CN102121057B - 一种h9亚型禽流感病毒检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种H9亚型禽流感病毒检测试剂盒及其应用。本发明提供的试剂盒，包括三对引物，即与H9亚型禽流感病毒的HA基因结合的内侧引物对、外侧引物对和环形引物对。本发明的H9亚型禽流感病毒检测试剂盒，检测灵敏度高，最低可检测出100.5EID50的病毒，操作简单方便，特别适于基层现场进行的临床医学检测及食品中可能污染的H9亚型禽流感病毒的检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种H9亚型禽流感病毒检测试剂盒及其应用。
背景技术
禽流感是由正黏病毒科流感病毒属的禽类A型流感病毒(Influenza A virus)引起的一类禽类烈性传染病。根据血凝素与神经氨酸酶的抗原性不同，可分为16个H亚型(H1-H16)和9个N亚型(N1-N9)。1966年在美国首次分离到H9亚型禽流感病毒，随后中国大陆、香港、韩国、中东、欧洲以及北美等国家和地区均有报道。中国大陆自1994年首次分离到H9亚型禽流感病毒后，开始广泛流行，对养禽业造成一定的经济损失。
家禽感染H9亚型禽流感病毒，特别当伴有混合感染时，可导致病禽高死亡率及产蛋率严重下降。有文献报道香港曾从患有流感的儿童体内分离出H9N2禽流感病毒。因此，该病不仅对养禽业有较大危害，而且威胁着人类健康。
目前已有多种方法用于H9亚型禽流感病毒的检测，大致可以分为病原学、血清学以及分子生物学三类。病原学方法主要包括组织学诊断、动物接种试验和细胞培养法。血清学方法主要包括琼脂免疫扩散试验(AGID)、血液凝集试验(HA)、血液凝集抑制试验(HI)和酶联免疫吸附试验(ELISA)。分子生物学方法组要包括各种反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、反转录实时PCR(real-time PCR)、核酸恒温扩增法(nucleic acidsequence-based amplification，NASBA)等。上述方法均存在不同的缺点，如操作复杂、费时、设备昂贵等缺点，不适于基层应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种H9亚型禽流感病毒检测试剂盒及其应用。本发明提供的试剂盒基于反转录环介导等温扩增(Reverse transcriptase loop-mediated isothermalamplification，RT-LAMP)技术，可以快速检测H9亚型禽流感病毒。
本发明提供了检测H9亚型禽流感病毒的专用引物，由以下三对环介导等温扩增所用引物组成；一对引物是与H9亚型禽流感病毒的HA基因(GenBank AccessionNumber EU644482)结合的内侧引物对，一对引物是与H9亚型禽流感病毒的HA基因(GenBank Accession Number EU644482)结合的外侧引物对，一对引物是与H9亚型禽流感病毒的HA基因(GenBank Accession Number EU644482)结合的环形引物对。
H9亚型禽流感病毒的HA基因的核苷酸序列具体可如序列表的序列1所示(GenBank Accession Number EU644482)。
所述内侧引物对由上游引物FIP和下游引物BIP组成，所述上游引物FIP的核苷酸序列具体可为序列表中的序列4，所述下游引物BIP的核苷酸序列具体可为序列表中的序列5；所述外侧引物对由上游引物F3和下游引物B3组成，所述上游引物F3的核苷酸序列具体可为序列表中的序列2，所述下游引物B3的核苷酸序列具体可为序列表中的序列3；所述环形引物对由上游引物LF和下游引物LB组成，所述上游引物LF的核苷酸序列具体可为序列表中的序列6，所述下游引物LB的核苷酸序列具体可为序列表中的序列7。
应用所述专用引物检测H9亚型禽流感病毒的原理如下：
根据H9亚型禽流感病毒的HA基因设计一组用于反转录环介导等温扩增的引物，即内侧引物对(上游引物FIP和下游引物BIP)、外侧引物对(上游引物F3和下游引物B3)和环形引物对(上游引物LF和下游引物LB)。三对引物和H9亚型禽流感病毒HA基因序列保守区的八个特定区域的序列完全配对(见表1)，可以确保反应的彻底进行，也保证了检测方法的特异性。由于引物识别的8个区域是通过比对最近几年所有H9亚型禽流感病毒的HA基因(包括H9N1至H9N9)寻找出的保守区，所以所述专用引物能特异性的识别所有H9亚型的禽流感病毒。
表1专用引物与H9亚型禽流感病毒的HA基因的结合区域
所述专用引物在AMV反转录酶和具有链置换活性Bst DNA聚合酶的作用下可完成对模板RNA的扩增。扩增过程分为三个阶段，具体如下：
(1)反转录阶段
