CN109321636A - 一种用于衣原体种特异性检测的芯片及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学领域，具体公开了一种用于衣原体种特异性检测的芯片及应用。本发明依据衣原体种间高保守性以及基因芯片的原理和优势，本发明通过分析与筛选衣原体基因组，获得位于23SrDNA的高保守及种间高变异片段，设计了衣原体属特异性引物和种特异性探针，建立一种寡核苷酸探针基因芯片，PCR反应的产物结合TMB显色，达到种属特异性检测和直接眼观判读衣原体种型的效果。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体地说，涉及一种用于衣原体种特异性检测的芯片及应用。
背景技术
衣原体(Chlamydiae)是一类严格真核细胞内寄生的原核生物。根据基因同源性，形成以rRNA为基础的种系发育树，衣原体不同种之间16S rRNA和23S rRNA基因序列的同源性高达96％，构成密切相关的致病种属。其包含12个种：流产衣原体(Chlamydia abortus)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、鼠衣原体(Chlamydia muridarum)、猪衣原体(Chlamydiasuis)、家畜衣原体(Chlamydia pecorum)、豚鼠衣原体(Chlamydia caviae)、猫衣原体(Chlamydia felis)、家禽衣原体(Chlamydia gallinacea)、朱鹭衣原体(Chlamydiaavium)和鸟衣原体(Chlamydia ibidis)。衣原体的感染宿主广泛，能引起人与动物多种疾病。其中，人是沙眼衣原体和肺炎衣原体的天然宿主。Chlamydia trachomatis可引起人眼部感染致盲及泌尿生殖道感染致不孕；Chlamydia pneumoniae是呼吸道感染中最常见的病原菌，导致咽炎、肺炎等；Chlamydia abortus是绵羊、山羊、牛、猪感染性流产最常见的病原体，孕妇感染后可发生流产；Chlamydia psittaci的感染可爆发于家禽和野鸟，引起典型的呼吸道疾病，亦会导致人呼吸道疾病，近年还新发现感染鸟类和家禽的衣原体新种：Chlamydia gallinacea，Chlamydia avium和Chlamydia ibidis。其余哺乳动物衣原体都有一定宿主特异性：如Chlamydia pecorum可引起家畜的脑炎、肺炎、肠炎、泌尿生殖道感染和不孕；Chlamydia suis可引起猪的结膜炎、肠炎和肺炎。衣原体作为人畜共患传染病病原，不仅严重威胁人类健康，也对畜牧业生产造成巨大威胁与损失。因此，对衣原体的监测十分必要，有助于人类公共卫生的管理以及养殖业的预防和控制。
衣原体诊断的基本诊断方法依赖于形态学检查，基于衣原体生长繁殖过程中独特的包涵体形态，取疑似感染的标本先进行细胞接种培养，再进行染色和显微镜观察包涵体。此方法特异性较可靠，但是耗时长、需要成熟的细胞与衣原体培养技术，只局限于实验室的初步检测。免疫学检测法为衣原体诊断的主要手段，包括免疫荧光技术、ELISA技术、免疫层析法等。如英国OXOID公司的直接免疫荧光法(DFA)检测衣原体试剂盒(IMAGENTMChlamydia，编号：K610111-2)：病料抹片固定后，进行直接免疫荧光法荧光染色，利用荧光显微镜检查衣原体。其次，建立在ELISA技术上的衣原体检测基本为衣原体感染血清学检测，如IDEXX公司的流产衣原体抗体诊断试剂盒(IDEXX Chlamydiosis Total Ab Test，货号CLA1135T)，然而其无法区分鹦鹉热衣原体、流产衣原体的感染；英国Cellabs公司采用免疫层析技术一步法检测子宫拭子样本中的沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)，这些方法简单快速，但判断时具有主观性，无法达到高特异性和种属性鉴定。