CN105219876A - 一种人季节性流感病毒分型检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents

一种人季节性流感病毒分型检测试剂盒及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人季节性流感病毒多重PCR-ELISA检测试剂盒及其使用方法。本发明涉及的检测试剂盒由RT-PCR反应体系、ELISA检测体系、4个靶基因(甲型流感病毒M基因、H1亚型病毒HA基因、H3亚型病毒HA和B型病毒NS基因)阳性质粒(Pa-m,Ph1-ha、Ph3-ha和Pb-ns)、阴性质控品和4个靶基因的特异性引物探针组成。用这4组生物素标记的特异性引物，通过RT-PCR进行特异性扩增，扩增产物变性后与地高辛标记的特异性探针杂交，杂交产物包被链霉亲和素包被的96孔微板，加入辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体通过ELISA法进行检测，建立了一种快速、敏感、特异的季节性甲型流感H1、H3亚型和乙型病毒分型检测方法。本发明涉及4组特异性引物探针在流感病毒感染临床鉴别诊断和流感病毒分离株分型鉴定中的用途。

Description

一种人季节性流感病毒分型检测试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人季节性流感病毒多重PCR-ELISA检测试剂盒及其使用方法。
背景技术
季节性流感是由流感病毒引起的一种人类重要的全球性呼吸道传染病，热带地区常年流行，而在温带地区主要发生在冬季，具有一定的季节性流行特点。流感病毒分属于正粘病毒科的三个流感属：甲型(A)、乙型(B)和丙型(C)流感病毒。丙型流感病毒临床上症状较轻，公共卫生意义不显著。甲型和乙型流感病毒是每年季节性流感流行的主要病原，可以感染所有人群，对一些特殊人群(如孕妇、老年人和基础性疾病患者)能引起严重疾病乃至死亡。根据病毒表面2个糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原性，甲型流感病毒可以分为不同的血清亚型，现在已经发现16种HA亚型(H1-H16)和9种NA亚型(N1-N9)，目前在人群中流行主要是甲型H1N1和H3N2亚型流感病毒。WHO在全球建立了季节性流感监测网络，以了解病毒流行情况，为流感全球防控和疫苗研制提供科学依据。
季节性甲H1、甲H3和乙型流感病毒的分型检测是流感监测和临床诊断的重要内容。季节性流感病毒的分型检测方法主要包括血清学和核酸检测，血清学方法主要用标准血清对分离到的病毒株进行抗原分型，耗时费力，不适合临床快速分型诊断。目前核酸检测方法主要包括普通PCR法、Real-timetimePCR法和环等温扩增(LAMP)法等。Real-timetimePCR法和LAMP法具有很好的特异性和敏感性，但前者依赖昂贵的仪器和试剂；而后者难以实现多重检测。相比之下，普通PCR敏感性较差且需要琼脂糖电泳进行结果判定，不适合大规模标本的检测。因此，需要建立一种成本低、通量高的敏感特异性季节性流感核酸分子检测方法，以提高流感监测和临床诊断水平。
发明内容
本发明需要解决的问题是提供一种分型检测季节性H1亚型、H3亚型和B型流感病毒核酸的RT-PCR-ELISA试剂盒及其在分型检测中的应用。
本发明提供的人季节性流感病毒PCR-ELISA分型检测试剂盒由RT-PCR反应体系、4个靶基因(甲型流感病毒M基因、H1亚型病毒HA基因、H3亚型病毒HA和B型病毒NS基因)阳性质粒(Pa-m,Ph1-ha、ph3-ha和pb-ns)、阴性质控品和4个靶基因的特异性引物探针组成。4个靶基因的引物探针名称和序列见表1。
表1靶基因的引物探针名称和序列
本发明所述人季节性流感病毒多重PCR-ELISA检测试剂盒在H1亚型、H3亚型和B型流感病毒分型检测中的使用方法：
(1)病毒核酸提取：采用常规方法提取临床鼻咽拭子标本或病毒培养物核酸，-70℃冰箱放置备用。
(2)RT-PCR反应：采用TaKaRa公司的一步法试剂盒进行PCR扩增反应。反应条件为：50℃逆转录30min，94预变性2min，热循环参数为94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环后，72℃延伸7min，得到生物素标记的PCR产物，同时设置空白对照组。
(3)ELISA检测:取扩增好的生物素标记的PCR产物5μL，加至10μL的0.1mol/LNaOH溶液中，于室温下变性10min，再加入10nmol/L地高辛标记的特异性探针(用含有300mmol/LNaCl，100mmol/LTris-HClpH6.5，10mmol/LEDTA，0.1％Twee-20的杂交液稀释)，50℃孵育10min。随后，取100μL液体加至链霉亲和素包被的96孔微板中，50℃孵育60min，弃去孔中液体，加入300μLPBST洗板5次。然后加入辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体100μL，37℃孵育60min，洗板5次，最后加入TMB显色液进行显色，一定时间后加入终止液终止显色，于酶标仪450nm波长处测定其吸光度值(OD)。本实验需设置两个或两个以上重复，同时以PCR扩增反应中的空白对照作为阴性对照组，若实验组的OD值>2倍阴性对照组平均OD值，则判定为阳性，反之则为阴性。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：。