在AMV反转录酶的作用下，样本RNA被反转录为cDNA。
(2)循环起始阶段
一端内侧引物先与模板结合并启动DNA合成。相同一端的外侧引物随后与模板结合启动DNA合成，并发生链置换释放出含有内侧引物序列的DNA单链。该单链DNA作为模板先后与另一端的内侧引物和外侧引物结合，启动DNA合成并发生链置换，最后形成一个初始的茎环DNA。
(3)反应循环阶段
内侧引物与初始茎环DNA结合，启动链置换DNA合成，可产生另一个初始茎环DNA和一个新的两倍长度的茎环DNA。这些茎环DNA可作为模板继续与内侧引物结合启动链置换DNA合成，并且每次合成均可使茎环DNA的茎长度成倍增长。经过一个小时的等温扩增，目的DNA可累积109拷贝。
所述专用引物可用于制备试剂盒；所述试剂盒可用于辅助鉴定H9亚型禽流感病毒和/或检测待测样本是否含有H9亚型禽流感病毒。
本发明还保护含有所述专用引物的试剂盒；所述试剂盒可用于辅助鉴定H9亚型禽流感病毒和/或检测待测样本是否含有H9亚型禽流感病毒。该试剂盒在使用过程中，所述内侧引物对、所述外侧引物对和所述环形引物对作为一个整体组使用，使用时应该尽量避免引物二聚体的形成。
所述试剂盒还可包括溶液A(A液)，所述溶液A是将溶质溶于水(如双蒸水)得到的；所述溶质及其浓度如下：KCl为16.67nmol/μl，MgSO4.7H2O为13.33nmol/μl，(NH4)2SO4为16.67nmol/μl，钙黄绿素为0.083nmol/μl，MnCl2·4H2O为lnmol/μl，dNTPs各2.33nmol/μl，甜菜碱(Betaine)为0.33μmol/μl，Tris-HCl为33.33nmol/μl，Tween-20为0.17％(体积百分含量)，所述上游引物F3为0.28-0.39pmol/μl(如0.33pmol/μl)，所述下游引物B3为0.28-0.39pmol/μl(如0.33pmol/μl)，所述上游引物FIP为2.22-3.11pmol/μl(如2.67pmol/μl)，所述下游引物BIP为2.22-3.11pmol/μl(如2.67pmol/μl)，所述上游引物LF为1.11-1.55pmol/μl(如1.33pmol/μl)，所述下游引物LB为1.11-1.55pmol/μl(如1.33pmol/μl)。
所述试剂盒可包括溶液B(B液)，由溶剂和溶质组成；所述溶剂为水(如双蒸水)；所述溶质及其浓度如下：Bst DNA聚合酶为7.52U/μl，AMV反转录酶为0.6U/μl。
所述试剂盒还可包括离心管(如0.2或0.6ml规格)，检样管(在离心管中加一片FTA卡，如直径为1.2mm的FTA卡)，螺口离心管(如2.0ml规格)、一次性自吸式微量吸管(如10±2μL规格)和滴管(如每滴20±3μL规格)等。
所述试剂盒还可包括阳性对照，H9亚型禽流感病毒或其RNA、含有H9亚型禽流感病毒HA基因的质粒等均可作为阳性对照。所述阳性对照具体可按如下方法制备：取10μl病毒含量为106EID50/0.1ml的H9亚型禽流感病毒尿囊液，滴加于1.2mm直径的FTA卡上，孵育10min后将液体吸出，留下纸片，加入100μl DEPC处理水，室温下静置3分钟后，轻柔吹吸3次后将水全部吸出，所留FTA卡片即可作为阳性对照。
本发明还提供了一种检测来自死亡动物的样品中是否携带H9亚型禽流感病毒的方法，是用所述专用引物或所述试剂盒对来自死亡动物的样品的总RNA进行反转录环介导等混扩增反应，检测扩增产物，确定来自死亡动物的样品中是否携带H9亚型禽流感病毒；所述环介导等温扩增反应的条件为：60-65℃、60-90min。
所述环介导等温扩增反应的温度具体可为60-63℃或63-65℃。所述环介导等温扩增反应的时间具体可为：60-70min、70-80min或80-90min。
应用本发明提供的专用引物或试剂盒进行检测，可以通过直接检视反应液颜色的变化来判断样本中是否含有H9亚型禽流感病毒。直接检视方法为：环介导等温扩增后，阳性对照由棕黄色变为亮绿色，阴性对照保持棕黄色不变(说明实验结果可信)；此时若待检样品也保持棕黄色，则说明待检样品的检测结果为阴性(该样本不含有H9亚型禽流感病毒)，此时若待检测样品由棕黄色变为亮绿色，则说明待测样本的检测结果为阳性(该样品中含有H9亚型禽流感病毒)。
以上任一所述的H9亚型禽流感病毒可为H9N1亚型禽流感病毒(如A/Duck/Shantou/2030/00毒株)、H9N2亚型禽流感病毒(如CK/SH/06毒株)、H9N3亚型禽流感病毒、H9N4亚型禽流感病毒(如A/duck/Hokkaido/HY57/2005毒株)、H9N5亚型禽流感病毒、H9N6亚型禽流感病毒(如A/duck/Hong Kong/147/1977毒株)、H9N7亚型禽流感病毒、H9N8亚型禽流感病毒或H9N9亚型禽流感病毒。