当前也建立了衣原体荧光定量PCR等分子生物学检测法，例如英国生物公司——Primerdesign公司的鹦鹉热衣原体qPCR检测试剂盒(Chlamydophila psittaci genesig Standard Kit)、肺炎衣原体qPCR检测试剂盒(Chlamydia pneumoniae genesig Standard Kit)、沙眼热衣原体qPCR检测试剂盒(Chlamydia trachomatis genesig Standard Kit)以及法国ID-VET公司Chlamydia spp.衣原体属特异性qPCR检测试剂盒，虽然通过探针可增加特异性，但是这些公司的检测产品也只局限于针对衣原体属或某一单个的衣原体种的检测。然而针对衣原体各个种之间的高保守性，以及序列间更细微的差异(单核苷酸多态性)，PCR本身无法达到这种分辨能力。因而当前除了测序之外，仍然没有一种实际且有效的检测方法能解决衣原体各个种的分型检测。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种用于衣原体种特异性检测的芯片及应用。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
本发明首先提供一种用于衣原体种特异性检测的探针组，包括：
鹦鹉热衣原体种特异性探针，如SEQ ID NO.3～4所示；
流产衣原体种特异性探针，如SEQ ID NO.5～6所示；
家禽衣原体种特异性探针，如SEQ ID NO.7所示；
朱鹭衣原体种特异性探针，如SEQ ID NO.8所示；
鸟衣原体种特异性探针，如SEQ ID NO.9所示；
猫衣原体种特异性探针，如SEQ ID NO.10所示；
鼠衣原体种特异性探针，如SEQ ID NO.11所示；
猪衣原体种特异性探针，如SEQ ID NO.12所示；
沙眼衣原体种特异性探针，如SEQ ID NO.13所示；
肺炎衣原体种特异性探针，如SEQ ID NO.14～16所示；
家畜衣原体种特异性探针，如SEQ ID NO.17所示；
豚鼠衣原体种特异性探针，如SEQ ID NO.18所示。
进一步地，本发明提供一种用于衣原体种特异性检测的芯片，包括本领域常规的芯片载体和前述探针组。
作为优选，本发明采用尼龙膜作为芯片载体。
更进一步地，本发明提供一种用于衣原体种特异性检测的试剂盒，包括上述芯片。
所述试剂盒除上述芯片外，还包括1对衣原体属通用且特异性引物，如SEQ IDNO.1～2所示。
作为优选，所述芯片还包括1条显色质控兼定位探针，序列如SEQ ID NO.21所示；1条阳性对照探针，序列如SEQ ID NO.22所示；1条阴性对照探针，所述阴性对照探针为点样稀释液。
更为优选地，所述芯片还包括2条属特异性质控探针，为与衣原体属亲缘性非常近的新衣原体属和原衣原体属的属特异性探针，序列分别如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示。
作为优选，所述芯片上探针点样浓度为5ng/μL。
进一步地，为了确保本发明所述芯片的检测准确性，所述试剂盒包括一套与所述芯片配套使用的质粒标准参比品，所述质粒标准参比品由分别含有鹦鹉热衣原体、流产衣原体、家禽衣原体、朱鹭衣原体、鸟衣原体、猫衣原体、鼠衣原体、猪衣原体、沙眼衣原体、肺炎衣原体、家畜衣原体、豚鼠衣原体标准株的23S rRNA基因的重组质粒组成。
所述重组质粒由pMD18-T质粒制备。
具体地，所述质粒标准参比品包括以下12种质粒标准品：
鹦鹉热衣原体6BC株：pGM-T-6BC 23S质粒标准品；
流产衣原体B577株:pGM-T-B577 23S质粒标准品；
家禽衣原体08-1274/3株：pGM-T-08-1274/3 23S质粒标准品；
朱鹭衣原体10-1398/6株：pGM-T-10-1398/6 23S质粒标准品；
鸟衣原体10DC88株：pGM-T-10DC88 23S质粒标准品；
猫衣原体FP baker(VR-120)株：pGM-T-FP baker 23S质粒标准品；
鼠衣原体MoPn株：pGM-T-MoPn 23S质粒标准品；
