CN104212915A - 虾类偷死野田村病毒现场快速检测引物组及试剂盒 - Google Patents

虾类偷死野田村病毒现场快速检测引物组及试剂盒 Download PDF

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黄倢
杨昊霖
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Abstract

本发明涉及一种对虾偷死野田村病毒的现场快速检测引物组及高灵敏检测试剂盒。本发明的引物组包括6条引物，本发明的高灵敏检测试剂盒包括：采样管、内装蒸馏水的漂洗管、内装TE缓冲液的核酸变性管、内装扩增反应液和染料的扩增检测管、阴性对照管、阳性对照管、FTA膜片及其快速干燥液等。本发明的引物组能够特异性识别、高效扩增被检测CMNV的目标核酸，本发明的高灵敏检测试剂盒检测方法具有比电镜检测法、组织病理学检测费、病毒分离检测法等更高的特异性、灵敏性和便捷性，并且成本低，使用方便，检测更准确、快速、灵敏度极高。

Description

虾类偷死野田村病毒现场快速检测引物组及试剂盒
技术领域
本发明属于海洋生物病原检测技术领域，具体涉及一种虾类偷死野田村病毒(Covert mortality nodavirus，简称CMNV)场快速检测引物组及试剂盒。
背景技术
2009年以来，越南、马来西亚和我国南方多省连续出现养殖对虾大批死亡的情况。发病的养殖池塘中对虾摄食量不随着养殖时间的增加而增加，其中还有相当部分反而随着养殖时间的延长而减少；养殖现场观察，通常发病对虾活动规律无十分明显的异常，检查饵料台和养殖池底部时会发现死虾；发病严重时，死虾数量会在短短几天内大量增加。对虾养殖者称之为对虾“偷死病(Covert mortalitydisease)”、“死底症”或“偷死症”。该病爆发受环境条件如温度的影响：气温30℃以上，水温达28℃以上时，该病会导致死亡率大大升高。对发病严重的对虾进行仔细检查可以发现虾体透明度下降，时常可见腹部肌肉发白，肝胰腺颜色变浅或萎缩，总体上表现出一定程度的肝胰腺坏死和肌肉坏死症状；组织病理学表现为肝胰腺坏死，骨骼肌肌肉也呈多病灶溶解样坏死，肝胰腺、淋巴器官和结缔组织中可见嗜酸性包涵体。该病的病理学特征与对虾肌肉坏死病毒(Infectiousmyonecrosis virus，IMNV)、凡纳滨对虾诺达病毒(Penaeus vannamei nodavirus，PvNV)和罗氏沼虾诺达病毒(Macrobrachium rosenbergii nodavirus，MrNV)所致的病理学特征很相似，但发病对虾中检测不到IMNV、PvNV和MrNV的存在。我们在进行该病研究的过程中，发现一种新型的野田村病毒——命名为偷死野田村病毒(Covert mortality nodavirus，CMNV)是导致该病发生的原因。截至目前，该病害在我国的大部分对虾养殖地区仍危害严重，所以研究并建立该病原的快速检测预警技术，加强虾苗种和成虾检疫以及养殖水体环境的监测，对预防病毒感染，有效切断病毒传播，保障我国对虾养殖业的健康持续发展就显得尤为迫切和重要。
进行虾类偷死野田村病毒早期检测并采取预防措施是水产养殖中降低偷死野田村病毒流行风险、减少发病照成巨额经济损失的有效手段，所以建立简单、快速、高灵敏的检查方法，并开发适于现场应用的偷死野田村病毒检测试剂盒就尤为必要。
发明内容
本发明的目的是提供一种适于生产现场应用、快速、高灵敏度且易操作的虾类偷死野田村病毒检测方法，并将检测方法标准化，同时将检测试剂集中于规范的试剂盒中，以克服现有技术的不足，使CMNV的检测更准确、灵敏、快速、安全和方便。
发明人通过构建CMNV病毒全基因组cDNA文库克隆获得了CMNV的RNA聚合酶基因，通过对该基因保守区段序列的比对、分析，设计出4组可用于检测的引物组合，经过进一步优化和灵敏度、特异性分析，从4组中筛选出1组共6条特异引物，能够灵敏、特异性的检测用于该病毒的检测。在上述引物组的基础上，本发明还提供包含有反转录酶和一种DNA聚合酶的试剂盒，该试剂盒无需单独对目的核酸(RNA)进行反转录，在恒定温度下保温一段时间即可同步完成对目的核酸的反转录和扩增，实现对CMNV的快速和高灵敏检测。
