检测实际样本中甲型肝炎病毒核酸；1：甲型肝炎病毒阳性对照；2至5：实际样本的检测。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例一本发明的试剂盒组成

甲型肝炎病毒核酸荧光定量RT-PCR检测试剂盒，它的引物和探针序列如下：

上游引物：5’-GAAGAGATGCCTTGGATAGGGTAA-3’

下游引物：5’-AAAACCATTCAACGCCGG-3’

探针：5’-FAM-AGCGGCGGATATTGGTGAGTTGTTAAGAC-TAMRA-3’。

另外，它还包括以下部分：

制品内容(50μL反应×100次)

其中，one step RT-PCR Buffer III中含有dNTP Mixture，Mg²⁺等。

实施例二试验论证

以下试验是利用本发明试剂盒进行的甲肝病毒检测试验以及验证本试剂盒对于甲肝病毒检测的特异性试验。

1材料和方法

1.1病毒

甲肝病毒株由浙江省医学科学院提供，脊灰质炎病毒、乙型脑炎病毒、腺病毒、新肠道病毒68、艾柯30、柯萨奇A1以及柯萨奇B5病毒株皆由浙江省疾控中心病毒研究所提供。

1.2引物与探针

上游引物：5’-GAAGAGATGCCTTGGATAGGGTAA-3’

下游引物：5’-AAAACCATTCAACGCCGG-3’

探针：5’-FAM-AGCGGCGGATATTGGTGAGTTGTTAAGAC-TAMRA-3’；

引物和探针委托上海英俊生物技术有限公司合成并标记。

1.3病毒定量标准与病毒RNA的提取：

以甲型肝炎病毒株为标准毒株进行病毒效价滴定((10⁵ TCID₅₀/ml)后作为参考株，将其稀释至10000、1000、100、10、1、0.1、0.01TCID₅₀每个反应管。病毒RNA的提取采用德国QIAGEN公司的Reansy Mini Kit，按试剂盒说明书提取。

1.4荧光RT-PCR反应体系和条件的优化：

试剂盒选用TakaRa公司的one step Prime Script RT-PCR (Perfect Realtime)，Code：DRR064A。按说明书操作，反应体系为25μl，其中2×onestep RT-PCR缓冲液12.5ul，Ex Taq HS(5U/μl)0.5ul，RT Enzyme Mix II0.5ul，上游与下游引物(20μmol/L)各0.8μl，探针(20μmol/L)0.6μl，模板RNA 8μl，DEPC水补足25μl。反应条件为42℃30min，95℃2min进行逆转录，然后95℃15s，52℃1min，在52℃进行单点荧光检测，共进行40个循环，结果判断：选择荧光检测模式FAM，荧光基线调整取3-15个循环的荧光信号平均值，阈值设定以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点，样本呈典型的扩增曲线，判断为阳性。无典型的扩增曲线，判断为阴性。体系的优化试验，在以相同浓度阳性核酸为模板的反应体系中，引物浓度从100～900μmol/μl，探针浓度从50～300μmol/μl，采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度，根据最低Ct值和最高荧光强度增加值(ΔRn)选择最佳引物和探针浓度。

1.5RT-PCR反应：

甲型肝炎病毒RT-PCR引物序列：

HAV-R(上游)：5’-CAGCACATCAGAAAGGAGAG-3’

HAV-F(下游)：5’-CTCCAGAATCATCTCCAAC-3’

扩增片断192bp。采用TaKaRa公司one step RT-kit(code：DRR024A)，按试剂盒说明书操作，反应体系为25μl，其中10×RT-PCR缓冲液2.5ul，MgCl₂ 2.5ul(25mM)，dNTP混合物(各10mM)2.5μl，RNase抑制剂(40U/μl)0.5μl，AMV酶(5U/μl)0.5ul，Taq酶(5U/μl)0.5ul，上游与下游引物(20μM)各0.5μl，模板RNA 8μl，DEPC水4.5μl。反应条件为50℃30min，95℃3min进行逆转录，然后95℃20s，50℃25s，72℃30s进行扩增，40个循环后转入72℃10min，取8μl产物电泳后判断有无特异性条带(192bp)。

1.6荧光RT-PCR特异性、敏感性和重复性试验

分别选取甲型肝炎病毒、脊灰病毒、乙型脑炎病毒、腺病毒、新肠道病毒68、艾柯30、柯萨奇A1以及柯萨奇B5病毒分别提取病毒RNA，采用甲肝病毒TaqMan荧光定量RT-PCR反应体系进行检测，以考核该体系的特异性；对已知效价(10⁵TCID₅₀/ml)的甲肝病毒株稀释成：10000，1000，100，10，1，0.1，0.01TCID₅₀，分别提取病毒RNA，用本研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR检测体系进行检测，考察检测下限，对敏感性进行评价。此外，对每一个浓度的样本都作3个重复，通过对实验结果CT值的平均值和变异系数进行分析与评价，验证方法的重复性。