猪衣原体R22株：pGM-T-R22 23S质粒标准品；
沙眼衣原体D/UW-3/CX株：pGM-T-D/UW-3/CX 23S质粒；
肺炎衣原体N16株：pGM-T-N16 23S质粒；
家畜衣原体E58株：pGM-T-E58 23S质粒；
豚鼠衣原体GPIC株:pGM-T-GPIC 23S质粒。
本发明所述的芯片不仅检测衣原体，并且对所测菌株可达到直接鉴定出其种属性的效果，该基因芯片的种特异性检测探针包含了衣原体属下所有12个种：流产衣原体(C.abortus)、鹦鹉热衣原体(C.psittaci)、肺炎衣原体(C.pneumoniae)、沙眼衣原体(C.trachomatis)、鼠衣原体(C.muridarum)、猪衣原体(C.suis)、家畜衣原体(C.pecorum)、豚鼠衣原体(C.caviae)和猫衣原体(C.felis)，以及近年新发现的3个新种：家禽衣原体(C.gallinacea)、朱鹭衣原体(C.avium)和鸟衣原体(C.ibidis)。本发明最大的亮点在于解决了衣原体属特异性鉴别的问题，且敏感性、特异性好，为衣原体的诊断、卫生监督、流行病学调查和传染病防控提供一种新的技术手段。
更为具体地，本发明在获得所述芯片时采用的技术方案包括以下内容和步骤：
1、特异性引物和探针的筛选和制备
在NCBI网站的GenBank处检索衣原体基因组序列，包含了衣原体属下所有12种衣原体已经经过全部测序或部分测序得到确认的所有菌株，共155株。包括鹦鹉热衣原体种：C.psittaci 6BC株、C.psittaci CP3株、C.psittaci GR9株、C.psittaci M56株、C.psittaci Mat116株、C.psittaci MN株、C.psittaci VS225株、C.psittaci WC株、C.psittaci RD1株、C.psittaci C19/98株、C.psittaci 01DC11株、C.psittaci 02DC11株、C.psittaci 08DC60株、C.psittaci DG23h株、C.psittaci 84/55株、C.psittaci WS/RT/E30株、C.psittaci HB1043株、C.psittaci CT1株；流产衣原体种：C.abortus A22株、C.abortus B577株、C.abortus EBA株、C.abortus LLG株、C.abortus OSP株、C.abortusS26/3株、C.abortus15-70d/24株、C.abortus15-58d/44株、C.abortusGIMC株、C.abortusGN6株、C.abortus 1H株、C.abortus CAAB7株、C.abortus FAG株；肺炎衣原体种：C.pneumoniae CWL011株、C.pneumoniae CWL1011株、C.pneumoniae AR39株、C.pneumoniaeCM1株、C.pneumoniae CWL029株、C.pneumoniae FML12株、C.pneumoniae FML16株、C.pneumoniae J138株、C.pneumoniae LPCoLN株、C.pneumoniae YK41株、C.pneumoniaeTW-183株、C.pneumoniae Wien1株、C.pneumoniae Wien2株、C.pneumoniae Wien3株、C.pneumoniae UZG1株、C.pneumoniae U1271株、C.pneumoniae PB2株、C.pneumoniae PB1株、C.pneumoniae MUL2216株、C.pneumoniae K7株、C.pneumoniae H12株、C.pneumoniaeGiD株、C.pneumoniae CV15株、C.pneumoniae CV14株、C.pneumoniae PN株、C.pneumoniaeDC9株、C.pneumoniae N16株、C.pneumoniae WBB株；沙眼衣原体种：C.trachomatis 