本发明首先提供一种用于检测偷死野田村病毒的引物组，包括有如下引物：上游引物1-3(SEQ ID NO:1)：
5'-GTCGTCGACGGTTAGGTTGCGTTTTCCAAGCACTTCCCGACAA-3'
下游引物1-3(SEQ ID NO:2)：
5'-CGTCCAAAAGGACCTCCGCATTTTTGGAGACCTTGGTCACGC-3'
解链引物1-3(SEQ ID NO:3)：5'-GCTCACGGCTTTGGATACC-3'
解链引物2-3(SEQ ID NO:4)：5'-GATTGCATGCGTCAACCTCA-3'
上游引物2-3(SEQ ID NO:5)：5'-TGCCAAGCAAATACGAGCT-3'
下游引物2-3(SEQ ID NO:6)：5'-CATCAGCGATGTCACGGC-3'。
本发明还提供一种用于检测偷死野田村病毒的试剂盒，包括有如下的组份：
(1)采样管，用来盛放、研磨待检样品；
(2)漂洗管，内装蒸馏水；
(3)核酸变性管，内装TE缓冲液；
(4)扩增检测管，内装扩增反应液和染料，扩增反应液组成成分如下：扩增引物的上游引物1-3和下游引物1-3各1～3μM，扩增引物的解链引物1-3和2-3各0.5～1.5μM，扩增引物的上游引物2-3和下游引物2-3各0.1～0.5μM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各0.8～2.2mM，MgCl22～8mM，Betaine(甜菜碱)0.6～1.5M，Tris-HCl 10～40mM，KCl 10～20mM，MgSO41～6mM，(NH4)2SO46～12mM，Triton X-100 0.05％～1.0％，反转录酶1～20U，Bst DNA聚合酶2～20U；
染料可以选金属离子与钙黄绿素形成的配合物，也可以选核酸染料，只需其中一种即可；金属离子与钙黄绿素形成的配合物预混于扩增反应液中，核酸染料为分子生物学研究中常用的核酸染料，包括但不限于SYBR Green、GelRed、GelGreen、GoldViewTM、GeneFinderTM等，核酸染料预先粘附于扩增检测管管壁内侧上方或扩增检测管盖子内侧；
(5)阴性对照管，内装无偷死野田村病毒核酸的FTA膜片；
(6)阳性对照管，内装吸附了偷死野田村病毒核酸的FTA膜片；
(7)快速干燥液，为亲水性且易挥发的醇类物质；
(8)分别封装于无菌袋中的FTA膜片、研磨棒、牙签和吸管。
用本发明上述检测试剂盒检测CMNV的方法，按下列步骤进行：
(1)取样品组织约0.01～1.5g置于采样管中，研磨棒将样品组织磨碎至浆状；
(2)用研磨棒蘸取浆状的样品组织将FTA膜片充分润湿；
(3)吸取快速干燥液滴于上述FTA膜片上，静置1～20min；
(4)用牙签将上述FTA膜片转移到漂洗管内，震荡漂洗管3～5min以洗涤FTA膜片；
(5)再用牙签将上述核酸变性管内的FTA膜片转移到扩增检测管内，将扩增检测管置于56～66℃条件下保温20～70min；
(6)将扩增检测管上下反复甩动1-3min；
(7)用力向下甩动扩增检测管，使管内混有染料的扩增反应液集聚于扩增检测管底部，用眼睛观察反应液，如果反应液呈现绿色则表示该样品的CMNV检测结果为阳性，如果反应液呈现橙黄色则表示该样品的CMNV检测结果为阴性。
本发明在克隆来自我国山东、河北、福建等地患病对虾CMNV蛋白A基因的基础上，利用NCBI在线程序Blastn和分子生物学软件BioEitd 7.0比对了其序列的变异情况，选取CMNV蛋白A基因的保守性区序列设计了扩增引物，并利用采集自我国不同地区患偷死病对虾样品的核酸，对引物进行了验证；结果显示本发明所提供的引物能有效检测CMNV的所有毒株，而与其他病毒的核酸无交叉扩增反应，检测特异性非常好。利用荧光定量的方法对本发明引物的扩增灵敏度进行了测试，结果显示本发明的引物可检测低至27个拷贝的病毒。同时本发明在试剂盒中汇集了CMNV现场快速检测所需的FTA膜片、TE缓冲液、等温扩增反应液、染料等实验材料，实现了检测过程的程序化和标准化，使得操作规范、不易出错。本发明的检测试剂盒不仅可在实验室内使用，也可在野外的生产现场使用，对加强CMNV的流行病学监测和疾病防控意义重大，具有很高的推广应用价值。
