CN103409556A

CN103409556A - 罗氏沼虾野田村病毒nasba-lfd检测方法及其检测试剂盒

Info

Publication number: CN103409556A
Application number: CN2013103053970A
Authority: CN
Inventors: 林锋; 沈锦玉; 刘莉; 钱冬; 曹铮; 王军毅; 郝贵杰; 盛鹏程; 袁雪梅; 吴颖蕾
Original assignee: Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries
Current assignee: Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries
Priority date: 2013-07-19
Filing date: 2013-07-19
Publication date: 2013-11-27
Anticipated expiration: 2033-07-19
Also published as: CN103409556B

Abstract

本发明公开了一种罗氏沼虾野田村病毒NASBA-LFD检测方法及其检测试剂盒。本发明是根据GenBank上公布的罗氏沼虾野田村病毒（MrNV）序列，筛选保守区域设计了MrNV NASBA-LFD反应体系所需的引物与探针；采用本发明人配制的组织RNA提取试剂提取待检样品RNA，再利用本发明建立的MrNV NASBA反应体系进行检测，在反应结束后依据核酸快速检测试纸判定结果。与现在该病毒的常用检测技术相比，本发明具有简便快速、特异性好、灵敏度高的特点，可用于生产一线的技术人员和养殖户现场使用，有利于罗氏沼虾白体病的诊断预防与病原阻断。

Description

罗氏沼虾野田村病毒NASBA-LFD检测方法及其检测试剂盒

技术领域

本发明涉及水生动物病毒检测领域，特别涉及一种罗氏沼虾野田村病毒NASBA-LFD检测方法及其检测试剂盒。

背景技术

罗氏沼虾白体病(white tail disease, WTD)，又称白尾病，是由罗氏沼虾野田村病毒（Macrobrachium rosenbergii Nodavirus, MrNV）引起的一种主要危害罗氏沼虾淡化苗，以病虾肌肉出现白斑、白浊或全身发白为特征的传染病，死亡率最高达100%，对罗氏沼虾养殖业造成极大的危害。目前，WTD是世界性的罗氏沼虾疾病，该病已被列为OIE申报疫病和我国水生动物二类疫病。

研究表明，罗氏沼虾野田村病毒颗粒为均匀对称的20面体结构，表面光滑，无囊膜，直径为26-27nm,由两个RNA片段组成，其序列已测定并在GeneBank上登录（登录号分别为AY222839，AY222840）。目前该病毒的检测方法有电镜法、RT-PCR检测法、TAS-ELISA检测法等，但在实际检测工作中，现有的检测技术存在以下问题：一是灵敏度不够，无法检测到潜伏感毒样品；二是容易产生假阳性，对模板质量要求高；三是操作繁琐，对实验条件要求高，不利于养殖户和一线生产技术人员来操作。

NASBA（Nuclear acid sequence-based amplification，核酸依赖性扩增检测技术）是一项以RNA模板进行等温核酸扩增并能实时观测结果的检测方法。该技术的检测反应有赖于AMV逆转录酶、噬菌体T7RNA多聚酶、核糖核酸酶H、两种特别设计的特异性寡核苷酸引物和分子信标探针共同协作而完成。这种由一对特异的引物介导的、三种酶催化的以单链RNA 为模板的恒温扩增技术，反应在41℃左右进行，可以在1～2h左右将模板RNA扩增约10^9～12倍,不需特殊的仪器，具有操作简单、特异性强、灵敏度高、不易被污染等优点，目前已广泛应用于病毒、细菌、霉菌、寄生虫和细胞因子等的检测，特别是用于艾滋病病毒、丙肝肝炎病毒等RNA病毒的检测当中。在动物疫病预防控制方面，NASBA方法已成为诊断禽流感病毒的国家诊断标准方法之一（GB/T19440-2004禽流感病毒NASBA检测方法）。

侧向流层析试纸（lateral flow dipstick, LFD）是一种检测产物的新方法，利用反应体系中的FITC标记的探针与生物素标记的LAMP扩增产物特异性杂交，减少了电泳环节、染料颜色的人为目测差异以及由非特异性扩增造成的假阳性问题。LFD检测相对于其他检测手段，有操作简便且安全的特点。NASBA-LFD反应结果可以直接肉眼观察。LFD试纸上有质控带和检测带，两条带都显色表示阳性，只有质控带而检测带不显色表明检测结果为阴性。该方法具有安全、快捷、高效、高灵敏度且无高的实验条件要求，适合应用推广。目前，该技术在罗氏沼虾野田村病毒（MrNV）的检测中未见报道。