434Bu株、C.trachomatis HAR-13株、C.trachomatis B/TZ1A828/OT株、C.trachomatis D/UW-3/CX株、C.trachomatis L2b/UCH-1株、C.trachomatis L2b/UCH-2株、C.trachomatis SQ19株、C.trachomatis SQ28株、C.trachomatis SQ15株、C.trachomatis SQ05株、C.trachomatis SQ25株、C.trachomatis SQ02株、C.trachomatis SQ01株、C.trachomatisSQ24株、C.trachomatis SQ14株、C.trachomatis SQ10株、C.trachomatis SQ12株、C.trachomatis SQ07株、C.trachomatis SQ32株、C.trachomatis SQ09株、C.trachomatisSQ20株、C.trachomatis SQ06株、C.trachomatis SQ29株、C.trachomatis chxRP1H1株、C.trachomatis chxRP4D10株、C.trachomatis QH111L株、C.trachomatis SB013321株、C.trachomatis SB013112株、C.trachomatis SB008107株、C.trachomatis SB006930株、C.trachomatis SB002739株、C.trachomatis F-6068株、C.trachomatis E-DK-20株、C.trachomatis E-32931株、C.trachomatis E-8873株、C.trachomatis E-547株、C.trachomatis E-160株、C.trachomatis E-103株、C.trachomatis Ia/CS190/96株、C.trachomatis F/CS847/08株、C.trachomatis E/CS1025/11株、C.trachomatis D/CS637/11株、C.trachomatis L2b/CS19/08株、C.trachomatis L2b/CS784/08株、C.trachomatisC/TW-3株、C.trachomatis J/31-98株、C.trachomatis J/27-97株、C.trachomatis Ia20-97株、C.trachomatis D/14-96株、C.trachomatis D/13-96株、C.trachomatis E/12-94株、C.trachomatis F/11-9株、C.trachomatis F/6-94株、C.trachomatis F/2-93株、C.trachomatis F/1-93株、C.trachomatis RC-F(s)/852株、C.trachomatis RC-J/943株、C.trachomatis RC-J/953株、C.trachomatis RC-F(s)/342株；鼠衣原体种：C.muridarumNigg株、C.muridarum Mopn株、C.muridarum SFPD株；猪衣原体种：C.suis 3-25b株、C.suis5-27b株、C.suis 4-29b株、C.suis SWA-86株、C.suis SWA-14株、C.suis H5株、C.suisSWA-2株、C.suis R24株、C.suis R27株、C.suisR19株、C.suis MS04株、C.suis R22株；家畜衣原体种：C.pecorum 1710S株、C.pecorum DBDeUG株、C.pecorum E58株、C.pecorum IPA株、C.pecorum IPTalE株、C.pecorum MC/MarsBar株、C.pecorum P787株、C.pecorum PV3056/3株、C.pecorum VR629株、C.pecorum W73株、C.pecorum IPA株、C.pecorum L71株、C.pecorum BP1株；豚鼠衣原体种：C.caviae GPIC株、C.caviae7808017株；猫衣原体种：C.felis Fe/C-56株、C.felis FP Cello株、C.felis FP(VR-120)株；朱鹭衣原体种有C.ibidis10-1398/6株；鸟衣原体种有C.avium 10DC88株；家禽衣原体种：C.gallinacea08-1274/3株、C.gallinacea JX-1株；
