CN103122393A

CN103122393A - 罗氏沼虾野田村病毒检测试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN103122393A
Application number: CN2012105024179A
Authority: CN
Inventors: 石坚; 钱东; 林峰; 宋之琦; 徐锦余
Original assignee: ZHEJIANG PINGHU AQUATIC PRODUCT TECHNOLOGY PROMOTION STATION; HANGZHOU SANHE CHUANGXIN TECHNOLOGY Co Ltd; Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries
Current assignee: ZHEJIANG PINGHU AQUATIC PRODUCT TECHNOLOGY PROMOTION STATION; HANGZHOU SANHE CHUANGXIN TECHNOLOGY Co Ltd; Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries
Priority date: 2012-11-30
Filing date: 2012-11-30
Publication date: 2013-05-29

Abstract

本发明公开了一种罗氏沼虾野田村病毒检测试剂盒及检测方法。本发明的试剂盒结合了等温扩增和核酸试纸条快速检测的特点，检测过程无需昂贵的仪器设备；采用核酸试纸条方法进行显色，提高了检测可靠性和结果易判断性。本试剂盒检测成本低、使用方便，对人和环境安全，可替代已有的相关检测方法。本发明的试剂盒可在野外生产现场和各级实验室使用，对加强罗氏沼虾野田村病毒监测，及时发现并控制感染病毒沼虾个体传播、尽早发现并预防疫病大规模暴发流行等，具有推广应用价值。

Description

罗氏沼虾野田村病毒检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及一种用于检测水产养殖中相关病毒的检测试剂盒及检测方法，尤其涉及检测罗氏沼虾野田村病毒的检测试剂盒及检测方法。

背景技术

罗氏沼虾亦称马来西亚大虾、金钱虾等，分类上属于十足目、长臂虾科、沼虾属，素有淡水沼虾虾王之称。原产于印度太平洋地区在厄瓜多尔沿岸，是目前世界上养殖量最高的三大虾种之一。至2010年，全球罗氏沼虾产量已达20万吨以上，成为全球养殖产量最高的淡水虾类，其中我国养殖产量达10余万吨，是世界最大的罗氏沼虾养殖国。

2001年前后，我国罗氏沼虾主要产区暴发了一种新的疾病，称为罗氏沼虾肌肉白浊病或罗氏沼虾白体病，现统称罗氏沼虾白尾病。该病曾在浙江、江苏、上海、广东、广西等地出现大规模流行、蔓延，是罗氏沼虾主要疾病。该病由罗氏沼虾野田村病毒感染引起，主要危害罗氏沼虾淡化苗。患病虾苗出现肌肉不透明或白斑、白浊、全身发白，主要发生于幼体变态为仔虾后，病虾可在几天内死亡，对于高密度养殖的育苗池，死亡率可高达40%~90%，严重时可使育苗场虾苗全部死亡。

该病发病急、死亡率高，给许多养殖场及育苗场造成巨大的损失，最早发生于我国及东南亚罗氏沼虾主要罗氏沼虾主要养殖国，并同时发生于中北美洲主要罗氏沼虾养殖国，成为罗氏沼虾养殖极大威胁。我国在2008年将该病列为水生动物二类疫病，世界动物卫生组织也将该病列为必须上报的水生动物疫病。

目前已经建立了数种罗氏沼虾野田村病毒检测方法，包括病毒电镜观察、核酸电泳法，Dot-blot原位杂交及RT-PCR技术、基于单抗的TAS-ELISA和基于小鼠多抗血清的双夹心ELISA等，应用于罗氏沼虾野田村病毒感染疾病检测中。

电子显微镜技术虽可直接观察病毒粒子，但操作复杂、耗时长、准确性低；抗体检测法检测罗氏沼虾野田村病毒虽已作为OIE推荐性方法，但灵敏度不够理想，通常无法检测未发生病症的潜在病毒携带虾；罗氏沼虾野田村病毒RT-PCR检测法虽灵敏度较好，但对实验室和操作人员有较高的要求，无法实现罗氏沼虾野田村病毒的相对快速、准确检测，更无法实现病毒的现场快速检测，大大限制了RT-PCR检测方法在生产中的推广应用。

因此，建立简单、快速、高灵敏检测方法，开发适于现场应用的罗氏沼虾野田村病毒检测试剂盒就显得更为重要和紧迫。

发明内容

鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明目的是提供一种用于检测罗氏沼虾野田村病毒的快速检测方法及与其配套的检测试剂盒，以弥补现有技术的不足，使之适用于生产现场快速、准确、高灵敏度的检测罗氏沼虾野田村病毒。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：罗氏沼虾野田村病毒检测试剂盒，其包括含有1至2对引物的扩增反应液；引物选自下组：