2结果

2.1荧光RT-PCR反应体系及条件

采用TaKaRa公司的一步法荧光RT-PCR试剂盒，总反应体系为25μl。矩阵法优选后引物最佳浓度均为1.6μM，探针最佳浓度为1.2μM，模板RNA 8μl，最后用DEPC水补至25μl。用MJ Research Option 2荧光检测系统进行检测，反应参数为：42℃30min逆转录，95℃变性2min，以95℃15s，52℃1min扩增40个循环，在52℃进行单点荧光检测，可获得最低CT值和最高荧光强度。

2.2特异性试验

本发明建立的荧光RT-PCR方法对甲型肝炎病毒具有较好的特异性，对其他肠道病毒如脊灰病毒、乙型脑炎病毒、腺病毒、新肠道病毒68、艾柯30、柯萨奇A1以及柯萨奇B5病毒等无交叉反应。

2.3敏感性试验

已知效价(10⁵TCID₅₀/ml)的甲肝病毒株稀释成：10000，1000，100，10，1，0.1，0.01TCID₅₀提取病毒RNA，分别用荧光RT-PCR与RT-PCR方法进行检测，结果荧光RT-PCR方法检测敏感性达到0.1TCID₅₀(见图1)。RT-PCR方法检测敏感性达到1.0TCID₅₀，荧光RT-PCR方法比常规RT-PCR方法的敏感度高10倍左右。

2.4重复性试验

甲型肝炎病毒株按10倍梯度稀释成4个不同浓度，对每一个浓度的样本作3个重复检测，CT值的变异系数在合理范围内(最大为3.78％，均小于5％)。证实本研究建立的HAV TaqMan荧光定量RT-PCR检测体系重复性很好。(表2)。

表2TaqManRT-PCR检测甲肝病毒的稳定性实验

2.5实际样本的检测

从市场购买的毛蛤、牡蛎等双壳贝类生物样本共50份，直接提取病毒RNA，用本发明甲型肝炎病毒荧光RT-PCR方法和普通RT-PCR方法同时检测，结果本发明甲型肝炎病毒荧光RT-PCR方法检测出甲型肝炎病毒核酸阳性4份，普通RT-PCR法检测出甲型肝炎病毒核酸阳性3份，本发明甲型肝炎病毒荧光RT-PCR方法比普通RT-PCR法检测甲型肝炎病毒的阳性率高。图2显示的是实际样本的检测图谱。

Claims (4)

1.甲型肝炎病毒核酸荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，它的引物和探针序列如下：

上游引物：5’-GAAGAGATGCCTTGGATAGGGTAA-3’

下游引物：5’-AAAACCATTCAACGCCGG-3’

探针：5’-FAM-AGCGGCGGATATTGGTGAGTTGTTAAGAC-TAMRA-3’。

2.甲型肝炎病毒核酸荧光定量RT-PCR检测试剂盒的使用方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

(1)根据甲型肝炎病毒基因序列，设计引物和探针序列如下：

上游引物：5’-GAAGAGATGCCTTGGATAGGGTAA-3’

下游引物：5’-AAAACCATTCAACGCCGG-3’

探针：5’-FAM-AGCGGCGGATATTGGTGAGTTGTTAAGAC-TAMRA-3’；

(2)提取待测样品RNA，以待测样品RNA为模板、在包括步骤(1)所述引物和探针序列的RT-PCR反应体系中进行荧光定量RT-PCR反应；

(3)对RT-PCR反应产物进行荧光检测，根据荧光检测的最低Ct值和最高荧光强度判断结果，荧光RT-PCR反应呈阳性，则待测样品含有甲型肝炎病毒核酸。

3.如权利要求2所述的甲型肝炎病毒核酸荧光定量RT-PCR检测试剂盒的使用方法，其特征在于：所述RT-PCR反应体系每25μL组成如下：

RT-PCR缓冲液终       浓度为1×

Ex Taq HS(5U/μL)    (0.1U/μL)

RT Enzyme Mix II     (0.1U/μL)

上游与下游引物  各1.60μM

探针            1.20μM

模板RNA         8μL

DEPC水补足至25μL。

4.如权利要求2所述的甲型肝炎病毒核酸荧光定量RT-PCR检测试剂盒的使用方法，其特征在于所述荧光定量RT-PCR反应条件为：42℃30min，95℃2min进行逆转录，然后95℃15s，52℃1min，在52℃进行单点荧光检测，共进行40个循环。

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