附图说明
图1：引物组合1—4的扩增结果图，其中与阈值交界的“S”型曲线从左至右(下文中出现的“从左至右”均为与阈值交界处的线条排序)依次为引物组合3、1、4和2的扩增结果；
图2：引物组合3的特异性检测结果图，图中标号F9的“S”型曲线为CMNV核酸的扩增结果；标号G5、G6、G7和G8的直线分别代表MrNV、YHV、TSV和WSSV的扩增结果(因没有扩增，因而线型平直并有部分重合)。
图3：引物组合3的灵敏度检测结果图，图中“S”型曲线为不同拷贝数人工质粒pMD19-T-CMNV的扩增结果；
图4：引物组合3检测来自不同地区偷死对虾携带CMNV的情况(山东样品)；
图5：引物组合3检测来自不同地区偷死对虾携带CMNV的情况(河北样品)；
图6：引物组合3检测来自不同地区偷死对虾携带CMNV的情况(福建样品)，其中图4—6中，“S”型曲线示患病对虾核酸的扩增结果，平直的线为阴性对照；图1—6中，纵坐标“Fluorescence(morm)”表示荧光信号强度，横坐标“Cycle”表示循环数(每分钟1个循环)。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1虾类偷死野田村病毒现场快速检测引物的设计及筛选
首先，针对克隆自我国山东、河北、福建等地患偷死病对虾的CMNV蛋白A基因，利用NCBI在线程序Blastn和分子生物学软件BioEitd 7.0比对上述序列的变异情况，选取CMNV蛋白A基因的保守性区序列通过软件Lamp Designer 1.02设计扩增引物，共设计出4套引物(表1)。
表1：依据CMNV蛋白A基因设计的扩增引物
分别利用上述设计合成的4套引物组合，按照如下成分配制成反应体系并进行扩增反应(25μL/反应，记作方法1)：扩增引物的上游引物1和下游引物1各1.6μM，扩增引物的解链引物1和2各0.8μM，扩增引物的上游引物2和下游引物2各0.2μM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各1.4mM，MgCl28mM，Betaine(甜菜碱)1.2M，Tris-HCl 20mM，KCl 10mM，MgSO41mM，(NH4)2SO410mM，Triton X-100 0.1％，反转录酶5U，Bst DNA聚合酶8U；染料为50μM钙黄绿素和氯化锰形成的配合物；模板为50ng CMNV阳性对虾核酸，空白对照为2μL无菌水；然后将配制好的反应试剂置于荧光定量PCR仪(RealPlex 2)上进行65℃保温，每分钟(1个cycle)检测一次荧光信号，根据荧光定量PCR仪所记录的扩增曲线对比不同引物组合的扩增情况。实验结果显示，引物组合3的荧光信号最强、扩增效率最高(图1)。因此引物组合3被用于下一步的特异性和灵敏度分析。
分别以CMNV、MrNV、Yellow head virus(YHV)、Taura syndrome virus(TSV)和White spot syndrome virus(WSSV)的核酸为模板，按照上述方法1中反应体系和反应程序进行扩增，测试引物组合3检测CMNV的特异性。扩增结果显示，仅当以CMNV核酸为模板时，扩增反应呈阳性。这说明，引物组合3能够特异性扩增CMNV的核酸，而不与目前常见对虾病毒的核酸发生交叉扩增反应(图2)。
