CN104946797B - 一步法荧光定量rt-pcr检测罗氏沼虾野田村病毒的引物及试剂盒 - Google Patents
一步法荧光定量rt-pcr检测罗氏沼虾野田村病毒的引物及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一步法荧光定量RT‑PCR检测罗氏沼虾野田村病毒的引物,包括上游引物MrNV‑QF1和下游引物MrNV‑QR1,它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和序列表SEQ.ID.No.2的碱基序列。发明人据此建立了一步法荧光定量RT‑PCR检测罗氏沼虾野田村病毒的检测方法,并制备了相应的检测试剂盒。本发明检测方法及其试剂盒应用于MrNV的检测,无需将反转录和PCR反应分开,操作便捷且灵敏快速,有利于快速检测MrNV及防控WTD。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测病毒领域,尤其涉及一种一步法荧光定量RT-PCR检测罗氏沼虾野田村病毒的引物及试剂盒。
背景技术
罗氏沼虾野田村病毒(Macrobrachium rosenbergii nodavirus,MrNV)是罗氏沼虾白尾病(white tail disease,WTD)的重要病原,主要危害罗氏沼虾淡化苗,可导致病虾出现肌肉白浊、白斑或白尾症状,在短时间内大量死亡,虾池中累积死亡率一般为30%~70%,严重时达90%以上。WTD最早于1987年由Nash等在泰国率先报道,随后逐渐波及到中国台湾、法属瓜特罗普岛和安替列群岛以及中国大陆地区。在我国,WTD最早于1996年前后出现在广东、广西一带,以后迅速传播到浙江、江苏、上海等地,2000年起在全国范围内广泛流行,给罗氏沼虾养殖业的发展造成了极大的危害。目前,该病已被列为世界动物卫生组织(OIE)必须申报的疫病和我国水生动物二类疫病。因此,开发MrNV检测技术对有效控制WTD的发生与流行、保障罗氏沼虾养殖业的健康发展具有重要意义。
针对MrNV的检测方法主要有原位杂交、ELISA、胶体金试纸条、RT-PCR及RT-LAMP检测法等。但是,在实际检测工作中,原位杂交和ELISA检测所需时间长;胶体金试纸条虽速度快捷、操作方便,但灵敏度较低;RT-PCR对潜伏感染样品难以检出;套式RT-PCR和RT-LAMP虽灵敏、快速,但容易交叉污染,且不能定量。
荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团,把核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术结合在一起,对整个PCR反应扩增过程进行了实时监测和连续分析扩增相关荧光信号,监测到的荧光信号随反应变化可以绘制成一条曲线,最后通过标准曲线对未知核酸模板进行定量分析。该法具有操作简单、灵敏高等优点。SYBR Green I荧光定量PCR是在反应中加入能结合于双链DNA螺旋小沟的SYBR Green I,在激发光照射下产生荧光,通过监测荧光强度而监测PCR物量,在病原体检测中广泛应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种灵敏快速、操作便捷的一步法荧光定量RT-PCR检测罗氏沼虾野田村病毒的引物及试剂盒。
为解决上述技术问题,本发明采用以下技术方案:一步法荧光定量RT-PCR检测罗氏沼虾野田村病毒的引物,包括上游引物MrNV-QF1和下游引物MrNV-QR1,它们分别具有以下的碱基序列:
上游引物MrNV-QF1:5'-ATTTAGATTGGGTCTGTGGA-3'(序列表SEQ.ID.No.1),
下游引物MrNV-QR1:5'-GTTGAGTTCTGTTGGTGGA-3'(序列表SEQ.ID.No.2)。
一步法荧光定量RT-PCR检测罗氏沼虾野田村病毒的试剂盒,包括含有上游引物MrNV-QF1和下游引物MrNV-QR1的一步法荧光定量RT-PCR反应液,它们分别具有以下的碱基序列:
上游引物MrNV-QF1:5'-ATTTAGATTGGGTCTGTGGA-3',
下游引物MrNV-QR1:5'-GTTGAGTTCTGTTGGTGGA-3'。