F1:5’-tagatatgttcctgcagtacc-3’ SEQ ID NO:11

R1:5’-tcacttgcaagaggtaaaat-3’ SEQ ID NO:12

F2:5’-acttgtgacgtagcctgcctttttgatacaaatccactagatgacc-3’ SEQ ID NO:13

R2:5’-cgcggcagtggaatttctctttttgatcatcacgcctgacaa-3’ SEQ ID NO:14

优选扩增反应液还含有选自下组的引物作为检测探针：

F3:FITC- 5’-catcgaggattacgttgg-3’ SEQ ID NO:21

R3:BIOTIN-5’-gcttgccaacttattggtt-3’ SEQ ID NO:22

更优选还含有阳性对照品；阳性对照品的核苷酸序列为

gatatg ttcctgcagt acccaatact ttagcttgcc aacttattgg ttacatcgat acagatccac tagatgaccc taacgttatc ctcgatgttg atcagttact taggcaggct acgtcacaag tgggtgcgcg gcagtggaat ttctctgata caacaactat tccattgatt gtcaggcgtg atgatcaatt gtactatact ggtcaagata aagagaatgt tcgtttctct caacagggtg tattttacct cttgcaagtg a SEQ ID NO:3。

其中，还可含有阴性对照品；阴性对照品为超纯水或鲑鱼精DNA。

本发明还相应的提供了罗氏沼虾野田村病毒检测方法，其包括下列步骤：

抽提步骤：抽提样品的RNA；

扩增步骤：用含有1至2对引物的扩增反应液扩增模板；同时在同一个PCR管中进行扩增产物与检测探针的杂交；检测步骤：检测杂交结果；

引物选自下组：

F1:5’-tagatatgttcctgcagtacc-3’ SEQ ID NO:11

R1:5’-tcacttgcaagaggtaaaat-3’ SEQ ID NO:12

F2;5’-acttgtgacgtagcctgcctttttgatacaaatccactagatgacc-3’ SEQ ID NO:13

R2:5’-cgcggcagtggaatttctctttttgatcatcacgcctgacaa-3’ SEQ ID NO:14

检测探针选自下组：

F3:FITC- 5’catcgaggattacgttgg-3’ SEQ ID NO:21

R3:BIOTIN-5’gcttgccaacttattggtt-3’ SEQ ID NO:22

其中，作为优化方案，抽提步骤优选如下步骤，

（a）取样品0.02~0.2g置于采样管中，用研磨棒将样品磨碎至浆状；

（b）取上述体积为N的浆状的样品中加入1~2N体积的裂解液和0.01N体积的蛋白酶K溶液，60℃水浴5~30分钟；

（c）将上述样品液转移至样品富集柱中，6000 ~ 12000 RPM离心1~5分钟，弃滤液；

（d）加入0.2~1毫升样品清洗液至样品富集柱中，6000 ~ 12000 RPM离心1~5分钟，弃滤液；

（e）加入0.2~1毫升核酸洗脱液至样品富集柱中，静置1~5分钟，6000 ~ 12000 RPM离心1~5分钟，收集滤液；

（f）取3~6微升滤液加入到扩增检测管内，将扩增检测管置于55~65℃条件下保温40~70min；

（g）取3~6微升反应产物加到检测试纸条样品垫上，滴加2~4滴缓冲液，室温静置1~5分钟观察结果。T线出现，共两条带为阳性，T线不出现为阴性。进一步的，可以采用增加上述阳性对照品和阴性品对照增加检测的准确性。

本发明的试剂盒可以整合包括罗氏沼虾野田村病毒快速检测所需的核酸快速提取、恒温扩增反应液、核酸检测试纸条等试剂和器材，使罗氏沼虾野田村病毒检测能够快速有序进行，实现了检测过程的程序化和标准化。依据罗氏沼虾野田村病毒RNA-2片段中的衣壳蛋白保守区序列所设计的扩增引物能有效检测罗氏沼虾野田村病毒的所有毒株，而与其他病毒的衣壳蛋白又无同源性，多对引物的相互作用使检测特异性高。反应结束以后可以通过使用核酸检测试纸条进行快速检测，检测结果直观明了，有利于结果的判读，有利于保证检测结果的可靠性。本发明在恒温扩增反应液中将目的核酸的反转录和扩增结合起来同步进行，节省了时间，仅需1.5~2小时就可完成罗氏沼虾野田村病毒的检测；并且检测过程无需昂贵的仪器设备如PCR仪和凝胶成像系统，仅需水浴锅或金属浴甚至更简单的保温装置即可；而且检测结果非常容易判别。