发明内容

本发明的目的在于是提供一种罗氏沼虾野田村病毒NASBA-LFD检测方法，应用核酸依赖性扩增技术结合色谱侧向层析试纸来检测罗氏沼虾野田村病毒，特异性强，敏感率高。

本发明另一目的在于提供一种用于上述方法的检测试剂盒，该试剂盒特异性强，灵敏度高，而且操作简便快捷，克服现有检测方法灵敏度不够高的问题，适合罗氏沼虾白体病的筛查与预防，以及发病虾苗的亲本溯源筛查。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种罗氏沼虾野田村病毒NASBA-LFD检测方法，包括如下步骤：

病毒RNA的提取：

（1）取20-30mg罗氏沼虾幼虾或成虾肌肉组织，加入350-500μL裂解液匀浆，离心；

（2）取步骤（1）离心所得上清液，与等体积的70%无水乙醇混合均匀后，将混合液与玻璃纤维素膜结合；

（3）依次用去蛋白液和漂洗液洗涤玻璃纤维素膜；

（4）用RNase free water（无核糖核酸酶水）洗脱玻璃纤维素膜上吸附的RNA；

NASBA扩增：

（5）配制预反应液，所述预反应液体积为16-21μL，包括：0.2-0.4μmol/L引物MrNV-P1F，0.2-0.4μmol/L引物MrNV-P1R， 0.1-0.2μmol/L 探针MrNV-FITC-PROBE，30-50mmol/L的 pH8.0-8.5Tris-HCl， 20-50mmol/L 氯化钾， 10-50 mmol/L 氯化镁，2-10mmol/L 二硫苏糖醇，10%-15% DMSO，1-2mmol/L dNTP，2-4mmol/L NTP，0.1-0.2μg/μL BSA，10-20U RNase 抑制剂，2-6U逆转录酶AMV，20-40U T7 RNA 聚合酶，0.1-0.3U RNaseH；

引物MrNV-P1F序列见SEQ ID NO：1，引物MrNV-P1R序列见SEQ ID NO：2，探针MrNV-FITC-PROBE序列见SEQ ID NO：3；

（6）在16-21μL预反应液中加入4-9μL步骤（4）所得 RNA作为模板，控制反应体系总体积为20-25μL，然后在40℃-42℃下反应60-120min；

LFD试纸检测：

（7）取步骤（6）所得NASBA扩增产物5-10μL滴到LFD试纸的点样处，然后在点样处前端滴上50-100μL缓冲液，5-15分钟后根据试纸条上的显色带判定检测结果。

本发明中所采用的检测方法是根据GenBank上公布的罗氏沼虾野田村病毒（MrNV）序列，筛选保守区域设计了MrNV NASBA-LFD反应体系所需的引物与探针；采用本发明人配制的组织RNA提取试剂提取待检样品RNA，再利用本发明建立的MrNV NASBA反应体系进行检测，在反应结束后依据核酸快速检测试纸判定结果。与现在该病毒的常用检测技术相比，本发明具有简便快速、特异性好、灵敏度高的特点，可用于生产一线的技术人员和养殖户现场使用，有利于罗氏沼虾白体病的诊断预防与病原阻断。

作为优选，所述裂解液包括浓度为30-60mmol/L 的pH7.3-7.6 Tris-HCL，浓度为3-6mol/L的异硫氰酸胍，以及浓度为5-10mmol/L EDTA。

作为优选，所述去蛋白液包括浓度为10-50mmol/L的pH7.3-7.6 Tris-HCL，浓度为0.4-0.6mol/L异硫氰酸胍，以及体积浓度为10-30%的无水乙醇。