设计针对靶基因的特异性引物探针，通过PCR-ELISA方法，可以对临床上季节性流感病毒标本和病毒分离物进行分型鉴定，具有快速、敏感、特异等特点；且无需昂贵仪器设备，便于操作，为流感监测和临床救治提供一种新的检测方法，是一种成本低、通量高的敏感特异性季节性流感核酸分子检测方法。
附图说明
图1通过Pa-m,Ph1-ha、ph3-ha和pb-ns质粒比较普通PCR和PCR-ELISA的敏感性
具体实施方式
下面提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方案，但本发明技术的应用不限于实施例。
实施例1：靶基因质粒构建
设计特异性引物，分别针对甲型流感病毒M基因、H1亚型病毒HA基因、H3亚型病毒HA和乙型病毒NS基因，通过PCR法扩增获得4个目的基因片段，回收纯化后的分别与T载体连接，获得靶基因阳性质粒，分别命名为Pa-m,Ph1-ha、ph3-ha和pb-ns。
实施例2：PCR-ELISA法敏感性
(1)PCR反应：分别将靶基因克隆质粒Pa-m,Ph1-ha、ph3-ha和pb-ns稀释100倍，再按10倍梯度稀释成10-2-10-9共八个浓度，以此为模板，使用上述由生物素标记的引物，采用TaKaRa公司的一步法试剂盒进行PCR扩增反应。反应条件为：94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环后，72℃延伸7min，得到生物素标记的PCR产物，同时设置空白对照组。
(2)ELISA检测：取扩增好的生物素标记的PCR产物5μL，加至10μL的0.1mol/LNaOH溶液中，于室温下变性10min，再加入10nmol/L地高辛标记的特异性探针(用含有300mmol/LNaCl，100mmol/LTris-HClpH6.5，10mmol/LEDTA，0.1％Twee-20的杂交液稀释)，50℃孵育10min。随后，取100μL液体加至链霉亲和素包被的96孔微板中，50℃孵育60min，弃去孔中液体，加入300μLPBST洗板5次。然后加入辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体100μL，37℃孵育60min，洗板5次，最后加入TMB显色液进行显色，一定时间后加入终止液终止显色，于酶标仪450nm波长处测定其吸光度值(OD)。本实验需设置两个或两个以上重复，同时以PCR扩增反应中的空白对照作为阴性对照组，若实验组的OD值>2倍阴性对照组平均OD值，则判定为阳性，反之则为阴性。
表2RT-PCR-ELISA法检测靶基因的敏感性
由表2可以看出，相比于传统的RT-PCR扩增技术，本实验中所建立的PCR-ELISA方法敏感度是其10-100倍，很好的解决了RT-PCR技术敏感性较差这一问题。
实施例3：PCR-ELISA法特异性
以肠道病毒、呼吸道冠状病毒、鼻病毒、呼吸道合胞体病毒、甲型流感病毒H1、H3、H5、H7和H9亚型和乙型流感核酸为模板，用上述4套引物进行PCR-ELISA实验。结果4套引物对肠道病毒、呼吸道冠状病毒、鼻病毒、呼吸道合胞体病毒核酸不能扩增，不同亚型流感病毒之间也不存在交叉反应，表明建立的PCR-ELISA方法具有较好的特异性。。
实施例3：临床标本检测
收集104份临床样本，其中H1N1型流感病毒49个，H3N2型流感病毒44个，B型流感病毒11个，所有标本都经过细胞培养进行病毒分离。
(1)病毒RNA提取
采用酚氯仿法提取病毒RNA，具体步骤：1.取临床标本(鼻咽拭子或病毒分离物)100μL，加入含有300ulDEPC水的1.5mlEP中，充分混匀后加入200ul水饱和酚，剧烈震荡混匀，静置3min，加入200ul氯仿，充分震荡混匀，12000g室温离心15分钟。2.吸取上清液，加入两倍上清体积的异丙醇，再加入1/10上清体积3M醋酸钠约40ul，充分混匀后-20℃静置2h；取出于4℃下，12000g，离心20min。3.弃上清，加入75％乙醇1ml，4℃，12000g，离心20min。4.弃上清，室温干燥，加入40ulDEPC水溶解RNA。
(2)RT-PCR反应：取5ul核酸，使用上述由生物素标记的引物，采用TaKaRa公司的一步法试剂盒进行PCR扩增反应。反应条件为：94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环后，72℃延伸7min，得到生物素标记的PCR产物，同时设置空白对照组。
(3)ELISA检测：取扩增好的生物素标记的PCR产物5μL，加至10μL的0.1mol/LNaOH溶液中，于室温下变性10min，再加入10nmol/L地高辛标记的特异性探针(用含有300mmol/LNaCl，100mmol/LTris-HClpH6.5，10mmol/LEDTA，0.1％Twee-20的杂交液稀释)，50℃孵育10min。随后，取100μL液体加至链霉亲和素包被的96孔微板中，50℃孵育60min，弃去孔中液体，加入300μLPBST洗板5次。然后加入辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体100μL，37℃孵育60min，洗板5次，最后加入TMB显色液进行显色，3min后加入终止液终止显色，于酶标仪450nm波长处测定其吸光度值(OD)。本实验需设置两个或两个以上重复，同时以PCR扩增反应中的空白对照作为阴性对照组，若实验组的OD值>2倍阴性对照组平均OD值，则判定为阳性，反之则为阴性。
通过多重PCR-ELISA检测了104临床样本，其中H1N1型流感病毒49个，H3N2型流感病毒44个，B型流感病毒11个，结果均与细胞培养一致。