本发明提供的试剂盒可用于检测多种样本(如核酸、尿囊液、唾液、粪便、心、肺、脾、肾等)中的H9亚型禽流感病毒。可用商品化试剂盒提取待测样本的核酸，所得核酸溶液直接作为模板使用。若待测样本为咽喉拭子、泄殖腔拭子或粪便，也可将待测样本放入2.0ml螺口离心管中，加入1ml生理盐水涮洗后，取上清液于另一2.0ml螺口离心管中，沸水浴中煮沸10min，冷却至室温后即可做模板使用。若待测样本为心、肝、肺、脾、肾等组织器官时：将超低温冻结的样品称量后，迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵充分研磨组织直至研磨成粉末状，其间可以补加液氮；充分研磨后，按每克重量加入1ml生理盐水，充分混匀，5000rpm离心5min，吸取上清；取10μl上清液滴加于检样管中的FTA卡上，孵育10min后将液体吸出，留下纸片，加入200μl市售纯净水或双蒸水，室温下静置3分钟后，将水全部吸出，所留FTA卡片即可作为模板使用。
用所述试剂盒进行检测时，可先将A液和B液混合均匀(9体积份A液和1体积份B液混合)，得到混合液，然后将来源于待测样本的模板、阳性对照和阴性对照(市售纯净水或双蒸水)分别与混合液混合，然后进行反转录环介导等温扩增。
应用本发明提供的试剂盒进行检测，特异性高且灵敏度高，可检测出最低可检测出含有100.5EID50的H9亚型禽流感病毒液。与RT-PCR检测方法相比，应用本发明提供的试剂盒检测，不需要昂贵的PCR仪，只需普通的金属或水浴锅，并且通过直接检测即可得到检测结果，操作简单方便。本发明的试剂盒可应用于基层现场进行的临床医学检测及食品中可能污染H9亚型禽流感病毒的检测，特别适于基层临床医学检测工作及现场即时检测。
附图说明
图1为实施例4的结果。
图2为实施例5的结果。
图3为实施例6的结果。
图4为实施例7的结果。
图5为实施例8的结果。
图6为实施例9的结果。
图7为实施例10的结果。
图8为实施例11的结果。
图9为实施例12的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
本发明中使用病毒分离的方法确定所用鸡只是否感染H9亚型禽流感病毒，具体操作方法为：将采集到的泄殖腔拭子或咽拭子用1ml含有青霉素(2000U/ml)、链霉素(2000mg/ml)生理盐水涮洗，涡旋混匀后，7000r/min离心5min，收集上清液，取150μL接种于9日龄的无特定病原体(SPF)鸡胚(梅里亚，北京)，37℃孵育72h，4℃过夜后收集血凝效价较高的尿囊液，进行血凝试验(HA)及血凝抑制试验(HI)，HI试验用诊断抗原购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。
CK/SH/06毒株(H9N2亚型禽流感病毒)：由中国兽医药品监察所提供。Falcatedduck/HLJ/1/07毒株(H1N2亚型禽流感病毒)：由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供。Mld/HLJ/118/06毒株(H2N6亚型禽流感病毒)：由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供。Mallard/HLJ/2/07毒株(H3N8亚型禽流感病毒)：由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供。Mallard/HLJ/22/08毒株(H4N6亚型禽流感病毒)：由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供。Mallard/HLJ/134/07毒株(H5N2亚型禽流感病毒)：由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供。Mallard/HLJ/4/07毒株(H6N1亚型禽流感病毒)：由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供。CK/HeB/2/02毒株(H7N2亚型禽流感病毒)：由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供。A/wigeon/Denmark/76-666157-G8/04毒株(H8N1亚型禽流感病毒)：由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供。PD/384/79毒株(H10N4亚型禽流感病毒)：由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供。Mld/HLJ/122/06毒株(H11N6亚型禽流感病毒)：由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供。