作为优选，所述漂洗液包括浓度为10-50mmol/L的pH7.3-7.6 Tris-HCL，50-150mmol/L NaCl，以及体积浓度75%的无水乙醇。

作为优选，引物MrNV-P1F为5’端生物素标记引物；探针MrNV-FTIC-PROBE为5’端FITC标记探针。

一种罗氏沼虾野田村病毒NASBA-LFD检测试剂盒，包括NASBA扩增反应液，16-21μL的NASBA扩增反应液包括： 0.2-0.4μmol/L引物MrNV-P1F，0.2-0.4μmol/L引物MrNV-P1R， 0.1-0.2μmol/L 探针MrNV-FITC-PROBE，30-50mmol/L的 pH8.0-8.5Tris-HCl， 20-50mmol/L 氯化钾， 10-50 mmol/L 氯化镁，2-10mmol/L 二硫苏糖醇，10%-15% DMSO，1-2mmol/L dNTP，2-4mmol/L NTP，0.1-0.2μg/μL BSA，10-20U RNase 抑制剂，2-6U逆转录酶AMV，20-40U T7 RNA 聚合酶，0.1-0.3U RNaseH；

引物MrNV-P1F序列见SEQ ID NO：1，引物MrNV-P1R序列见SEQ ID NO：2，探针MrNV-FITC-PROBE序列见SEQ ID NO：3。

作为优选，罗氏沼虾野田村病毒NASBA-LFD检测试剂盒还配有LFD试纸用的缓冲液、阳性对照样品和阴性对照样品，其中LFD试纸用的缓冲液为1×TAE缓冲液，阳性对照样品为罗氏沼虾野田村病毒基因组RNA，阴性对照样品为无核酸的RNase free water。

本发明的有益效果是：

1、本发明所采用引物是利用软件Primer primier 5.0 针对MrNV衣壳蛋白基因的保守区域设计的，又有RNA的特异性探针相结合，特异性比常规PCR强。

2、本发明的检测试剂盒检测灵敏度高，是常规PCR的10⁴-10⁵倍,可以用于检测带毒亲本或幼苗。

3、本发明的检测试剂盒与常规的RT-PCR相比，检测时间短，可以在2h内获得检测结果，比常规PCR节约2-3小时。

4、本发明的检测试剂盒对仪器设备要求低，不需要普通PCR所用的PCR仪、凝胶电泳和成像系统。

5、本发明中的病毒RNA提取方法简单快捷，而且不用到氯仿、巯基乙醇等有害物质。

6、本发明的检测试剂盒操作步骤简单，结果直观易判定，处于生产一线的技术员和养殖户都可以按步骤指导进行操作。

7、本发明的检测试剂盒直接针对病毒RNA，不易造成阳性污染和环境污染。

附图说明

图1为扩增温度对NASBA反应的影响图。泳道1： 40℃恒温条件下扩增结果；泳道2：41℃恒温条件下扩增结果；泳道3: 42℃恒温条件下扩增结果。

图2为MrNV NASBA特异性实验结果图。M：DL2000 DNA Marker (TaKaRa公司)；泳道1：罗氏沼虾野田村病毒；泳道2：南美白对虾白斑综合症病毒（WSSV）；泳道3：草鱼呼肠孤病毒（GCRV）；泳道4：对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）；泳道5：对虾桃拉病毒（TSV）；泳道6：阴性对照。

图3为MrNV NASBA-LFD技术检测感染MrNV样品实验结果图。M：DL2000 DNA Marker(TaKaRa公司)；泳道1：MrNV样品NASBA反应120min检测结果；泳道2：MrNV样品NASBA反应90min检测结果；泳道3：MrNV样品NASBA反应60min检测结果；泳道4：为阴性对照样品检测结果。

图4为NASBA-LFD方法检测MrNV的敏感度实验图（A）和LFD试纸显色对比图(B)。M：DL2000 DNA Marker(TaKaRa公司)；A图泳道1～8：模板分别为10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8倍稀释的基因组RNA；泳道9：无模板对照；B图泳道1～9：为A图实验结果的LFD试纸检测图。

图5为利用常规 RT-PCR方法检测MrNV的敏感度实验图。M：DL2000 DNA Marker (TaKaRa公司)；泳道1～8：模板分别为10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8倍稀释的基因组RNA；泳道NT：无模板对照。

具体实施方式

下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

本发明实施如下：

一种罗氏沼虾野田村病毒NASBA-LFD检测方法，包括如下步骤：

病毒RNA的提取：

（1）取20-30mg罗氏沼虾幼虾或成虾肌肉组织，加入350-500μL裂解液匀浆，离心（12000rpm离心1-2min）。

所述裂解液包括浓度为30-60mmol/L 的pH7.3-7.6 Tris-HCL，浓度为3-6mol/L的异硫氰酸胍，以及浓度为5-10mmol/L EDTA，其余为RNase free water。