配制20μL的PCR反应体系：2μL CMNV的cDNA,2.0μL 10×PCR mastermix(Life Technologies),1μL 10μM上游引物2-3,1μL 10μM下游引物2-3，14μLH2O，并按照如下程序进行扩增：94℃保温5min,接着35个循环(94℃保温30s，50℃保温30s，72℃保温50s)，最后72℃延伸7min。将扩增产物进行电泳，用手术刀切出目的条带并进行胶回收，然后将胶回收产物段插入质粒pMD19中构建含有CMNV片段的人工质粒pMD19-T-CMNV(相关方法参见：Qinlgi Zhang等，Journal of virological methods,2013，187:384-9)。将含有CMNV目标片段的质粒(2.7×104copies/μl)进行10倍梯度稀释，然后用作模板，按照上述方法1中的反应体系和反应程序进行扩增，分析引物组合3的检测灵敏度。扩增结果显示，引物组合3最低可检测低至27拷贝的病毒质粒。
以采集自我国不同地区患偷死病对虾样品的核酸为模板，采用方法1中的反应体系和反应程序进行扩增，对引物组合3进行了适用性验证，反应所用荧光定量PCR仪为BIO RAD CFX connect。结果显示本发明所提供的引物组合3能有效检测来自山东、河北和福建的患偷死病对虾中的CMNV(图4—6)；该结果说明针对不同地区来源的CMNV，引物组合3具有良好的适用性。
实施例2本发明的检测试剂盒由以下部件组成(可检测4个样品的包装)：
(1)采样管，4个，用来盛放、研磨待检样品；
(2)漂洗管，6个，每个管内装有1ml的蒸馏水；
(3)核酸变性管，6个，每个管内装有20μL的TE缓冲液(含10mMTris-HCl和1mM EDTA，pH8.0)；
(4)扩增检测管，6个，每个管内装有24μL扩增反应液和1μL的染料，扩增反应液组成成分如下：扩增引物的上游引物1和下游引物1各1.6μM，扩增引物的解链引物1和2各0.8μM，扩增引物的上游引物2和下游引物2各0.2μM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各1.4mM，MgCl22mM，Betaine(甜菜碱)1.2M，Tris-HCl 20mM，KCl 10mM，MgSO46mM，(NH4)2SO410mM，Triton X-100 0.1％，反转录酶5U，Bst DNA聚合酶8U；染料为50μM钙黄绿素和氯化锰形成的配合物；
(5)阴性对照管，1个，内装无偷死野田村病毒核酸的FTA膜片；
(6)阳性对照管，1个，内装吸附了偷死野田村病毒核酸的FTA膜片；
(7)快速干燥液，1管，内装500μL无水乙醇；
(8)FTA膜片(4片)、研磨棒(4个)、牙签(6个)和吸管(1个)分别封装于无菌袋中；
(9)包装盒(1个)，内装一块有多个小孔的海绵块，海绵块有小孔4×6个；
(10)使用说明书，1份。
实施例3本发明的检测试剂盒也可由以下部件组成(可检测4个样品的包装)：
(1)采样管，4个，用来盛放、研磨待检样品；
(2)漂洗管，6个，每个管内装有1ml的蒸馏水；
(3)核酸变性管，6个，每个管内装有20μL的TE缓冲液(含10mMTris-HCl和1mM EDTA，pH8.0)；
(4)扩增检测管，6个，每个管内装有25μL扩增反应液和1μL的核酸染料，扩增反应液组成成分如下：扩增引物的上游引物1和下游引物1各1.6μM，扩增引物的解链引物1和2各0.8μM，扩增引物的上游引物2和下游引物2各0.2μM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各1.4mM，MgCl28mM，Betaine(甜菜碱)1.2M，Tris-HCl 20mM，KCl 10mM，MgSO42mM，(NH4)2SO410mM，TritonX-100 0.1％，反转录酶5U，Bst DNA聚合酶8U；核酸染料1μL，成分为稀释10倍的GeneFinderTM，且核酸染料已粘附固定于扩增检测管的管盖内侧。
(5)阴性对照管，1个，内装无偷死野田村病毒核酸的FTA膜片；
(6)阳性对照管，1个，内装吸附了偷死野田村病毒核酸的FTA膜片；
(7)快速干燥液，1管，内装500μL无水乙醇；
(8)FTA膜片(4片)、研磨棒(4个)、牙签(6个)和吸管(1个)分别封装于无菌袋中；