Claims (2)

1.一种基于RT-PCR-ELISA的人季节性流感病毒分型检测试剂盒，其特征是试剂盒的组成部分为AMV反转录体系、PCR反应体系、阳性质控品、阴性质控品和4种流感病毒靶基因特异性引物探针，4种流感病毒靶基因特异性引物探针的名称和序列分别是：FluA-M-Fttctaaccgaggtcgaaacgtatgt、FluA-M-RBIO–acggtgagcgtgaaaacaaaccc、FluA-M-PDIG-tcaggccccctcaaagccgagat、H1-Facaaaattgagactggccacagg、H1-RBIO–ccaatagaaccaacagttcggca、H1-PDIG-tatcaccatcaaaatgagcagggg、H3-Faaacgtgactatgccaaacaatgaac、H3-RBIO–tgaagtaacccctaggagcaatta、H3-PDIG-caatagtaaaaccgggagacatact、FluB-NS-Faatagtattaagggacatgaacaac、FluB-NS-RBIO-ctaattgtctccctcttctggtgat和FluB-NS-PDIG-tcaattcactcttcgagcgtctt。
------------------------------------------------------------------------------------
2.根据权利要求1所述一种基于RT-PCR-ELISA的试剂盒的使用方法，其特征是由以下步骤构成:
(1)RT-PCR反应：采用TaKaRa公司的一步法试剂盒进行PCR扩增反应，反应条件为：50℃逆转录30min，94预变性2min，热循环参数为94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环后，72℃延伸7min，得到生物素标记的PCR产物，同时设置空白对照组；
(2)ELISA检测：取扩增好的生物素标记的PCR产物5μL，加至10μL的0.1mol/LNaOH溶液中，于室温下变性10min，再加入10nmol/L地高辛标记的特异性探针，用含有300mmol/LNaCl，100mmol/LTris-HClpH6.5，10mmol/LEDTA，0.1％Twee-20的杂交液稀释，50℃孵育10min，随后，取100μL液体加至链霉亲和素包被的96孔微板中，50℃孵育60min，弃去孔中液体，加入300μLPBST洗板5次，然后加入辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体100μL，37℃孵育60min，洗板5次，最后加入TMB显色液进行显色，3min后加入终止液终止显色，于酶标仪450nm波长处测定其吸光度值OD；
(3)结果判定：本实验需设置两个或两个以上重复，同时以PCR扩增反应中的空白对照作为阴性对照组，若实验组的OD值>2倍阴性对照组平均OD值，则判定为阳性，反之则为阴性。
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