该试剂盒含有以下试剂:
(1)一步法荧光定量RT-PCR反应液(A液);
(2)阳性对照(P液),含MrNV基因的RNA片段;
(3)阴性对照(N液),不含MrNV基因的RNA片段;
(4)工作标准品;
一步法荧光定量RT-PCR反应液由2×One StepRT-PCR Buffer,PrimeScript 1 step Enzyme Mix,上、下游引物,ROX Reference Dye II(50X),H2O组成。
一步法荧光定量RT-PCR反应液共2.3mL,每剂反应液为23μL,由2×One StepRT-PCR Bμffer 12.5μL,PrimeScript 1 step Enzyme Mix 1.0μL,浓度为10μmol/L的上、下游引物各1.0μL,ROX Reference Dye II(50X)0.5μL,H2O 7.0μL组成。
阳性对照和阴性对照各200μL。
工作标准品包括含有1×108(B1液)、1×107(B2液)、1×106(B3液)、1×105(B4液)、1×104(B5液)、1×103(B6液)、1×102(B7液)、1×101(B8液)拷贝/μL的标准品RNA各200μL。
针对目前缺乏对罗氏沼虾野田村病毒(MrNV)及其所致罗氏沼虾白尾病(WTD)进行检测和诊断的有效可靠的技术,发明人研究筛选了特异性的引物(上游引物MrNV-QF1和下游引物MrNV-QR1),据此建立了一步法荧光定量RT-PCR检测罗氏沼虾野田村病毒的检测方法,并制备了相应的检测试剂盒。本发明检测方法及其试剂盒应用于MrNV的检测,无需将反转录和PCR反应分开,操作便捷且灵敏快速,有利于快速检测MrNV及防控WTD。
附图说明
图1是标准品RNA一步法荧光定量RT-PCR曲线,图中1-3、4-6、7-9、10-12、13-15、16-18、19-21、22-24分别表示标准品RNA为1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101copies/μL的扩增曲线;25:阴性对照;26:空白对照。
图2是标准品RNA一步法荧光定量RT-PCR的标准曲线。
图3是标准品RNA一步法荧光定量RT-PCR的融解曲线,图中1-24表示标准品RNA(1×108~1×101拷贝/μL,每个浓度做3个平行)的溶解曲线;25:阴性对照;26:空白对照
图4是一步法荧光定量RT-PCR特异性试验结果图,图中扩增曲线分别为:1:MrNV;2:TSV;3:WSSV;4:IHHNV;5:阴性对照;6:空白对照
具体实施方式
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法;所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。具体所用材料和试剂如下:
QIAamp Viral RNA Mini Kit购自QIAGEN公司;One StepPrimeScriptTMRT-PCR Kit II购自宝生物工程(大连)有限公司;荧光定量PCR仪为安捷伦公司的Mx3005P;pGM-T载体购自北京天根生化科技有限公司;DNaseⅠ、T7体外转录试剂盒购自Fermentas;2×Taq PCR Master Mix、质粒小量提取试剂盒、琼脂糖凝胶快速回收DNA试剂盒购自北京艾德莱生物技术有限公司。
罗氏沼虾野田村病毒(MrNV)记载在《罗氏沼虾诺达病毒套式RT-PCR检测方法的建立及初步应用》,上海海洋大学学报,2012,21(1):54-59,公众可从广西水产科学研究院获得。
桃拉综合征病毒(TSV)记载在《对虾Taura综合征病毒RT-PCT检测方法的改进及应用》,上海水产大学学报,2008,17(5):525-529,公众可从广西水产科学研究院获得。
白斑综合征病毒(WSSV)记载在《凡纳滨对虾白斑综合征病毒广西株变异区基因的比较分析》,病毒学报,2014,30(1):51-56,公众可从广西水产科学研究院获得。
传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)记载在《广西凡纳滨对虾IHHNV感染情况的调查与分析》,南方农业学报,2013,44(12):2089-2093,公众可从广西水产科学研究院获得。
