CN101575649B - H9型禽流感病毒的快速检测技术 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种从禽病料中检测病毒的方法,以及这种方法的用途。本发明的方法是无菌采集被检死禽的肠内容物、肺、气囊、肠、脾、肝或心等组织,或者无菌采集被检活禽的血液、气管拭子、泄殖腔拭子或粪便,采用Trizol方法或MiniBEST病毒RNA提取试剂盒从所采样品中提取RNA,以提取的RNA为模板,以外侧上、下游引物和内侧上、下游引物进行RT-LAMP反应,RT-LAMP反应结束后取样进行琼脂糖凝胶电泳检测,以是否出现RT-LAMP反应特异的梯状条带来判断被检禽是否感染H9型禽流感病毒。
Description
技术领域
本发明属于医学领域,涉及一种从禽病料中检测病毒的方法,以及这种方法的用途。更确切讲,本发明利用环介导等温扩增技术而研发的检测方法,从死禽病料(包括肠内容物、肺、气囊、肠、脾、肝和心等组织)和活禽病料(包括血液、气管拭子、泄殖腔拭子和粪便)中检测H9型禽流感病毒的方法。
背景技术
禽流感病毒(AIV)一直是影响养禽业的最主要病原。虽然通过疫苗的广泛使用,使得禽流感的流行得以控制,但近年来,在我国流行的H9型禽流感在高免鸡群中呈现流非典型症状,常以产蛋量大幅度下降,低死亡率,呼吸道症状及后期的神经症状为特征,临床很难区别禽流感病毒的亚型和其他呼吸道病毒病。因此,对禽流感病毒的检验与诊断方面的研究具有重要意义。
流感是呈全球分布的传染病,各个国家都有不同程度的发生。流感对人类的危害众所周知,它的发病率和造成的死亡人数至今仍列为传染病之首。在畜牧兽医方面,它也威胁着多种家畜家禽甚至很多珍稀野生动物的繁衍和生存,从而对经济也造成极大的影响。由于流感病毒的毒株众多,毒力差别很大,所以临床症状也千差万别。尤其H9型禽流感和其他呼吸道疾病很难与其他有类似症状的传染病区分,而且临床症状和病理变化因感染动物的种类、年龄、病程长短、并发感染情况及感染毒株毒力等不同而有所不同,可能缺乏特征性症状和剖检变化,这给H9型流感的诊断和防治带来极大的困难。因此,单靠临床诊断常常难以定性。实验室诊断是确诊流感的惟一有效途径。特别是随着血清学实验技术和分子生物学技术的飞速发展,H9型流感诊断技术的研究也不断取得新的进展。同时,分子生物学的发展为H9型流感病毒核酸序列分析创造了条件。
为了确定H9型流感是否在某一地区存在,检测动物血清抗体的方法并非完全可靠,还必须通过病原学检查以确诊病原的存在。H9型流感病毒病原学检查,一般用生物学实验、血清学诊断技术和分子生物学诊断技术。这些技术方法虽然得到承认、采纳和应用,但是它们有的敏感性不高、有的特异性不强、有的检出率较底、有的检测周期太长、有的费用太大,而且这些方法大多都需动用活病毒,存在向周围环境散毒的隐患。一般基层单位要开展此项工作,存在不少困难,特别是被检材料污染,检出更为困难。因此进行H9型病毒的分离鉴定,不仅需要严格的无菌取材,还需要低温保存,迅速送检,这往往也是一般工作现场难以办到的。因而建立一种快速诊断该病的方法,已成为H9型流感防治技术研究的重要课题。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种快速、简便、灵敏和经济的用于检测死禽病料(包括肠内容物、肺、气囊、肠、脾、肝和心等组织)和活禽病料(包括血液、气管拭子、泄殖腔拭子和粪便)中间检测H9型禽流感病毒的方法。
本发明是利用环介导等温扩增技术,从禽病料中提取核酸,利用所设计的引物进行扩增反应,检测反应产物是否含有特异性的梯状条带,以确定禽是否感染H9型禽流感病毒的快速检测技术。
本发明以禽病料核酸提取物为模板,所使用的四条特异性引物为:
表1.RT-LAMP检测方法所使用的引物
本发明的实现方法如下:通过使用特异性引物,利用RT-LAMP技术扩增H9型禽流感病毒基因组上的特定区域,通过检测特定产物的形成与否,从分子水平对血液或组织样品中的H9型禽流感病毒进行筛查。
本发明的H9型禽流感病毒的RT-LAMP检测方法是:以被检禽病料中的RNA为模板,根据H9型禽流感病毒基因组序列,设计两对针对H9型禽流感病毒的HA基因的特异性引物进行等温扩增反应。
环介导等温扩增技术是由日本科学家Notomi发明的一种的迅速、简便、准确、成本低的核酸识别技术。RT-LAMP技术用于H9型禽流感病毒的检测具有如下优点:
1.对靶基因的6个部位设定4种引物,利用链置换反应在恒温下使靶基因高效扩增,由于其反应是由多个引物共同启动的,所以比RT-PCR更特异。
2.RT-LAMP技术比RT-PCR具有更高的灵敏度,但所需设备却十分简单,仅需一台能提供60℃左右的水浴锅即可,其试验成本可极大降低。
3.RT-LAMP技术一般一个小时内即可完成,比RT-PCR节省时间。
本发明中所使用的试剂包括:病毒RNA提取试剂和RT-LAMP核酸扩增试剂。