与罗氏沼虾野田村病毒已有检测技术相比，本发明的检测灵敏度极高，可以代替罗氏沼虾野田村病毒之前的相关检测方法如病理切片法、电镜观察法、抗体检测法和RT-PCR检测法；本发明的检测试剂盒不仅可在实验室内使用，也可在条件有限的野外的生产现场使用，对加强罗氏沼虾野田村病毒的流行病学监测和疾病防控意义重大，具有很高的推广应用价值。

具体实施方式

以下结合附实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1：

罗氏沼虾野田村病毒检测试剂盒，其包括含有引物的扩增反应液；成分为：扩增引物的上游引物F1和下游引物R1各1~2uM，扩增引物的上游引物F2和下游引物R2各0.1~0.4uM，扩增引物的检测探针F3和检测探针R3各0.1~0.4uM，dATP、dTTP、dGTP、dCTP各0.8~2.0mM，MgCl2 4~10 mM，甜菜碱0.6~1.2M，Tris-HCL 10~40 mM，KCl 10~20 mM，MgSO₄ 1~4 mM，（NH₄）₂SO₄ 6~12 mM，Triton X-100 0.5%~1.0%，反转录酶1~20u，具有链置换活性的DNA聚合酶2~20u。

引物优选如下：

上游引物F1：5’-tagatatgttcctgcagtacc-3’ SEQ ID NO:11

下游引物R1：5’-tcacttgcaagaggtaaaat-3’ SEQ ID NO:12

上游引物F2：

5’-acttgtgacgtagcctgcctttttgatacaaatccactagatgacc-3’ SEQ ID NO:13

下游引物R2：

5’-cgcggcagtggaatttctctttttgatcatcacgcctgacaa-3’ SEQ ID NO:14

扩增反应液还含有选自下组的检测探针：

F3:FITC- 5’-catcgaggattacgttgg-3’ SEQ ID NO:21

R3:BIOTIN-5’-gcttgccaacttattggtt-3’ SEQ ID NO:22

还含有阳性对照品；阳性对照品的核苷酸序列为

为了进一步方便观察检测结果，还含有阴性对照品；阴性对照品为超纯水或鲑鱼精DNA。本实施例优选超纯水。

抽提步骤：抽提样品的RNA；

扩增步骤：用含有1至2对引物的扩增反应液扩增模板；同时在同一个PCR管中进行扩增产物与检测探针的杂交；

检测步骤：检测杂交结果；

其中，作为优化方案，抽提步骤优选如下步骤，

（c）将上述样品液转移至样品富集柱中，6000~12000RPM离心1~5分钟，弃滤液；

（d）加入0.2~1毫升样品清洗液至样品富集柱中，6000~12000RPM离心1~5分钟，弃滤液；

（e）加入0.2~1毫升核酸洗脱液至样品富集柱中，静置1~5分钟，6000~12000RPM离心1~5分钟，收集滤液；

（f）取3~6微升滤液加入到含有扩增反应液的PCR管内，将扩增检测管置于55~65℃条件下保温40~70min；

（g）取3~6微升反应产物加到检测试纸条样品垫上，滴加2~4滴缓冲液，室温静置1~5分钟观察结果。核酸检测试纸条可选用Milenia_ GenLine HybriDetect和杭州Ustar公司的核酸检测试纸条等具有类似检测功能的试纸。T线出现，共两条带为阳性，T线不出现为阴性。进一步的，可以采用增加上述阳性对照品和阴性品对照增加检测的准确性。

实施例2：

一种用于检测罗氏沼虾野田村病毒的试剂盒，包括：

样品裂解液；（溶液配置方法为：60~240g GuSCN溶于50~200mL 0.1mol/L Tris-HCl（pH6.4）中，加入10~40mL 0.2mol/L EDTA, pH8.0和2~6mL TritonX-100混匀即可）

蛋白酶K；(配制含50mmol/L TRIS-CL（PH8.0），1.5mmol/L乙酸钙和50%甘油的溶液，高压灭菌后，该混合溶液溶解蛋白酶K粉末至浓度为20mg/ml，将配制的蛋白酶K溶液-20度保存。)