经过BLAST比对分析和筛选所有菌株基因组，选择位于23S rDNA的前后两段特异且高保守片段，得到一对衣原体属通用引物，引物的目的片段大小为170bp；所述引物的序列为：SEQ ID NO.1-2。并在所述两段高保守片段所含保守区间的间隔之中筛选出高变异性位点(称为变异区)，该变异区的特征在于核苷酸碱基位点的变异具有针对种属的规律性，因此获得一套衣原体种特异性探针，所述探针的序列为SEQ ID NO.3-18。并设计与上游引物互补的序列作为阳性对照探针，以杂交液作为阴性对照探针，显色质控探针兼定位探针是20T序列，并在5’末端连接生物素。
2、衣原体质粒标准参比品的构建
除部分衣原体获得了代表菌株和核酸样本(包括鹦鹉热衣原体6BC株、流产衣原体B577株、鼠衣原体MoPn株、猪衣原体R22株、沙眼衣原体D/UW-3/CX株、肺炎衣原体N16株、家畜衣原体E58株)，其余衣原体种(豚鼠衣原体、猫衣原体、家禽衣原体、朱鹭衣原体和鸟衣原体)均未获得标准样本，为满足实验需求，本研究由上海生工生物有限公司根据NCBI网站GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)上已经公开的豚鼠衣原体、猫衣原体、家禽衣原体、朱鹭衣原体和鸟衣原体各标准株(朱鹭衣原体10-1398/6株，鸟衣原体10DC88株，猫衣原体FP baker(VR-120)株，豚鼠衣原体GPIC株，家畜衣原体E58株)的23SrRNA脱氧核苷酸序列合成以上所述五个衣原体种的标准菌株的23S rDNA序列样品，并按一定浓度稀释后储存备用。按照北京全式生物技术有限公司的克隆载体说明书，进行克隆载体构建，之后转化入大肠杆菌，进行培养和PCR与双酶切鉴定，并将产物再测序比对。
经过多重验证，所构建的质粒标准参比品准确无误，一方面可以用于芯片质量与效率验证的标准依据，作为特异性和灵敏度检测的参考品，同时也作为衣原体种特异性芯片检测试剂盒临床检样的标准参比品。
3、基因芯片的制备
用双蒸水(ddH2O)稀释各探针至100ng/μL作为储存浓度，点样时用双蒸水稀释探针至10ng/μL作为工作浓度。用市售的基因芯片点样仪按已设定程序在方形尼龙膜上点样(芯片阵列如附图1所示)，其中空白对照探针为杂交液；或者在没有点样仪的情况下，可以手工制备基因芯片：用10μL的移液枪，调至0.2μL刻度后吸取相应稀释好的探针，在方形尼龙膜上点样(芯片阵列如图1所示)。点样完成后放入紫外仪，交联反应10min后避光2h，使探针与载体充分交联，之后保存准备待用。经过不同探针浓度梯度验证，最终得到探针的最佳稀释浓度为5ng/μL。
4、不对称PCR反应特异性扩增
应用商品化的细菌基因组快速提取试剂盒进行病原菌核酸的提取，获得待测基因组样本。
本发明中PCR体系的特征在于应用优化地不对称PCR体系提高芯片检测的灵敏度。上游引物(Chlamydia F)和下游引物(Chlamydia R)的终浓度为0.8μM和0.1μM，相对比例为8:1比例时检测效果最优，参考品的探针信号值较强，且低拷贝模板2×103copie/μL仍然可以检出。同时在体系中加入PCR SuperMix体积的1％的dUTP，达到样本标记的效果。用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，目的条带大小为172bp。
优选的PCR扩增条件为：96℃预变性2min；96℃，30s；55℃，30s；72℃，30s；共45个循环；72℃延伸5min。
5、芯片杂交与显色