(9)包装盒(1个)，内装一块有多个小孔的海绵块，海绵块有小孔4×6个；
(10)使用说明书，1份。
实施例4使用本发明的检测试剂盒检测偷死野田村病毒的方法
(1)准备2份患偷死病的对虾样品，分别编号为1和2；准备2份健康的对虾样品，分别编号为3和4；取每份样品的肝胰腺组织约0.1g置于采样管中，用研磨棒快速将样品磨碎至浆状；
(2)用研磨棒蘸取浆状的样品将对应编号的FTA膜片(1—4号膜片)充分润湿；
(3)吸取快速干燥液滴于上述FTA膜片上，将FTA膜片室温静置10min；
(4)用牙签将上述FTA膜片转移到对应编号的漂洗管(1—4号管)内，将漂洗管剧烈震荡3min；
(5)再用牙签将上述核酸变性管内的FTA膜片转移到对应编号的扩增检测管(1—4号管)内，58℃保温60min；
(6)将扩增检测管上下反复甩动2min；
(7)然后用力向下甩动扩增检测管，用眼睛观察扩增反应液；结果显示，患偷死病对虾样品1和2号对应的扩增检测管1号和2号中反应液呈现绿色，这说明1和2号样品的CMNV检测结果为阳性；健康对虾样品3和4号对应的扩增检测管3号和4号中反应液呈现橙黄色，这说明3号和4号样品的CMNV检测结果为阴性。
在上述步骤中从第4步开始，将无偷死野田村病毒核酸的FTA膜片、吸附了偷死野田村病毒核酸的FTA膜片和吸附了样品核酸的FTA膜片一起处理，直至完成检测反应，分别用作检测的阴性和阳性对照；阴性对照膜片对应的扩增检测管中反应液显示为橙黄色，阳性对照膜片对应的扩增检测管中反应液显示为绿色。
实施例5使用本发明试剂盒检测对虾饵料中病毒存在情况
使用实施例2或实施例3中的检测试剂盒，按下列步骤进行：
(1)从对虾偷死病发生严重地区采集对虾鲜活饵料1份，命名为1号样品；从实验室制备的对虾鲜活饵料中取出一部分，命名为2号样品(该样品经PCR检测不含CMNV)；从样品1和样品2中取约0.2g置于采样管中，用研磨棒快速将样品磨碎至浆状；
(2)用研磨棒蘸取浆状的样品将对应编号的FTA膜片(1和2号膜片)充分润湿；
(3)吸取快速干燥液滴于上述FTA膜片上，将FTA膜片室温静置5min；
(4)用牙签将上述FTA膜片转移到对应编号的漂洗管(1和2号管)内，将漂洗管剧烈震荡3min；
(5)再用牙签将上述核酸变性管内的FTA膜片转移到对应编号的扩增检测管(1和2号管)内，58℃保温50min；
(6)将扩增检测管上下反复甩动2min；
(7)然后用力向下甩动扩增检测管，用眼睛观察扩增反应液；结果显示，1号样品的对应的1号扩增检测管中反应液呈现绿色，这说明1号样品为CMNV阳性；2号样品对应的2号扩增检测管中反应液呈现橙黄色，这说明2号样品为CMNV阴性。
在上述步骤中从第4步开始，将无偷死野田村病毒核酸的FTA膜片、吸附了偷死野田村病毒核酸的FTA膜片和吸附了样品核酸的FTA膜片一起处理，直至完成检测反应，分别用作检测的阴性和阳性对照；阴性对照膜片对应的扩增检测管中反应液显示为橙黄色，阳性对照膜片对应的扩增检测管中反应液显示为绿色。
实施例6使用本发明试剂盒检测发病水体中病毒存在情况
使用实施例2或实施例3中的检测试剂盒，按下列步骤进行：
(1)从对虾偷死病发生池塘中取养殖水10L，用200目筛绢过滤，将过滤物水分尽量去除，命名为1号样品；从实验室无特定病原污染水体中取养殖水10L，用200目筛绢过滤，将过滤物水分尽量去除，命名为2号样品(该样品经PCR检测不含CMNV)；从样品1和样品2中取约0.2g置于采样管中，用研磨棒快速将样品磨碎至浆状；
(2)用研磨棒蘸取浆状的样品将对应编号的FTA膜片(1和2号膜片)充分润湿；
(3)吸取快速干燥液滴于上述FTA膜片上，将FTA膜片室温静置5min；
(4)用牙签将上述FTA膜片转移到对应编号的漂洗管(1和2号管)内，将漂洗管剧烈震荡3min；
(5)再用牙签将上述核酸变性管内的FTA膜片转移到对应编号的扩增检测管(1和2号管)内，58℃保温50min；
(6)将扩增检测管上下反复甩动2min；