实施例1、引物设计与合成
根据MrNV基因序列(GenBank No.HQ287005)的保守区域设计一对特异性引物,上游引物MrNV-QF1:5'-ATTTAGATTGGGTCTGTGGA-3',下游引物MrNV-QR1:5'-GTTGAGTTCTGTTGGTGGA-3',预期扩增片段大小为119bp,由宝生物工程(大连)有限公司合成,用DEPC处理水稀释至20pmol/μl,-20℃保存备用。
实施例2、一步法荧光定量RT-PCR检测方法的建立
(1)样品的制备
取50~100mg待检虾苗或成虾的鳃丝、肌肉组织,加500μl TN缓冲液(20mM Tris/HCl,0.4M NaCl,pH 7.4)匀浆,离心取上清。采用RNA提取试剂盒(QIAamp Viral RNA MiniKit)按其说明书提取罗氏沼虾野田村病毒总RNA,用核酸蛋白测定仪测定病毒RNA纯度及浓度,保存于-80℃备用。
(2)标准品的制备
以事先构建保存的质粒为模板扩增出MrNV衣壳蛋白基因片段,克隆入pGM-T载体,经鉴定阳性后提取质粒DNA单酶切线性化,纯化回收产物按T7体外转录试剂盒说明进行体外转录获得阳性模板RNA。测定RNA浓度和纯度,换算成拷贝数是3.2×1010拷贝/μL,并稀释成1×108~1×101拷贝/μL 8个梯度作为标准品。
(3)引物浓度确定
以相同浓度的标准品RNA为模板,将引物终浓度在0.1~0.8μmol/L之间进行一步法荧光定量RT-PCR,当引物终浓度为0.4μmol/L时,一步法SYBR Green I荧光定量RT-PCR对标准品RNA的检测可获得较小的Ct值且无非特异性扩增,确定反应体系中引物终浓度为0.4μmol/L。
(4)标准曲线建立(图1-3)
以已知拷贝数的标准品RNA(1×108~1×101拷贝/μL)为模板进行一步法SYBRGreen I荧光定量RT-PCR,每个梯度做三个平行,25μL体系中加入:2×One StepRT-PCR Buffer 12.5μL,PrimeScript 1 step Enzyme Mix 1.0μL,上下游引物(10μmol/L)各1.0μL,ROX Reference Dye II(50X)0.5μL,RNA 2.0μL,H2O 7.0μL,同时设以健康无MrNV罗氏沼虾肌肉组织RNA和灭菌DEPC水为模板的阴性对照和空白对照。反应条件参照试剂说明进行一步法,反转录反应:42℃15min,95℃10s;PCR反应:40个循环,95℃5s,60℃45s;融解曲线分析:95℃1min,55℃30s,然后以0.01℃/秒逐渐升温到95℃并全程采集荧光信号,最后95℃30s结束,根据融解曲线判断反应的特异性。
结果,一步法SYBR Green I荧光定量RT-PCR对标准品RNA(1×108~1×101拷贝/μL)的扩增曲线呈现明显的S型,而阴性对照和空白对照均没有出现扩增,反应动力学范围达8个数量级,标准品RNA为1×108拷贝时,Ct值最小,为10.5;标准品RNA为10拷贝时,Ct值约为34.5,灵敏度较高,可检测到相当于10个拷贝数的病毒粒子。利用仪器数据分析软件进行分析可得标准曲线:Y=-3.391×LOG(X)+37.98,Eff.(扩增效率)和RSq(相关系数方值)分别为97.2%和1.000,起始模板浓度的对数与Ct值之间呈良好的线性关系。融解曲线只有单一的波峰,产物Tm值均一,在81.17~81.25℃之间,未见有引物二聚体形成及其他非特异扩增,引物具有很好的特异性。可见,建立的标准曲线能够准确地反映目的产物的扩增。
检测中以Ct值34为界限,若检测样品有“S”型扩增曲线,且Ct值≤34,则检测样品可判断为MrNV阳性,否则样品判断为MrNV阴性。
(5)特异性试验(图4)
以MrNV、TSV、WSSV及IHHNV 4种病毒的核酸为模板,并设以健康无MrNV罗氏沼虾肌肉组织RNA和灭菌DEPC处理水为模板的阴性对照和空白对照,相同条件下同时进行一步法SYBR Green I荧光定量RT-PCR,结果只有MrNV出现阳性扩增曲线,而TSV、WSSV及IHHNV 3种病毒未出现扩增曲线,具有MrNV检测特异性。