A/duck/A/BERTA/60/76毒株(H12N5亚型禽流感病毒)：由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供。A/gull/Maryland/704/77毒株(H13N6亚型禽流感病毒)：由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供。A/mallard/Gurjer/263/82毒株(H14N5亚型禽流感病毒)：由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供。A/duck/AUST/34/83毒株(H15N8亚型禽流感病毒)：由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供。野毒株(新城疫病毒，Newcastle Disease virus，NDV)：由中国农业大学提供。野毒株(传染性支气管炎病毒，Infectious Bronchitis virus，IBV)：由中国农业大学提供。
A/Duck/Shantou/2030/00毒株(H9N1亚型禽流感病毒)：Li，K.S.，Xu，K.M.，Peiris，J.S.，Poon，L.L.，Yu，K.Z.，Yuen，K.Y.，Shortridge，K.F.，Webster，R.G.and Guan，Y.Characterization of H9 subtype influenza viruses from the ducks of southern China：acandidate for the next influenza pandemic in humans？J.Virol.77(12)，6988-6994(2003)。
A/duck/Hokkaido/HY57/2005毒株(H9N4亚型禽流感病毒)：Onishi，S.，Kida，H.，Sakoda，Y.and Okamatsu，M.、Direct Submission、Submitted(22-AUG-2008)Contact：Satoko Onishi Hokkaido University，Graduate School of Veterinary Medicine；kita-ku，kita 18 nishi9，Sapporo，Hokkaido 060-0818，Japan。
A/duck/Hong Kong/147/1977毒株(H9N6亚型禽流感病毒)：Perez，D.R.，Lim，W.，Seiler，J.P.，Yi，G.，Peiris，M.，Shortridge，K.F.and Webster，R.G.、Role of quail in theinterspecies transmission of H9 influenza A viruses：molecular changes on HA thatcorrespond to adaptation from ducks to chickens、J.Virol.77(5)，3148-3156(2003)。
实施例1、H9亚型禽流感病毒检测试剂盒的制备
一、引物的合成
人工合成以下3对引物(5’→3’)：
F3：TGTTTCGAGCTATACCACAA(序列表的序列2)；
B3：CCCAGAACAAGAAGGCAG(序列表的序列3)；
FIP：GATTCCTCTTGATACTTCCTCCTTTTGTGATGACCAGTGCATGG(序列表的序列4)；
BIP：GTCAAGCTGGAGTCTGAAGGAACTTTTCACAAGAGATGAGGCGAC(序列表的序列5)；
LF：TAGGTCCCATTCCGAATTGTCT(序列表的序列6)；
LB：ACAAAATCCTCACCATTTATTCGAC(序列表的序列7)。
二、检样管的制备
市售0.6ml离心管(要求无核酸污染)，装入用打孔器切下的直径1.2mm的FTA卡(Whatman，Cat No.WB120205)，得到检样管。
三、阳性对照的制备
在0.6ml离心管中加一片直径为1.2mm的FTA卡，得到检样管。取10μl病毒含量为106EID50/0.1ml的H9亚型禽流感病毒尿囊液，滴加于检样管内的FTA卡上，孵育10min后将液体吸出，留下纸片，加入100μl DEPC处理水，室温下静置3分钟后，轻柔吹吸3次后将水全部吸出，得到含有阳性对照的离心管(FTA卡片上留有阳性模板)。-20℃保存备用。
四、配制LAMP反应液