(7)然后用力向下甩动扩增检测管，用眼睛观察扩增反应液；结果显示，1号样品的对应的1号扩增检测管中反应液呈现绿色，这说明1号样品为CMNV阳性；2号样品对应的2号扩增检测管中反应液呈现橙黄色，这说明2号样品为CMNV阴性。
在上述步骤中从第4步开始，将无偷死野田村病毒核酸的FTA膜片、吸附了偷死野田村病毒核酸的FTA膜片和吸附了样品核酸的FTA膜片一起处理，直至完成检测反应，分别用作检测的阴性和阳性对照；阴性对照膜片对应的扩增检测管中反应液显示为橙黄色，阳性对照膜片对应的扩增检测管中反应液显示为绿色。
实施例7利用Whatman-FTA卡标准核酸制备方法和本发明快速核酸制备方法制备虾病毒核酸
为了验证本发明中快速核酸制备方法制备核酸的效果，分别利用Whatman-FTA卡标准核酸制备方法和本发明快速核酸制备方法分别从感染CMNV的虾中制备病毒核酸。
首先利用Whatman-FTA卡标准核酸制备方法制备病毒核酸：
(1)取约10毫克的虾肝胰腺放入1.5mL离心管中，加入100μL的PBS缓冲液，用研磨棒将肝胰腺研磨成浆状；
(2)用吸液管将研磨的组织匀浆液加到FTA卡的样品圆圈内，大约每个圆圈加25μL；
(3)将加好样品的FTA卡室温放置干燥1.5个小时；
(4)用一个钻取工具从所上述干燥后的FTA卡上取下直径约2.0mm的圆片，放进1.5mL离心管中；
(5)在上述离心管中加入200μLFTA纯化试剂(Whatman产品编号：WG120204)，静置5分钟；
(6)用吸液管将离心管内的FTA纯化试剂全部吸出；
(7)重复步骤(5)——(6)两次；
(8)在上述离心管中加入200μL TE缓冲液(10mMTris-HCl,0.1mM EDTA，pH 8.0)，静置5分钟；
(9)用吸液管将离心管内的TE缓冲液全部吸出；
(10)重复步骤(8)——(9)两次；
(11)将上述离心管内的圆片在室温下干燥大约一个小时，圆片即可用于核酸的扩增了。
利用本发明中快速核酸制备方法按下面的步骤制备虾病毒核酸：
(1)取约10毫克的虾肝胰腺放入1.5mL离心管中，用研磨棒将虾肝胰腺研磨成浆状；
(2)用吸液管将研磨的组织匀浆液加到3个FTA卡的样品圆圈内，大约每个圆圈加5μL；
(3)将3个FTA卡上分别滴加100μL甲醇、无水乙醇和异丙醇，室温放置3～5分钟；
(4)用一个钻取工具从所上述3个FTA卡上分别取下直径约2.0mm的圆片放进1.5mL离心管中；
(5)在上述离心管中加入800μL灭菌水，剧烈震荡3分钟；
(6)取出离心管内的圆片即可用于核酸的扩增了。
从上述过程中可以看出，采用Whatman-FTA卡标准核酸制备方法大约需要2个多小时才能完成核酸制备，而采样本发明的快速核酸制备方法大约只需要6～10分钟就可以完成核酸制备；所以与Whatman-FTA卡标准核酸制备方法相比，本发明的快速核酸制备方法具有操作简单、快速的优点。
实施例8Whatman-FTA卡标准核酸制备方法和本发明快速核酸制备方法制备虾病毒核酸的效果对比
用实施例7中Whatman-FTA卡标准核酸制备方法和本发明快速核酸制备方法制备的虾病毒核酸分别作为模板，进行等温扩增反应，每个扩增反应中含25μL扩增反应液，扩增反应液组成成分如下：扩增引物的上游引物1和下游引物1各2μM，扩增引物的解链引物1和2各1μM，扩增引物的上游引物2和下游引物2各0.5μM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各1.5mM，MgCl27mM，Betaine(甜菜碱)1.3M，Tris-HCl 20mM，KCl 10mM，MgSO42mM，(NH4)2SO410mM，Triton X-100 0.1％，反转录酶2U，Bst DNA聚合酶8U；等温扩增反应条件为：58℃保温50分钟，然后90℃保持5分钟；最后将每个反应管中的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。结果发现，利用本发明快速核酸制备方法(制备核酸过程中采用了甲醇、无水乙醇和异丙醇等挥发性醇类作为快速干燥液)制备的核酸均可以有效用作等温扩增反应的模板，并且扩增效果略好于采用Whatman-FTA卡标准核酸制备方法制备的核酸的扩增效果。
