CN101196476A - H9亚型禽流感病毒的快速检测方法 - Google Patents

Abstract

H9亚型禽流感病毒的快速检测方法，公开了一种鉴定病毒，特别是鉴定禽流感H9亚型病毒的检测方法。采用Trizol kit提取样本基因RNA，然后进行RT－LAMP扩增病毒基质蛋白基因的特定区域，最后加入显色液鉴定，如果颜色变为绿色，则待检样品为H9N2亚型禽流感病毒，如果颜色为黄色，则待检样品不是H9N2亚型禽流感病毒。本发明较经典方法的病毒分离、鉴定和血清学分型试验方法以及目前普遍采用的PCR方法快速、准确。

Description

H9亚型禽流感病毒的快速检测方法

技术领域

本发明公开了一种鉴定病毒，特别是鉴定禽流感H9亚型病毒的检测方法。

背景技术

禽流感(Avian influenza，AI)是由A型流感病毒引起的家禽及野生禽类感染或疾病的综合征，其病原禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)属正粘病毒科，A型流感病毒属。根据AIV表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原关系可分为不同的亚型，依据AIV对禽类致病性的不同，又可将AIV分为高致病性禽流感病毒(Highly pathogenic avian influenzavirus，HPAIV)和低致病性禽流感病毒(Mildly pathogenic avian influenzavirus，MPAIV)。

H9亚型AIV属于MPAIV，最早报道于1966年。20世纪90年代初，该亚型病毒在野鸟和家禽中的分离率还相对较低，没有造成大面积的流行。但自20世纪90年代后期以来，家禽(特别是鸡)的H9亚型AIV感染在亚洲和世界其它地区频繁报道。该病不仅给养禽业造成了重大的经济损失，也给人类公共卫生构成潜在的威胁，急需加强H9亚型禽流感防治新技术研究工作。

在H9亚型禽流感疫情防控工作中，现场诊断主要依靠发病史、临床症状、病理变化和流行病学调查综合判定，这给广大兽医工作人员带来了超负荷的工作，耗时费力费钱。现场诊断工作中急需快速准确的筛检诊断方法，以利于现场疫情的确认。因此，禽流感疫情现场快速确认，对于采取果断有效的扑灭和防控措施十分关键。在实验室确诊工作中，世界动物卫生组织(OIE)规定的经典方法是病毒的分离、鉴定和血清学分型试验，这种方法报告结果时间长，工作量大。而目前普遍采用的聚合酶链反应(PCR)技术需要专门的仪器，而且存在容易交叉污染和操作过程繁琐的缺点。而荧光实时定量聚合酶链反应(real time PCR)技术虽然较好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程，但需要更复杂的定量测定仪器，因此不适于现场快速检测，同时由于检测成本较高，也加大了推广应用的难度。环介导等温扩增(Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP)技术具有特异性强、灵敏度高、快速且成本低等优点，其特点是对靶基因的6个部位设定4种引物，利用链置换反应在恒温下使靶基因高效扩增。另外，由于实行的是等温扩增，反应在恒温水浴箱内便可完成，不仅节约仪器成本，而且是操作方法更简单，适于现场快速检测。但目前还未见有应用LAMP检测H9亚型禽流感病毒的方法。

发明内容

本发明目的在于为人们提供一种能快速鉴定出样本是否为H9亚型禽流感病毒的快速检测方法。

本发明采用Trizol kit提取样本基因RNA，然后进行RT-LAMP扩增病毒基质蛋白基因的特定区域，最后加入显色液鉴定，如果颜色变为绿色，则待检样品为H9N2亚型禽流感病毒，如果颜色为黄色，则待检样品不是H9N2亚型禽流感病毒。

其中，

采  用  上  游  内  引  物    (  FIP  )    为  ：

GGTCACCGTTCCCATTCGGTTGCAGTTACTCAACTGGTGCGC；

下    游    内    引    物(    BIP    )    为    ：

TGGCTCTTGGCCTAGTATGTGCTCGCCATCTGTCTGTGAGA；

上游外引物(F3)为：ACATTCCATGGAGCAAAGGA；

下游外引物(B3)为：TGCCTGATTAGTGGGTTGGT。

在现有的关于LAMP技术的公开文献中，没有将LAMP用于H9亚型禽流感病毒检测的报道。本发明通过使用特异性引物，利用LAMP技术扩增靶基因的特定区域，从分子水平对H9亚型禽流感病毒进行快速检测。本发明较经典方法的病毒分离、鉴定和血清学分型试验方法以及目前普遍采用的PCR方法快速、准确。

具体实施方式：

一、引物的设计：

根据GenBank库中已发表的H9亚型禽流感病毒基质蛋白(MP)基因序列设计特异性引物，引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。