样品清洗液；（溶液成分为：50~85%的乙醇以及终浓度为3~300mmol/L的乙酸钠）

核酸洗脱液；(20mmol/L的TE溶液)

样品富集柱；（市场外购）

恒温扩增反应液；（成分如下）：扩增引物的上游引物F1和下游引物R1各1~2uM，扩增引物的上游引物F2和下游引物R2各0.1~0.4uM，扩增引物的检测探针F3和检测探针R3各0.1~0.4uM，dATP、dTTP、dGTP、dCTP各0.8~2.0mM，MgCl2 4~10 mM，甜菜碱0.6~1.2M，Tris-HCL 10~40 mM，KCl 10~20 mM，MgSO₄ 1~4 mM，（NH₄）₂SO₄ 6~12 mM，Triton X-100 0.5%~1.0%，反转录酶1~20u，具有链置换活性的DNA聚合酶2~20u。

对照品（包括阳性和阴性对照品）；阳性对照为人工合成的核苷酸，序列为gatatg ttcctgcagt acccaatact ttagcttgcc aacttattgg ttacatcgat acagatccac tagatgaccc taacgttatc ctcgatgttg atcagttact taggcaggct acgtcacaag tgggtgcgcg gcagtggaat ttctctgata caacaactat tccattgatt gtcaggcgtg atgatcaatt gtactatact ggtcaagata aagagaatgt tcgtttctct caacagggtg tattttacct cttgcaagtg a SEQ ID NO:3，浓度为500～100000拷贝/毫升，每个试剂盒中为5~200微升。阴性对照为超纯水或鲑鱼精DNA。

超纯水；

核酸检测试纸条及其缓冲液；核酸检测试纸条可选用Milenia_ GenLine HybriDetect和杭州Ustar公司的核酸检测试纸条等具有类似检测功能的试纸。

本发明的检测试剂盒，上述扩增反应液中扩增引物的核酸序列是：

上游引物F1：5’-tagatatgttcctgcagtacc-3’ SEQ ID NO:11

下游引物R1：5’-tcacttgcaagaggtaaaat-3’ SEQ ID NO:12

上游引物F2：5’-acttgtgacgtagcctgcctttttgatacaaatccactagatgacc-3’ SEQ ID NO:13

下游引物R2：5’-cgcggcagtggaatttctctttttgatcatcacgcctgacaa-3’ SEQ ID NO:14

检测探针F3：FITC- 5’catcgaggattacgttgg-3’ SEQ ID NO:21

检测探针R3：BIOTIN- 5’gcttgccaacttattggtt-3’ SEQ ID NO:22。

相关的所有引物由引物合成的专业公司进行合成，均为人工合成的核酸片段。

应用本发明试剂盒的相应检测方法，步骤如下：

取样品0.02~0.2g置于采样管中，用研磨棒将样品磨碎至浆状，体积为N；

用上述浆状样品中加入1~2N体积的裂解液和0.01N体积的蛋白酶K溶液，60℃水浴5～30分钟；

将上述样品液转移至样品富集柱中，6000~12000RPM离心1~5分钟，弃滤液；

加入0.2~1毫升样品清洗液至样品富集柱中，6000~12000RPM离心1~5分钟，弃滤液；

加入0.2~1毫升核酸洗脱液至样品富集柱中，静置1~5分钟，6000~12000RPM离心1～5分钟，收集滤液；

取3～6微升滤液加入到含有扩增反应液的PCR管内，将扩增检测管置于55~65℃条件下保温40~70min；

取3～6微升反应产物加到检测试纸条样品垫上，滴加2~4滴缓冲液，室温静置1～5分钟观察结果。T线出现，共两条带为阳性，T线不出现为阴性。

实施例3：

根据实施例1、2，本实施例具体公布一种使用方式，由于篇幅所限，配方、序列等在此不在赘述。

1．样品处理：取50～100mg待测组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml离心管中，加入1ml Trizol充分匀浆，室温静置５min。

2．加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。

3． 4℃离心，12000g×15min，取上清。

4．加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。

5． 4℃离心，12000g×10min，弃上清。

6．加入1ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g×5min，弃上清。

7．晾干，加入适量的DEPC H2O溶解（65℃促溶10～15min）。

8．恒温扩增：取4ul样本加入含有扩增反应液的PCR管内，65℃反应40分钟。

9．结果检测：取8ul扩增产物，滴加于检测试纸条的样品垫上。将含有产物的试纸条放入含有100~200ul的2ml平底小离心管中。

10．结果判读：在试纸条上出现两条红色的带为阳性，说明样品中含有罗氏沼虾野田村病毒核酸；在试纸条上只出现一条红色的条带为阴性，说明样品中不含有罗氏沼虾野田村病毒核酸；在试纸条上无任何明显条带，说明反应无效，请重做反应。