实施例3、检测试剂盒的组装
根据实施例1和2的研究结果,组装检测试剂盒以方便使用。该试剂盒含有以下试剂:
(1)一步法荧光定量RT-PCR反应液(A液):共2.3mL,每剂反应液为23μL,由2×OneStepRT-PCR Buffer 12.5μL,PrimeScript 1 step Enzyme Mix 1.0μL,浓度为10μmol/L的上、下游引物各1.0μL,ROX Reference Dye II(50X)0.5μL,H2O 7.0μL组成。
(2)阳性对照(P液):含MrNV基因的RNA片段,200μL;
(3)阴性对照(N液):不含MrNV基因的RNA片段,200μL;
(4)工作标准品:包括含有1×108(B1液)、1×107(B2液)、1×106(B3液)、1×105(B4液)、1×104(B5液)、1×103(B6液)、1×102(B7液)、1×101(B8液)拷贝/μL的标准品RNA各200μL。
按25μL体系计算,试剂盒含量可用于100份样检测,以单样份计量,25μL体系中含有的反应液(A液)23μL,使用时25μL体系取A液23μL加入2μL RNA。
试剂盒的稳定性
将试剂盒保存于-20℃,选取B3液、B4液和B5液三个浓度的标准品RNA分别在间隔10天和第20天进行一步法SYBR Green I荧光定量RT-PCR试验,每个浓度做3个重复,计算Ct值的变异系数,验证试剂盒的稳定性和重复性,经过数据分析得到组内及组间的变异系数,组内试验Ct值变异系数为0.15%~0.83%,组间实验Ct值变异系数为0.56%~0.95%,一步法SYBR Green I荧光定量RT-PCR试剂盒具有良好的重复性和稳定性。
表1试剂盒的稳定性试验结果
Claims (6)
1.一步法荧光定量RT-PCR检测罗氏沼虾野田村病毒的引物,其特征在于包括上游引物MrNV-QF1和下游引物MrNV-QR1,它们分别具有以下的碱基序列:
上游引物MrNV-QF1:5'-ATTTAGATTGGGTCTGTGGA-3',
下游引物MrNV-QR1:5'-GTTGAGTTCTGTTGGTGGA-3'。
2.一步法荧光定量RT-PCR检测罗氏沼虾野田村病毒的试剂盒,其特征在于包括含有上游引物MrNV-QF1和下游引物MrNV-QR1的一步法荧光定量RT-PCR反应液,它们分别具有以下的碱基序列:
上游引物MrNV-QF1:5'-ATTTAGATTGGGTCTGTGGA-3',
下游引物MrNV-QR1:5'-GTTGAGTTCTGTTGGTGGA-3';
该试剂盒具体含有以下试剂:
(1)一步法荧光定量RT-PCR反应液;
(2)阳性对照,含MrNV基因的RNA片段;
(3)阴性对照,不含MrNV基因的RNA片段;
(4)工作标准品。
3.根据权利要求2所述的一步法荧光定量RT-PCR检测罗氏沼虾野田村病毒的试剂盒,其特征在于:所述一步法荧光定量RT-PCR反应液由2×One Step RT-PCR Buffer,PrimeScript 1 step Enzyme Mix,上、下游引物,ROX Reference Dye II(50X),H2O组成。
4.根据权利要求3所述的一步法荧光定量RT-PCR检测罗氏沼虾野田村病毒的试剂盒,其特征在于:所述一步法荧光定量RT-PCR反应液共2.3mL,每剂反应液为23μL,由2×OneStepRT-PCR Buffer 12.5μL,PrimeScript 1 step Enzyme Mix 1.0μL,浓度为10μmol/L的上、下游引物各1.0μL,ROX Reference Dye II(50X)0.5μL,H2O 7.0μL组成。
5.根据权利要求3所述的一步法荧光定量RT-PCR检测罗氏沼虾野田村病毒的试剂盒,其特征在于:所述阳性对照和阴性对照各200μL。
6.根据权利要求3所述的一步法荧光定量RT-PCR检测罗氏沼虾野田村病毒的试剂盒,其特征在于:所述工作标准品包括含有1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝/μL的标准品RNA各200μL。
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