（2）取步骤（1）离心所得上清液，与等体积的70%无水乙醇混合均匀后，将混合液与玻璃纤维素膜结合；将混合液与玻璃纤维素膜结合具体操作为：将混合液转入带有玻璃纤维素膜的吸附柱中，12000rpm离心1-2min，弃掉废液，这样混合液与玻璃纤维素膜就结合。

（3）依次用去蛋白液和漂洗液洗涤玻璃纤维素膜。

去蛋白液洗涤玻璃纤维素膜具体操作为：向吸附柱中加入400-600μL去蛋白液，室温静置1-2min，12000rpm离心30-60s，弃掉废液。

所述去蛋白液包括浓度为10-50mmol/L的pH7.3-7.6 Tris-HCL，浓度为0.4-0.6mol/L异硫氰酸胍，以及体积浓度为10-30%的无水乙醇，其余为RNase free water。

漂洗液洗涤玻璃纤维素膜具体操作为：向吸附柱中加入400-600μL漂洗液，12000rpm离心30-60s，弃掉废液，重复该步骤一次。

所述漂洗液包括浓度为10-50mmol/L的pH7.3-7.6 Tris-HCL，50-150mmol/L NaCl，以及体积浓度75%的无水乙醇，其余为RNase free water。

（4）用RNase free water洗脱玻璃纤维素膜上吸附的RNA，具体操作为：在吸附柱中加入30-50μL RNase free water（市售），室温放置1-2min，12000rpm离心1-2min。可重复该步骤一次，增加RNA洗脱量。

NASBA扩增：

（5）配制预反应液，所述预反应液体积为16-21μL，包括：0.2-0.4μmol/L引物MrNV-P1F，0.2-0.4μmol/L引物MrNV-P1R， 0.1-0.2μmol/L 探针MrNV-FITC-PROBE，30-50mmol/L的 pH8.0-8.5Tris-HCl， 20-50mmol/L 氯化钾， 10-50 mmol/L 氯化镁，2-10mmol/L 二硫苏糖醇，10%-15% DMSO，1-2mmol/L dNTP，2-4mmol/L NTP，0.1-0.2μg/μL BSA，10-20U RNase 抑制剂，2-6U逆转录酶AMV，20-40U T7 RNA 聚合酶，0.1-0.3U RNaseH，其余为RNase free water。

MrNV NASBA引物、探针设计与筛选

本发明所述的引物是根据GenBank公布的RNA2序列设计获得，利用不同引物的反应结果进行筛选，由其中选出一对引物和一条探针。

引物MrNV-P1F（SEQ ID NO：1）: CGTTTCTCTCAACAGGGTGTA。

引物MrNV-P1R（SEQ ID NO：2）:

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGCTTGAGTTCTGTTGGTGGA。

探针MrNV-FTIC-PROBE（SEQ ID NO：3）:

TCACAGCTAACTTACAATGCGGA。

其中MrNV-P1F为5’端生物素（biotin）标记引物；MrNV-FTIC-PROBE为5’端FITC标记探针。

（6）在16-21μL预反应液中加入4-9μL步骤（4）所得 RNA作为模板，控制反应体系总体积为20-25μL，然后在40℃-42℃下反应60-120min。

LFD试纸检测：

（7）取步骤（6）所得NASBA扩增产物5-10μL滴到LFD试纸的点样处，然后在点样处前端滴上50-100μL缓冲液（1×TAE缓冲液），5-15分钟后根据试纸条上的显色带判定检测结果。当仅出现质控带时表明反应结果为阴性，当质控带和检测带同时出现时，表明反应结果为阳性。

一种罗氏沼虾野田村病毒NASBA-LFD检测试剂盒，包括NASBA扩增反应液，16-21μL的NASBA扩增反应液包括： 0.2-0.4μmol/L引物MrNV-P1F，0.2-0.4μmol/L引物MrNV-P1R， 0.1-0.2μmol/L 探针MrNV-FITC-PROBE，30-50mmol/L的 pH8.0-8.5Tris-HCl， 20-50mmol/L 氯化钾， 10-50 mmol/L 氯化镁，2-10mmol/L 二硫苏糖醇，10%-15% DMSO，1-2mmol/L dNTP，2-4mmol/L NTP，0.1-0.2μg/μL BSA，10-20U RNase 抑制剂，2-6U逆转录酶AMV，20-40U T7 RNA 聚合酶，0.1-0.3U RNaseH，其余为RNase free water。