基因芯片配套试剂(M1，M2，M3,W4)，购于上海界源生物技术有限公司。根据说明书(见下表)用M1、M2和M3液配制芯片工作液：杂交液A、洗涤液B和洗涤液C。
基因芯片配套试剂中的W4液为芯片显色反应过程中使用的沉淀型TMB显色液。杂交过程：取50μL PCR产物和1mL杂交液(A液)混匀后，将基因芯片放入杂交盒内，将杂交液加于芯片阵列表面，60℃杂交1h；
基因芯片的显色及结果判读:将杂交完成的芯片放置在玻片上，用47℃预热好的洗涤液(B液)淋洗三遍；提前配置好结合液：用链酶亲和素－辣根过氧化物酶(SA-HRP)与A液以1：2000的比例配制2mL结合液D，将配好的结合液D加入基因芯片杂交盒中，室温下与芯片孵育15min；取出基因芯片用A液室温淋洗芯片两次，C液室温淋洗两次，直接加400μL W4液(沉淀型TMB显色液)化学显色2-4min后去掉显色液。沉淀性TMB在HRP的催化下形成蓝色沉淀颗粒，即显色质控位点、阳性对照位点以及被捕获的靶基因位点呈现蓝色斑点，而背景为白色，这种TMB蓝色沉淀型显色的优点是背景值低、显色明显、不需要额外的扫描仪，可以直接肉眼清晰地观察，根据基因芯片的阵列以及阴阳性对照，即可直接判读被测菌株的种属性。
6、基因芯片的特异性验证
选择大肠杆菌、沙门氏菌、肺炎支原体、鸡毒支原体和H9N2禽流感病毒作为样本，利用上述制备的衣原体种属特异性基因芯片进行检测，验证该基因芯片的特异性。其中，病毒样品提取病毒RNA后，先将RNA反转录为cDNA，再进行PCR和芯片的检测。
分别采用以上所述制备的质粒标准品设置多个浓度梯度，检测基因芯片的敏感性和最低检测限度。检测结果为：12种衣原体的最低检测限能达到103～104拷贝数/反应。
使用本发明制备的基因芯片检测衣原体菌株样本，无论是细胞培养的菌株，还是临床采集的畜禽咽喉拭子、鸡胚卵黄囊膜等中提取病原微生物的核酸，检测的衣原体结果与测序结果一致。经不对称PCR扩增，再与基因芯片杂交，通过双重验证和检测，其检测结果显示：基因芯片检测检测样品结果与测序结果符合率达到98.75％。从而表明本发明建立的基因芯片检测衣原体种属特异性的方法其准确性较好，可以应用于实际临床样本的准确检测。
本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
本发明的有益效果在于：
本发明依据衣原体种间高保守性以及基因芯片的原理和优势，本发明通过分析与筛选衣原体基因组，获得位于23S rDNA的高保守及种间高变异片段，设计共同引物和种特异性探针，建立一种寡核苷酸探针基因芯片，并结合TMB显色，达到检测和直接判读衣原体种型的效果。该芯片法即达到了快速、准确、高效率、高特异性、高敏感性，同时也避免了荧光发光型基因芯片需要价格高昂的荧光扫描仪，减少了信号易淬灭的缺陷，本发明芯片诊断技术适宜在中小型医疗机构、临床现场检测。该衣原体种属特异性检测芯片对指导临床治疗，生产实践以及衣原体流行病学调查具有重要意义。
附图说明
图1为本发明衣原体种属特异性基因芯片的点样矩阵示意图；
阵列图中各字母代表的探针如下：
图2为待测基因样品用通用引物扩增后PCR产物电泳条带图。
其中：M:250bp Maker；1:鹦鹉热衣原体；2:流产衣原体；3:鼠衣原体；4:肺炎衣原体；5:沙眼衣原体；6:家畜衣原体；7:鹦鹉热衣原体；8:大肠杆菌。
图3为12种衣原体种的质粒标准品验证基因芯片的实验结果图。
图4为细胞培养菌株和临床疑似病料所提取的基因组进行基因芯片检测种属性的结果图。
图5为基因芯片特异性检测结果图。其中，图5-A中，由左至右依次为大肠杆菌、沙门氏菌、肺炎支原体、鸡毒支原体、H9N2禽流感病毒的检测结果图；图5-B为随机取3-4种衣原体基因组混合后，用该基因芯片检测的结果图。