上    游    内    引    物    (    FIP    )    为    ：

GGTCACCGTTCCCATTCGGTTGCAGTTACTCAACTGGTGCGC

下    游    内    引    物    (    BIP    )    为    ：

TGGCTCTTGGCCTAGTATGTGCTCGCCATCTGTCTGTGAGA

上游外引物(F3)为：ACATTCCATGGAGCAAAGGA

下游外引物(B3)为：TGCCTGATTAGTGGGTTGGT

二、RT-LAMP：

1)病毒的扩增：将禽流感病毒接种于10日龄SPF鸡胚的尿囊腔中，36-72小时后收集死亡鸡胚的尿囊液，并检测其血凝价；为了能够定量该体系的灵敏度，还测定该尿囊液的SPF 鸟胚半数致死量(ELD₅₀＝10^-8.5)。

2)病毒RNA的提取：按照Trizol kit说明书提取禽流感病毒的RNA(注：在RNA沉淀时要加入糖元8-10μg，它能够和RNA共沉淀，用DEPC处理的水进行溶解)。

具体步骤如下：

①在200μL被检测液中加入1mL Trizol液后，剧烈摇匀，室温放置5-10分钟；

②加入200μL氯仿，剧烈摇匀，室温放置3-5分钟；

③12,000×g离心15分钟；

④吸取上清，加入糖元8-10μg混匀2分钟后加入异丙醇500μL，混匀，室温放置10分钟；

⑤12,000×g离心10分钟，去上清，可见沉淀，用75％乙醇洗涤，缓慢混匀后静置2分钟；

⑥7,500×g离心5分钟，完全去除乙醇，在超净台内用风吹5分钟后加入8μL焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水溶解。

3)RT-LAMP：

(禽类成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶Catalog#M5101 from promega；Bst DNA聚合酶(大片段)Catalog#M0275S from New England)

RNA                           2.0μL

AMV反转录酶(8U/μL)           1.0μL

核酸酶抑制剂(40U/μL)         0.25μL

Bst DNA聚合酶(8U/μL)         1.0μL

Bst DNA聚合酶缓冲液           2.5μL

甜菜碱(5mol/L)                5.0μL

硫酸镁(100mmol/L)             1.5μL

dNTP(10mmol/L)                1.5μL

上游内引物(FIP)(20μmol/L)    2.0μL

下游内引物(BIP)(20μmol/L)    2.0μL

上游外引物(F3)(10μmol/L)     0.5μL

下游外引物(B3)(10μmol/L)     0.5μL

DEPC处理水                    5.25μL

                                                     

总体积                        25μL

然后65℃水浴90分钟，同时以DEPC处理水为阴性对照。

三、RT-LAMP扩增产物的鉴定：

在反应管中加入1μL 10％SYBR Green I显色液(10000×)(荧光染料SYBR Green I Catalog#S7563 from Invitrogen)(用电泳缓冲液将10000×的荧光染料SYBR Green I稀释1000倍，即为10％SYBR Green I显色液)，混匀，直接肉眼观察颜色变化，如果颜色变为绿色，说明待检样品为H9N2亚型禽流感病毒，如果颜色为黄色，说明待检样品不是H9N2亚型禽流感病毒。

<110>扬州大学

<120>H9亚型禽流感病毒的快速检测方法

<160>4

<210>1

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据H9亚型禽流感病毒基质蛋白(MP)基因序列设计

<400>1

ggtcaccgtt cccattcggt tgcagttact caactggtgc gc

<210>2

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据H9亚型禽流感病毒基质蛋白(MP)基因序列设计

<400>2

tggctcttgg cctagtatgt gctcgccatc tgtctgtgag a

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据H9亚型禽流感病毒基质蛋白(MP)基因序列设计

<400>3

acattccatg gagcaaagga

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据H9亚型禽流感病毒基质蛋白(MP)基因序列设计

<400>4

tgcctgatta gtgggttggt

Claims (2)

1.H9亚型禽流感病毒的快速检测方法，其特征在于用Trizol kit提取样本基因RNA，然后进行RT-LAMP扩增病毒基质蛋白基因的特定区域，最后加入显色液鉴定，如果颜色变为绿色，则待检样品为H9N2亚型禽流感病毒，如果颜色为黄色，则待检样品不是H9N2亚型禽流感病毒。

2.根据权利要求1所述H9亚型禽流感病毒的快速检测方法，其特征在于所述的特异性引物：

上    游    内    引    物    FIP    为    ：

GGTCACCGTTCCCATTCGGTTGTTTTCAGTTACTCAACTGGTGCGC

下    游    内    引    物    BIP    为    ：

TGGCTCTTGGCCTAGTATGTGCTTTTTCGCCATCTGTCTGTGAGA

上游外引物F3为：ACATTCCATGGAGCAAAGGA

下游外引物B3为：TGCCTGATTAGTGGGTTGGT。