综上所述，本发明检测试剂盒及其检测方法不仅可以应用于虾样品中CMNV的检测，还可应用于虾饵料中CMNV的检测。
本发明中所述的FTA膜片是英国Whatman公司用来制备核酸的FTA卡片；将FTA卡片裁切成尺度为长×宽不小于1毫米×1毫米的纸片或打孔成直径不小于1毫米的纸片即可制成FTA膜片。
本发明的试剂盒所使用的试剂和材料：引物由上海生物工程有限责任公司合成；乙二胺四乙酸二钠、三羟甲基氨基甲烷、dNTP、甜菜碱(Betaine)、dATP、dGTP、dCTP和dTTP、KCl、MgSO4、(NH4)2SO4、MgCl2、Triton X-100购自上海生物工程有限责任公司；无水乙醇、甲醇、异丙醇、钙黄绿素、氯化锰等购自国药集团化学试剂北京有限公司；等温扩增用的Bst DNA聚合酶、反转录酶等购自NEB公司；核酸染料GeneFinderTM购自厦门百维信生物科技有限公司。还可以选用本领域常用的试剂，而不仅限于本发明实施例的具体限定。

Claims (7)

1.一种用于检测偷死野田村病毒的引物组，其引物的核苷酸序列为SEQ IDNO:1-6。
2.如权利要求1所述的引物组，其引物的具体信息如下：
上游引物1-3(SEQ ID NO:1)：
5'-GTCGTCGACGGTTAGGTTGCGTTTTCCAAGCACTTCCCGACAA-3'
下游引物1-3(SEQ ID NO:2)：
5'-CGTCCAAAAGGACCTCCGCATTTTTGGAGACCTTGGTCACGC-3'
解链引物1-3(SEQ ID NO:3)：5'-GCTCACGGCTTTGGATACC-3'
解链引物2-3(SEQ ID NO:4)：5'-GATTGCATGCGTCAACCTCA-3'
上游引物2-3(SEQ ID NO:5)：5'-TGCCAAGCAAATACGAGCT-3'
下游引物2-3(SEQ ID NO:6)：5'-CATCAGCGATGTCACGGC-3'。
3.权利要求1所述的引物组在制备检测偷死野田村病毒的制品中的应用。
4.一种用于检测偷死野田村病毒的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含有权利要求1所述的引物组。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包含有：
(1)采样管，用来盛放、研磨待检样品；
(2)漂洗管，内装蒸馏水；
(3)核酸变性管，内装TE缓冲液；
(4)扩增检测管，内装扩增反应液和染料，扩增反应液组成成分如下：扩增引物的上游引物1-3和下游引物1-3各1～3μM，扩增引物的解链引物1-3和2-3各0.5～1.5μM，扩增引物的上游引物2-3和下游引物2-3各0.1～0.5μM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各0.8～2.2mM，MgCl22～8mM，Betaine 0.6～1.5M，Tris-HCl10～40mM，KCl 10～20mM，MgSO41～6mM，(NH4)2SO46～12mM，Triton X-1000.05％～1.0％，反转录酶1～20U，Bst DNA聚合酶2～20U；
(5)阴性对照管，内装无偷死野田村病毒核酸的FTA膜片；
(6)阳性对照管，内装吸附了偷死野田村病毒核酸的FTA膜片；
(7)快速干燥液，为亲水性且易挥发的醇类物质；
(8)分别封装于无菌袋中的FTA膜片、研磨棒、牙签和吸管。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的染料为金属离子与钙黄绿素形成的配合物或核酸染料。
7.权利要求4所述的试剂盒在检测非养殖动物的样品中偷死野田村病毒的应用。
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