A液由溶质和溶剂组成；溶剂为双蒸水；溶质及其浓度如下：KCl为16.67nmol/μl，MgSO4.7H2O为13.33nmol/μl，(NH4)2SO4为16.67nmol/μl，钙黄绿素为0.083nmol/μl，MnCl2·4H2O为1nmol/μl，dNTPs各2.33nmol/μl，甜菜碱(Betaine)为0.33μmol/μl，Tris-HCl(是以1M pH8.8Tris-HCl的形式加入的)为33.33nmol/μl，Tween-20为0.17％(体积百分含量)，F3为0.33pmol/μl，B3为0.33pmol/μl，FIP为2.67pmol/μl，BIP为2.67pmol/μl，LF为1.33pmol/μl，LB为1.33pmol/μl。
B液由溶质和溶剂组成；溶剂为双蒸水；溶质及其浓度如下：Bst DNA聚合酶为7.52U/μl，AMV反转录酶为0.6U/μl。
五、试剂盒的组装
试剂盒由以下物质组成：A液、B液、含有阳性对照的离心管和检样管。
实施例2、H9亚型禽流感病毒检测试剂盒的制备
一、引物的合成
同实施例1的步骤一。
二、反应管的制备
同实施例1的步骤二。
三、阳性对照的制备
同实施例1的步骤三。
四、配制LAMP反应液
A液由溶质和溶剂组成；溶剂为双蒸水；溶质及其浓度如下：KCl为16.67nmol/μl，MgSO4.7H2O为13.33nmol/μl，(NH4)2SO4为16.67nmol/μl，钙黄绿素为0.083nmol/μl，MnCl2·4H2O为1nmol/μl，dNTPs各2.33nmol/μl，甜菜碱(Betaine)为0.33μmol/μl，Tris-HCl(是以1M pH8.8 Tris-HCl的形式加入的)为33.33nmol/μl，Tween-20为0.17％(体积百分含量)，F3为0.28pmol/μl，B3为0.28pmol/μl，FIP为2.22pmol/μl，BIP为2.22pmol/μl，LF为1.11pmol/μl，LB为1.11pmol/μl。
B液由溶质和溶剂组成；溶剂为双蒸水；溶质及其浓度如下：Bst DNA聚合酶为7.52U/μl，AMV反转录酶为0.6U/μl。
五、试剂盒的组装
同实施例1的步骤五。
实施例3、H9亚型禽流感病毒检测试剂盒的制备
一、引物的合成
同实施例1的步骤一。
二、反应管的制备
同实施例1的步骤二。
三、阳性对照的制备
同实施例1的步骤三。
四、配制LAMP反应液
A液由溶质和溶剂组成；溶剂为双蒸水；溶质及其浓度如下：KCl为16.67nmol/μl，MgSO4.7H2O为13.33nmol/μl，(NH4)2SO4为16.67nmol/μl，钙黄绿素为0.083nmol/μl，MnCl2·4H2O为1nmol/μl，dNTPs各2.33nmol/μl，甜菜碱(Betaine)为0.33μmol/μl，Tris-HCl(是以1M pH8.8Tris-HCl的形式加入的)为33.33nmol/μl，Tween-20为0.17％(体积百分含量)，F3为0.39pmol/μl，B3为0.39pmol/μl，FIP为3.11pmol/μl，BIP为3.11pmol/μl，LF为1.55pmol/μl，LB为1.55pmol/μl。
B液由溶质和溶剂组成；溶剂为双蒸水；溶质及其浓度如下：Bst DNA聚合酶为7.52U/μl，AMV反转录酶为0.6U/μl。
五、试剂盒的组装
同实施例1的步骤三。
实施例4、H9亚型禽流感病毒检测试剂盒的应用
取1只确诊为H9亚型禽流感病毒感染的病鸡和1只健康鸡。分别采集两只鸡的咽拭子，采用实施例1制备的试剂盒对样本进行检测。
一、样本的处理
将采集的咽拭子放入2.0ml螺口离心管中，加入1ml双蒸水(采用生理盐水或市售纯净水也可)涮洗后，取上清液于另一2.0ml螺口离心管中，沸水浴中煮沸10min，冷却至室温后即可做模板使用。也可用泄殖腔拭子代替咽喉拭子，样本处理方法相同。
采用病鸡的咽喉拭子进行上述处理，取模板至3支离心管中(每支离心管10μl)，作为I组反应管。采用健康鸡的咽喉拭子进行上述处理，取模板至3支离心管中(每支离心管10μl)，作为II组反应管。取双蒸水至3支离心管中(每支离心管10μl)，作为阴性对照管。取3支含有阳性对照的离心管，每只离心管内的FTA卡片上加10μl双蒸水，作为阳性对照管。
二、环介导等温扩增
将A液和B液充分混合均匀(9体积份A液和1体积份B液混合)，得到混合液。
取I组反应管、II组反应管、阴性对照管和阳性对照管(各3支)，每管加入20μl混合液，进行环介导等温扩增。
环介导等温扩增的反应条件为：置于60℃恒温水浴反应90min。
三、检视
环介导等温扩增后，通过直接检视判断样本是否含有H9亚型禽流感病毒。结果见图1。阳性对照管均由棕黄色变为亮绿色，阴性对照管均保持棕黄色不变。健康鸡的3支反应管均为棕黄色，病鸡的3支反应管均有亮绿色可见荧光。
实施例5、H9亚型禽流感病毒检测试剂盒的应用
取1只确诊为H9亚型禽流感病毒感染的病鸡和1只健康鸡。对两只鸡采咽喉拭子，分别采用实施例1制备的试剂盒对样本进行检测。