诊断方法的步骤如下:
(1)核酸提取
无菌取病禽血液、气管和泄殖腔拭子或粪便以及死禽的器官组织,最好是禽的脑、脾和肺等器官组织,用灭菌生理盐水研磨成乳悬液,并每毫升加入青、链霉素各2000IU,分装入小瓶贴好标签-80℃保存备用;分别按照试剂盒说明采用Trizol方法或MiniBEST病毒RNA提取试剂盒,从血液、咽喉和泄殖腔拭子以及组织中提取包括病毒基因在内的全基因组RNA;同时,无菌提取健康咽喉拭子中的RNA,以用作阴性对照。
(2)RT-LAMP反应
RT-LAMP反应体系如下:终浓度分别为2.0μM的FIP和BIP引物,0.2μM的F和B引物,1.0mM dNTP,8U的Bst DNA聚合酶(New EnglandBiolabs),10×buffer(containing 2mM of MgSO4,0.8M betaine)and 1μl提取的模板cDNA,反应终体积为50μl,反应在0.2ml PCR管中进行。
RT-LAMP反应程序为:恒温水浴锅63℃条件下反应45min,然后在80℃加热10min终止反应。
RT-LAMP反应产物检测和结果判定:反应产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳,10V/cm,30分钟后溴化乙啶染色后260nm波长观察。。
附图说明
图1为H9型禽流感病毒的RT-LAMP和RT-PCR检测方法的敏感性比较的电泳图。从左至右依次为:M,DNA分子量标准DL-2000;1-6泳道,不同拷贝数的模板进行的RT-PCR反应,分别为每管1,10,102,103,104,105拷贝。7-12泳道,RT-LAMP反应中每管中含有不同拷贝数的模板,分别为每管1,10,102,103,104,105拷贝。RT-PCR对H9型禽流感病毒的检出限为100拷贝,而RT-LAMP的检出方法为10拷贝。
具体实施方式
本发明实施例分成两部分完成,即实施例一:H9型禽流感病毒RT-LAMP方法的建立;实施例二:H9型禽流感病毒RT-LAMP方法的特异性和敏感性试验,下述实施例中的实验方法,如无特别说明,均为常规方法。
实施例<一>H9型禽流感病毒RT-LAMP方法的建立
1、H9型禽流感的核酸提取
无菌采集感染H9型禽流感病毒的禽外周血液,加入适量抗凝剂,对禽组织样品加入少量pH 7.4,0.05M的磷酸盐缓冲液(PBS)然后用组织粉碎机匀浆处理。处理后的样品按照宝生物工程(大连)有限公司提供的病毒RNA提取试剂盒提取病毒RNA。
2、H9型禽流感的RT-LAMP反应
参照GenBank登录的H9型禽流感的HA基因的序列,设计两对引物。本发明采用引物的序列如下:
外侧引物:
上游F:5′-CTACTGTTGGGAGGAAGAGAATGGT-3′
下游B:5′-GAAAGAATGTGTCCATACCA-3′
内侧引物:
FIP:5′-CTGTAGAATGAATCTGAACATTTTACACAATCTGGAATGTGTCT-3′
BIP:5′-TCAAGACGCCCAATACACAATTTTGAAAGAATGTGTCCATACCA-3′
以提取的H9型禽流感的RNA为模板,在50μL反应体系中加入H9型禽流感的RNA 1μL,10μmol/L外侧上、下游引物各1μl,1μmol/L内侧上、下游引物各1μl,2.5mmol/L dNTPs 2μL,Bst DNA聚合酶8U,10x缓冲液5μL,加ddH2O至50μL。RT-LAMP反应程序如下:63℃45min,然后80℃10min。
结果检测:RT-LAMP结束后取样进行2.5%琼脂糖凝胶电泳检测,电泳条件为7V/cm,30分钟,结果出现RT-LAMP反应特异的梯状条带,见图1。
实施例<二>H9型禽流感病毒RT-LAMP方法的特异性和敏感性试验
1、H9型禽流感病毒的RT-LAMP的敏感性试验
1.1H9型禽流感病毒的定量及不同稀释度模板的确定。
按照H9型禽流感基因组的大小和提取的病毒RNA的浓度测算,按照RT-LAMP和RT-PCR每管1,10,102,103,104,105拷贝数进行稀释。
1.2H9型禽流感病毒的RT-LAMP方法检出限与RT-PCR方法的对比
H9型禽流感的RT-LAMP反应组成及反应程序按照实施例<1>进行,H9型禽流感的RT-PCR反应组成如下:50μl反应体系中包括1.5mM的dNTP,5μl的10×buffer,5U的Taq polymerase(Nippon Gene),1μM上下游引物F和B,1.0μl模板cDNA.扩增程序为94℃,5min,然后是循环程序94℃变性1min,55℃退火30s,72℃延伸1min,30个循环。最后72℃延伸5min。RT-PCR反应在MJResearch Minicycler扩增仪中进行。
1.3结果检测:
RT-PCR产物和RT-LAMP反应产物在同一块上琼脂糖凝胶中进行电泳。然后进行溴化乙啶染色,BIO-RAD凝胶成像仪中照相并分析,电泳结果见图1,从图中可以看出H9型禽流感的RT-LAMP方法的检测限为每个反应10个拷贝,而RT-PCR反应的检出限为每个反应100拷贝,RT-LAMP反应比RT-PCR反应的敏感性高10倍。
2、H9型禽流感的RT-LAMP的特异性试验
2.1H5N1、H3N2、NDV、H1N1和IBV病毒核酸的提取和RT-LAMP反应
分别用经过RT-PCR鉴定过的田间分离株H5N1、H3N2、NDV、H1N1和IBV中提取的RNA后,反转录为cDNA作为的H9型禽流感病毒RT-LAMP反应的模板,以健康禽组织中提取的RNA作为阴性对照模板。然后按照实施例<一>中H9型禽流感病毒的RT-LAMP反应体系和条件进行反应,反应产物用琼脂糖凝胶电泳检测。
2.2特异性反应结果分析
NDV、H5N1、H3N2、H1N1和IBV均与H9型禽流感病毒的RT-LAMP方法无交叉性反应。健康猪组织中提取的RNA作模板的RT-LAMP反应结果也为阴性。上述结果表明本试验所建立的H9型禽流感病毒的RT-LAMP检测方法与上述四种在临床症状表现相似的病毒无交叉反应。
3、H9型禽流感病毒的RT-LAMP的临床样品检测
3.1临床样品的准备
分别被RT-PCR和测序或病毒分离诊断为H9型禽流感病毒阳性临床样品由外周血、咽喉拭子、泄殖腔拭子和肺所组成。
3.2RT-LAMP检测结果
对上述H9型禽流感病毒阳性临床样品用所建立的RT-LAMP方法进行检测,检测结果见表2,从表中可以看出,RT-LAMP方法对临床样品的检出率总体上比RT-PCR的检出率高。其中对咽喉拭子、泄殖腔拭子和全血样品适合生前珍断。
4、结论
上述试验证明所建立的H9型禽流感病毒的RT-LAMP方法具有敏感性高、特异性强、快速、所需设备简单、操作容易等特点,适合于实验室和田间对H9型禽流感病毒的快速诊断。
表2.RT-LAMP和RT-PCR方法对H9型禽流感病毒临床样品的分析
注:其中包括10个健康鸡的咽喉拭子作为阴性对照。
附:基因序列表
<210>1
<211>25
<212>DNA
<213>外侧引物上游引物F
<400>
ctactgttgg gaggaagaga atggt 25
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>外侧引物下游引物B
<400>
gaaagaatgt,ccatacca 20
<210>3
<211>44
<212>DNA
<213>内侧引物FIP
<400>
ctgtagaatg aatctgaaca ttttacacaa tctggaatgt gtct 44
<210>4
<211>44
<212>DNA
<213>内侧引物BIP
<400>
tcaagacgcc caatacacaa ttttgaaaga atgtgtccat acca 44
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Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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---|---|---|---|---|
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CN101070554A (zh) * | 2006-05-08 | 2007-11-14 | 北京金迪克生物技术研究所 | 环介导逆转录等温扩增技术(rt-lamp)检测hcv和h5n1等rna病毒基因 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
L.L.M.Poon等.Detection of human influenza A virus by loop-mediated isothermal amplification.《Journal of Clinical Microbiology》.2005,第43卷(第1期),427-430. * |
Masaki Imai等.Development of H5-RT-LAMP(loop-mediated isothermal amplification) system for rapid diagnosis of H5 avian influenza virus infection.《Vaccine》.2006,第24卷6679-6682. * |
李启明等.逆转录环介导等温核酸扩增技术( RT-LAMP) 在H5N1禽流感病毒基因检测中的应用.《病毒学报》.2008,第24卷(第3期),178-184. * |
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