罗氏沼虾野田村病毒罗氏沼虾野田村病毒罗氏沼虾野田村病毒罗氏沼虾野田村病毒

使用含有硅胶膜的核酸快速富集体系，大大缩短了样品核酸的制备时间，同时保证了样品的纯度，有利于恒温扩增反应的进行。

尽管已结合优选的实施例描述了本发明，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，能够对在这里列出的主题实施各种改变、同等物的置换和修改，因此本发明的保护范围当视所提出的权利要求限定的范围为准。

<110> 杭州三合创新科技有限公司

<120> 罗氏沼虾野田村病毒检测试剂盒及检测方法

<130> SANHOO-001

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tagatatgtt cctgcagtac c 21

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tcacttgcaa gaggtaaaat 20

<210> 13

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

acttgtgacg tagcctgcct ttttgataca aatccactag atgacc 46

<210> 14

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cgcggcagtg gaatttctct ttttgatcat cacgcctgac aa 42

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

catcgaggat tacgttgg 18

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gcttgccaac ttattggtt 19

<210> 3

<211> 267

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gatatgttcc tgcagtaccc aatactttag cttgccaact tattggttac atcgatacag 60

atccactaga tgaccctaac gttatcctcg atgttgatca gttacttagg caggctacgt 120

cacaagtggg tgcgcggcag tggaatttct ctgatacaac aactattcca ttgattgtca 180

ggcgtgatga tcaattgtac tatactggtc aagataaaga gaatgttcgt ttctctcaac 240

agggtgtatt ttacctcttg caagtga 267

Claims

1.罗氏沼虾野田村病毒检测试剂盒，其特征是：包括含有1至2对引物的扩增反应液；所述的引物选自下组：

F1:5’-tagatatgttcctgcagtacc-3’ SEQ ID NO:11

R1:5’-tcacttgcaagaggtaaaat-3’ SEQ ID NO:12

F2:5’-acttgtgacgtagcctgcctttttgatacaaatccactagatgacc-3’ SEQ ID NO:13

R2:5’-cgcggcagtggaatttctctttttgatcatcacgcctgacaa-3’ SEQ ID NO:14。

2. 根据权利要求1所述的罗氏沼虾野田村病毒检测试剂盒，其特征是：所述的扩增反应液还含有选自下组的检测探针：

F3:FITC- 5’-catcgaggattacgttgg-3’ SEQ ID NO:21

R3:BIOTIN-5’-gcttgccaacttattggtt-3’ SEQ ID NO:22。

3. 根据权利要求1或2所述的罗氏沼虾野田村病毒检测试剂盒，其特征是：还含有阳性对照品；所述的阳性对照品的核苷酸序列为：

4. 罗氏沼虾野田村病毒检测方法，其特征是包括下列步骤：

抽提步骤：抽提样品的RNA；

扩增步骤：用含有1至2对引物的扩增反应液扩增模板；在同一个PCR管中进行扩增产物与检测探针的杂交；

检测步骤：检测杂交结果；

所述的引物选自下组：

F1:5’-tagatatgttcctgcagtacc-3’ SEQ ID NO:11

R1:5’-tcacttgcaagaggtaaaat-3’ SEQ ID NO:12

F2:5’-acttgtgacgtagcctgcctttttgatacaaatccactagatgacc-3’ SEQ ID NO:13

R2:5’-cgcggcagtggaatttctctttttgatcatcacgcctgacaa-3’ SEQ ID NO:14

所述的检测探针选自下组：

F3:FITC- 5’-catcgaggattacgttgg-3’ SEQ ID NO:21

R3:BIOTIN-5’-gcttgccaacttattggtt-3’ SEQ ID NO:22。

5. 根据权利要求4所述的罗氏沼虾野田村病毒检测方法，其特征是所述的抽提步骤包括如下步骤：

（f）取3~6微升滤液加入到含有扩增反应液的PCR管内，将PCR管置于55~65℃条件下保温40~70min；

（g）取3~6微升反应产物加到检测试纸条样品垫上，滴加2~4滴缓冲液，室温静置1~5分钟观察结果。