NASBA扩增反应液装于NASBA核酸反应管中，NASBA核酸反应管中添加有稳定液，稳定液为液体石蜡油。稳定液滴加在NASBA核酸反应管中中，用于液封，稳定液用量在5-10μL。

检测试剂盒还配有LFD试纸用的缓冲液、阳性对照样品和阴性对照样品，其中LFD试纸用的缓冲液为1×TAE缓冲液，阳性对照样品为罗氏沼虾野田村病毒基因组RNA，阴性对照样品为无核酸的RNase free water。

本发明的上述方案在其范围内都是可以实施的，以下以一个典型实施方案来具体说明本发明的具体操作步骤。

典型实施方案：

1、材料

感染罗氏沼虾野田村病毒的虾样采集自浙江省杭州市西湖区某养殖场；所用引物与探针由上海生工生物公司合成；RNaseH、逆转录酶AMV、dNTP购自promega公司；DMSO、二硫苏糖醇、氯化钾等购自sigma公司；BSA、RNase抑制剂、T7 RNA聚合酶、NTP购自Fermentas公司。

2、罗氏沼虾样品病毒RNA的提取：

（1）取25mg罗氏沼虾幼虾或成虾肌肉组织，加入500μL裂解液后用一次性研磨棒研磨，等彻底匀浆后，12000rpm离心2min，吸取上清液至新的离心管；

（2）向装有上清液的新的离心管中加入等体积（与上清液等体积）的70%无水乙醇后，混合均匀；

（3）将混合液体转入带有玻璃纤维素膜的吸附柱中，吸附柱置于收集管中，12000rpm离心1min，弃掉废液；

（4）向吸附柱中加入600μL去蛋白液，室温静置1min，12000rpm离心30s，弃掉废液；

（5）加入600μL漂洗液，12000rpm离心30s，弃掉废液；重复该步骤一次。

（6）将吸附柱置于新的无RNase的离心管中，在吸附柱中加入50μL RNase free water，室温放置1min，12000rpm离心1min。使用第一次的洗脱液重复该步骤一次，增加RNA洗脱量。

（7）取5μLRNA洗脱液进行10^-1～10^-8倍的逐步梯度稀释，-80℃保存备用。

3、罗氏沼虾野田村病毒NASBA扩增：

（1）根据待检样品数，配制相应倍数的核酸检测的预反应液：

0.2 mol/L引物MrNV-P1F，0.2μmol/L引物MrNV-P1R， 0.2μmol/L 探针MrNV-FITC-PROBE，45mmol/L的 pH8.0-8.5Tris-HCl， 45mmol/L 氯化钾， 30 mmol/L 氯化镁，4mmol/L 二硫苏糖醇，10% DMSO， 2mmol/L dNTP，2mmol/L NTP，0.1μg/μL BSA，15U RNase 抑制剂，5U逆转录酶AMV，25U T7 RNA 聚合酶， 0.3U RNaseH，其余为RNase free water。

每管检测预反应液体积为21μL。

（2）分别吸取4μL不同浓度的待检样品RNA加入核酸检测反应管中，混合均匀。

（3）标记清楚后，将检测反应管置于41.5℃水浴锅中，恒温反应90min。

4、罗氏沼虾野田村病毒NASBA扩增产物进行凝胶电泳：

（1）配置3%的琼脂糖凝胶，每个加样孔加入5μL的反应产物；

（2）电泳30分钟后凝胶成像，结果见图4A。

5、NASBA扩增产物的LFD试纸检测：

（1）取罗氏沼虾野田村病毒NASBA扩增产物6μL，置于LFD试纸加样孔；

（2）在LFD试纸加样孔一端，滴加50μL缓冲液（1×TAE缓冲液），待缓冲液移动基本结束，判断NASBA-LFD检测结果，见图4B。

利用本发明所述的检测试剂盒和检测方法检测罗氏沼虾野田村病毒，经过凝胶电泳，由图4A可见单一特异的扩增条带；再利用LFD检测试纸条检验扩增产物，由图4B可见与电泳结果吻合。而图2特异性实验结果和图4灵敏度检测结果表明本检测方法具有较好的特异性和较高的灵敏度。