一、样本的处理
同实施例4的步骤一。
二、环介导等温扩增
将A液和B液充分混合均匀(9体积份A液和1体积份B液混合)，得到混合液。
取I组反应管、II组反应管、阴性对照管和阳性对照管(各3支)，每管加入20μl混合液，进行环介导等温扩增。
环介导等温扩增的反应条件为：置于65℃恒温水浴反应80min。
三、检视
环介导等温扩增后，通过直接检视判断样本是否含有H9亚型禽流感病毒。结果见图2。阳性对照管均由棕黄色变为亮绿色，阴性对照管均保持棕黄色不变。健康鸡的3支反应管均为棕黄色，病鸡的3支反应管均有亮绿色可见荧光。
实施例6、H9亚型禽流感病毒检测试剂盒的应用
取1只确诊为H9亚型禽流感病毒感染的病鸡和1只健康鸡。对两只鸡采咽喉拭子，分别采用实施例2制备的试剂盒对样本进行检测。
一、样本的处理
同实施例4的步骤一。
二、环介导等温扩增
将A液和B液充分混合均匀(9体积份A液和1体积份B液混合)，得到混合液。
取I组反应管、II组反应管、阴性对照管和阳性对照管(各3支)，每管加入20μl混合液，进行环介导等温扩增。
环介导等温扩增的反应条件为：置于60℃恒温水浴反应70min。
三、检视
环介导等温扩增后，通过直接检视判断样本是否含有H9亚型禽流感病毒。结果见图3。阳性对照管均由棕黄色变为亮绿色，阴性对照管均保持棕黄色不变。健康鸡的3支反应管均为棕黄色，病鸡的3支反应管均有亮绿色可见荧光。
实施例7、H9亚型禽流感病毒检测试剂盒的应用
取1只确诊为H9亚型禽流感病毒感染的死鸡和1只健康鸡。对两只鸡采咽喉拭子，分别采用实施例3制备的试剂盒对样本进行检测。
一、样本的处理
同实施例4的步骤一。
二、环介导等温扩增
将A液和B液充分混合均匀(9体积份A液和1体积份B液混合)，得到混合液。
取I组反应管、II组反应管、阴性对照管和阳性对照管(各3支)，每管加入20μl混合液，进行环介导等温扩增。
环介导等温扩增的反应条件为：置于65℃恒温水浴反应60min。
三、检视
环介导等温扩增后，通过直接检视判断样本是否含有H9亚型禽流感病毒。结果见图4。阳性对照管均由棕黄色变为亮绿色，阴性对照管均保持棕黄色不变。健康鸡的3支反应管均为棕黄色，死鸡的3支反应管均有亮绿色可见荧光。
实施例8、H9亚型禽流感病毒检测试剂盒的应用
取1只确诊为H9亚型禽流感病毒感染的死鸡和1只健康鸡。分别无菌取两只鸡的心脏，采用实施例1制备的试剂盒对心脏样本进行检测。
一、样本的处理
将肺置于研钵中，超低温冻结称量后，迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵充分研磨组织直至成粉末状，其间可以补加液氮。充分研磨后，用商品化RNA提取试剂盒(Trizol Reagent，Invitrogen)提取核酸，则所得核酸溶液可直接作为模板使用。也可用心脏其它肺等组织代替，处理方法相同。
采用死鸡的心脏进行上述处理，取模板至3支离心管中(每支离心管10μl)，作为I组反应管。采用健康鸡的心脏进行上述处理，取模板至3支离心管中(每支离心管10μl)，作为II组反应管。取双蒸水至3支离心管中(每支离心管10μl)，作为阴性对照管。取3支含有阳性对照的离心管，每只离心管内的FTA卡片上加10μl双蒸水，作为阳性对照管。
二、环介导等温扩增
将A液和B液充分混合均匀(9体积份A液和1体积份B液混合)，得到混合液。
取I组反应管、II组反应管、阴性对照管和阳性对照管(各3支)，每管加入20μl混合液，进行环介导等温扩增。
环介导等温扩增的反应条件为：置于63℃恒温水浴反应60min。
三、检视
环介导等温扩增后，通过直接检视判断样本是否含有H9亚型禽流感病毒。结果见图5。阳性对照管均由棕黄色变为亮绿色，阴性对照管均保持棕黄色不变。健康鸡的3支反应管均为棕黄色，死鸡的3支反应管均有亮绿色可见荧光。
实施例9、H9亚型禽流感病毒检测试剂盒的应用
取1只确诊为H9N2亚型禽流感病毒(CK/SH/06毒株)感染的死鸡和1只健康鸡。分别无菌取两只鸡的脾脏，采用实施例1制备的试剂盒对脾脏样本进行检测。
一、样本的处理
在0.6ml离心管中加一片直径为1.2mm的FTA卡，得到检样管。将脾脏超低温冻结称量后，迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵充分研磨组织直至研磨成粉末状，其间可以补加液氮。充分研磨后，按每克重量加入1ml生理盐水，充分混匀，5000rpm离心5min，吸取上清。取10μl上清液滴加于检样管中的FTA卡上，孵育10min后将液体吸出，留下纸片，加入200μl双蒸水，室温下静置3分钟后，将水全部吸出，所留FTA卡片即可作为模板使用。
得到含有阳性对照的离心管(上留有阳性模板)。-20℃保存备用。
采用死鸡的脾脏进行上述处理，得到3支离心管，每只离心管内的FTA卡片上加10μl双蒸水，作为I组反应管。采用健康鸡的脾脏进行上述处理，得到3支离心管，每只离心管内的FTA卡片上加10μl双蒸水，作为II组反应管。取双蒸水至3支离心管中(每支离心管10μl)，作为阴性对照管。取3支含有阳性对照的离心管，每只离心管内的FTA卡片上加10μl双蒸水，作为阳性对照管。
二、环介导等温扩增
将A液和B液充分混合均匀(9体积份A液和1体积份B液混合)，得到混合液。
取I组反应管、II组反应管、阴性对照管和阳性对照管(各3支)，每管加入20μl混合液，进行环介导等温扩增。
环介导等温扩增的反应条件为：置于63℃恒温水浴反应60min。
三、检视
环介导等温扩增后，通过直接检视判断样本是否含有H9亚型禽流感病毒。结果见图6。阳性对照管均由棕黄色变为亮绿色，阴性对照管均保持棕黄色不变。健康鸡的3支反应管均为棕黄色，死鸡的3支反应管均有亮绿色可见荧光。
实施例10、H9亚型禽流感病毒检测试剂盒灵敏度的检测
采用实施例1制备的试剂盒进行灵敏度检测。
一、H9亚型禽流感病毒EID50的测定
将H9N2亚型禽流感病毒(CK/SH/06毒株)尿囊液样本使用生理盐水进行10倍倍比稀释，接种10日龄SPF鸡胚，每只鸡胚接种0.1ml，每个梯度接种5枚SPF鸡胚。37℃培养72h(弃去24h内死亡的SPF鸡胚)，收集鸡胚尿囊液，测定血凝价，计算成阳性感染的鸡胚个数，参照Reed-Muench法计算该病毒的EID50。
将所测病毒尿囊液使用生理盐水10倍倍比稀释(每个稀释度设置3个重复)，得到稀释液1(病毒浓度为104.5EID50/0.1ml)、稀释液2(病毒浓度为103.5EID50/0.1ml)、稀释液3(病毒浓度为102.5EID50/0.1ml)、稀释液4(病毒浓度为101.5EID50/0.1ml)、稀释液5(病毒浓度为100.5EID50/0.1ml)，沸水浴10min后冷却至室温。
二、灵敏度的检测
将A液和B液充分混合均匀(9体积份A液和1体积份B液混合)，得到混合液。
检测组1：取10μL稀释液1(含103.5EID50病毒)，加入20μl混合液，进行环介导等温扩增。
检测组2：取10μL稀释液2(含102.5EID50病毒)，加入20μl混合液，进行环介导等温扩增。
检测组3：取10μL稀释液3(含101.5EID50病毒)，加入20μl混合液，进行环介导等温扩增。
检测组4：取10μL稀释液4(含100.5EID50病毒)，加入20μl混合液，进行环介导等温扩增。
检测组5：取10μL稀释液5(含10-0.5EID50病毒)，加入20μl混合液，进行环介导等温扩增。
阳性对照组：取3支含有阳性对照的离心管，每只离心管内的FTA卡片上加10μl双蒸水，加入20μl混合液，进行环介导等温扩增。
阴性对照组：取双蒸水至3支离心管中(每支离心管10μl)，加入20μl混合液，进行环介导等温扩增。
环介导等温扩增的反应条件为：置于63℃恒温水浴反应60min。
结果见图7。结果表明，阳性对照组的三个反应管均有亮绿色可见荧光，阴性对照组的三个反应管均为棕黄色无荧光液体。检测组1的三个反应管均有亮绿色可见荧光，检测组2的三个反应管均有亮绿色可见荧光，检测组3的三个反应管均有亮绿色可见荧光，检测组4的三个反应管均有亮绿色可见荧光，检测组5的三个反应管均为棕黄色无荧光液体。
实施例11、特异性检测
分别提取18种H亚型流感病毒、新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)和传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)病毒核酸RNA，采用实施例1制备的试剂盒进行特异性试验。
一、样本的处理
上述病毒尿囊液样本，使用用商品化RNA提取试剂(Trizol Reagent，Invitrogen)提取核酸，所得核酸溶液直接作为模板使用。各毒株分别取模板至不同管中(每支离心管10μl)，作为各组反应管，每组包含3个反应管心管。取双蒸水至3支离心管中(每支离心管10μl)，作为阴性对照管。取3支含有阳性对照的离心管，每只离心管内的FTA卡片上加10μl双蒸水，作为阳性对照管。
二、环介导等温扩增
将A液和B液充分混合均匀(9体积份A液和1体积份B液混合)，得到混合液。
取I组反应管、II组反应管、阴性对照管和阳性对照管(各3支)，每管加入20μl混合液，进行环介导等温扩增。
环介导等温扩增的反应条件为：置于63℃恒温水浴反应60min。
三、检视
环介导等温扩增后，通过直接检视判断特异性试验结果。阳性对照管均由棕黄色变为亮绿色，阴性对照管均保持棕黄色不变。各毒株特异性检视结果见表2和图8。
表2毒株及特异性实验结果
注：-棕黄色；+亮绿色
实施例12、试剂盒H9亚型禽流感病毒不同N亚型病毒的检测效果