其中图1为筛选本体系最佳的反应温度，如图所示温度高于41℃较佳；图3为筛选最适反应时间的实验图，如图示可见反应90min可以保证获得较佳的结果；图5是以与图4中NASBA反应相同的基因组RNA为模板，进行常规RT-PCR反应的结果，该结果表明NASBA检测的灵敏度明显高于常规PCR的检测。

根据以上实验结果表明，罗氏沼虾野田村病毒NASBA-LFD检测试剂盒和检测方法可以为MrNV提供快速、简便、灵敏的现场检测。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江省淡水水产研究所

<120> 罗氏沼虾野田村病毒NASBA-LFD检测方法及其检测试剂盒

<130> 2013.07.15

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgtttctctc aacagggtgt a 21

<210> 2

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aattctaata cgactcacta taggggcttg agttctgttg gtgga 45

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcacagctaa cttacaatgc gga 23

Claims

1.一种罗氏沼虾野田村病毒NASBA-LFD检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

病毒RNA的提取：

（3）依次用去蛋白液和漂洗液洗涤玻璃纤维素膜；

（4）用RNase free water洗脱玻璃纤维素膜上吸附的RNA；

NASBA扩增：

LFD试纸检测：

2.根据权利要求1所述的罗氏沼虾野田村病毒NASBA-LFD检测方法，其特征在于：所述裂解液包括浓度为30-60mmol/L 的pH7.3-7.6 Tris-HCL，浓度为3-6mol/L的异硫氰酸胍，以及浓度为5-10mmol/L EDTA。

3.根据权利要求1所述的罗氏沼虾野田村病毒NASBA-LFD检测方法，其特征在于：所述去蛋白液包括浓度为10-50mmol/L的pH7.3-7.6 Tris-HCL，浓度为0.4-0.6mol/L异硫氰酸胍，以及体积浓度为10-30%的无水乙醇。

4.根据权利要求1所述的罗氏沼虾野田村病毒NASBA-LFD检测方法，其特征在于：所述漂洗液包括浓度为10-50mmol/L的pH7.3-7.6 Tris-HCL，50-150mmol/L NaCl，以及体积浓度75%的无水乙醇。

5.根据权利要求1或2或3或4所述的罗氏沼虾野田村病毒NASBA-LFD检测方法，其特征在于：引物MrNV-P1F为5’端生物素标记引物；探针MrNV-FTIC-PROBE为5’端FITC标记探针。

6.一种罗氏沼虾野田村病毒NASBA-LFD检测试剂盒，其特征在于：包括NASBA扩增反应液，16-21μL的NASBA扩增反应液包括： 0.2-0.4μmol/L引物MrNV-P1F，0.2-0.4μmol/L引物MrNV-P1R， 0.1-0.2μmol/L 探针MrNV-FITC-PROBE，30-50mmol/L的 pH8.0-8.5Tris-HCl， 20-50mmol/L 氯化钾， 10-50 mmol/L 氯化镁，2-10mmol/L 二硫苏糖醇，10%-15% DMSO，1-2mmol/L dNTP，2-4mmol/L NTP，0.1-0.2μg/μL BSA，10-20U RNase 抑制剂，2-6U逆转录酶AMV，20-40U T7 RNA 聚合酶，0.1-0.3U RNaseH；

7.根据权利要求6所述的罗氏沼虾野田村病毒NASBA-LFD检测试剂盒，其特征在于：引物MrNV-P1F为5’端生物素标记引物；探针MrNV-FTIC-PROBE为5’端FITC标记探针。

8.根据权利要求6所述的罗氏沼虾野田村病毒NASBA-LFD检测试剂盒，其特征在于：罗氏沼虾野田村病毒NASBA-LFD检测试剂盒还配有LFD试纸用的缓冲液、阳性对照样品和阴性对照样品，其中LFD试纸用的缓冲液为1×TAE缓冲液，阳性对照样品为罗氏沼虾野田村病毒基因组RNA，阴性对照样品为无核酸的RNase free water。