分别提取4种不同N亚型的H9亚型流感病毒病毒核酸RNA，采用实施例1制备的试剂盒进行特异性试验。毒株样本为A/Duck/Shantou/2030/00(H9N1)、CK/SH/06(H9N2)、A/duck/Hong Kong/147/77(H9N6)、A/duck/Hokkaido/HY57/2005(H9N4)。
一、样本的处理
各毒株分别取模板(核酸RNA)至不同管中(每支离心管10μl)，作为各组反应管，每组包含3个反应管心管。取双蒸水至3支离心管中(每支离心管10μl)，作为阴性对照管。取3支含有阳性对照的离心管，每只离心管内的FTA卡片上加10μl双蒸水，作为阳性对照管。
二、环介导等温扩增
将A液和B液充分混合均匀(9体积份A液和1体积份B液混合)，得到混合液。
取I组反应管、II组反应管、阴性对照管和阳性对照管(各3支)，每管加入20μl混合液，进行环介导等温扩增。
环介导等温扩增的反应条件为：置于63℃恒温水浴反应60min。
三、检视
环介导等温扩增后，通过直接检视判断特异性试验结果。阳性对照管均由棕黄色变为亮绿色，阴性对照管均保持棕黄色不变。各毒株特异性试验检视结果见图9。
结果表明，阳性对照组的三个反应管均有亮绿色可见荧光，阴性对照组的三个反应管均为棕黄色无荧光液体。四个毒株的反应管均有亮绿色可见荧光。
Claims (7)
1.一种检测H9亚型禽流感病毒的专用引物，由以下三对环介导等温扩增所用引物组成；一对引物是与H9亚型禽流感病毒的HA基因结合的内侧引物对，一对引物是与H9亚型禽流感病毒的HA基因结合的外侧引物对，一对引物是与H9亚型禽流感病毒的HA基因结合的环形引物对；所述HA基因如GenBank Accession Number EU644482中所示；
所述内侧引物对由上游引物FIP和下游引物BIP组成，所述上游引物FIP的核苷酸序列是序列表中的序列4，所述下游引物BIP的核苷酸序列是序列表中的序列5；所述外侧引物对由上游引物F3和下游引物B3组成，所述上游引物F3的核苷酸序列是序列表中的序列2，所述下游引物B3的核苷酸序列是序列表中的序列3；所述环形引物对由上游引物LF和下游引物LB组成，所述上游引物LF的核苷酸序列是序列表中的序列6，所述下游引物LB的核苷酸序列是序列表中的序列7。
2.权利要求1所述的专用引物在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒用于辅助鉴定H9亚型禽流感病毒和/或检测待测样本是否含有H9亚型禽流感病毒。
3.一种含有权利要求1所述的专用引物的试剂盒；所述试剂盒用于辅助鉴定H9亚型禽流感病毒和/或检测待测样本是否含有H9亚型禽流感病毒。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括溶液A；所述溶液A是将溶质溶于水得到的；所述溶质及其浓度如下：KCl为16.67nmol/μl，MgSO4·7H2O为13.33nmol/μl，(NH4)2SO4为16.67nmol/μl，钙黄绿素为0.083nmol/μl，MnCl2·4H2O为1nmol/μl，dNTPs各2.33nmol/μl，甜菜碱为0.33μmol/μl，Tris-HCl为33.33nmol/μl，Tween-20为0.17％(体积百分含量)，所述上游引物F3为0.28-0.39pmol/μl，所述下游引物B3为0.28-0.39pmol/μl，所述上游引物FIP为2.22-3.11pmol/μl，所述下游引物BIP为2.22-3.11pmol/μl，所述上游引物LF为1.11-1.55pmol/μl，所述下游引物LB为1.11-1.55pmol/μl。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述溶液A中，所述上游引物F3为0.33pmol/μl，所述下游引物B3为0.33pmol/μl，所述上游引物FIP为2.67pmol/μl，所述下游引物BIP为2.67pmol/μl，所述上游引物LF为1.33pmol/μl，所述下游引物LB为1.33pmol/μl。
6.如权利要求3或4或5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括溶液B；所述溶液B由溶剂和溶质组成；所述溶剂为水；所述溶质及其浓度如下：Bst DNA聚合酶为7.52U/μl，AMV反转录酶为0.6U/μl。
7.一种检测来自死亡动物的样品中是否携带H9亚型禽流感病毒的方法，是用权利要求1所述专用引物对来自死亡动物的样品的总RNA进行反转录环介导等温扩增反应，检测扩增产物，确定来自死亡动物的样品中是否携带H9亚型禽流感病毒；所述环介导等温扩增反应的条件为：60-65℃、60-90分钟。
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