图6为基因芯片敏感性检测结果图。其中，图6-A为鹦鹉热衣原体质粒标准品浓度梯度检测(PCR产物：杂交A液为50μL:1000μL)：a-e为质粒浓度依次为2×106copies/反应、2×105copies/反应、2×104copies/反应、2×103copies/反应和2×102copies/反应检测结果；图6-B为流产衣原体质粒标准品浓度梯度检测(PCR产物：杂交A液为50μL:1000μL)：a-f为质粒浓度依次为2×106copies/反应、2×105copies/反应、2×104copies/反应、2×103copies/反应、2×102copies/反应和2×101copies/反应检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1衣原体种属特异性微阵列基因芯片的制备
本实施例通过引物和探针的筛选，芯片杂交条件和显色条件的优化，最终优选出本芯片的最佳反应体系，保证本芯片的检测结果达到最优。
1、材料
衣原体探针和引物：委托生工生物工程(上海)股份进行合成；
基因芯片点样仪：租赁北京博奥晶典生物技术有限公司；
细菌核酸的提取试剂盒：全式金(北京)生物技术有限公司提取试剂盒(EasyPureBacteria Genomic DNA Kit，货号：EE161-01)；
尼龙膜(Nylon Membranes,positively charged,Roche公司)：购自Sigma-Aldrich公司。
辣根过氧化物酶标记链酶亲和素(streptavidin－HRP)：购自Thermo FisherScientific公司；
基因芯片配套试剂(M1，M2，M3,W4)，购于上海界源生物技术有限公司。根据配比说明书(见上文)配置芯片工作液：：杂交液A、洗涤液B和洗涤液C。基因芯片配套试剂中的W4液为芯片显色过程中使用的沉淀型TMB显色液。
2、方法
2.1特异性引物和探针的筛选
在NCBI网站的GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)上检索并下载衣原体属所有12种衣原体目前已经全部测序或部分测序确认的所有菌株的基因组，一共有155株菌株的基因组。如表1所列：
表1衣原体种以及相对应菌株
应用MegAlign软件对以上所述衣原体菌株基因组的16S rRNA基因，23S rRNA基因、16S–23S rRNA基因间隔区、MOMP主要外膜蛋白基因和LPS脂多糖基因分别进行比对和筛选，寻找“最高变区”，并对这些“最高变区”进行分析：最终发现位于23S rRNA基因的一段长度为34nt的“最高变区”，具有完美的针对衣原体各种型的单核苷酸多态性，核苷酸位点的变异具有针对种属的规律性，因此选取该段“最高变区”的序列作为衣原体种属特异性探针的设计区，得到本发明基因芯片的一套衣原体种特异性探针。同时，在该区域的上游和下游筛选得到“高保守区域”，作为应用于该基因芯片的衣原体属通用且特异性引物。
取以上初步筛选到的探针和引物，在NCBI网站上进行BLAST比对和验证所初筛的引物与探针的特异性。经过筛选和验证后，最终筛选出本发明芯片用以检测和鉴定衣原体种属特异性的探针和引物。
同时，设计该基因芯片的显色质控探针兼定位探针、阳性对照探针和阴性对照探针：显色质控探针兼定位探针是20T序列，并在5’末端连接生物素；与上游引物互补的序列作为阳性对照探针；以杂交液作为阴性对照探针。
以上所述引物的序列为SEQ ID NO.1-2；所述探针的序列为SEQ ID NO.3-22。
表2衣原体属特异性扩增引物
表3衣原体种属特异性寡核苷酸探针序列
2.2衣原体种属特异性基因芯片的制备以及探针阵列
将最终确定的探针和引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成，引物与探针无需添加摆动臂以及特殊修饰。合成的引物和探针干粉放于－20℃冰箱储存备用。将装有探针(干粉)的离心管置于离心机上以12000转/min离心5min，加入双蒸水(ddH2O)稀释各探针至浓度为100ng/μL作为储存浓度，点样时用双蒸水稀释探针至10ng/μL作为工作浓度。
确定最终的探针阵列，为5×7阵列，探针的阵列见附图1。
按照如附图1所述的探针阵列，用市售的基因芯片点样仪(北京博奥晶典生物技术有限公司)按已设定好的程序以接触式或喷射式形式在方形尼龙膜上点样；或者在没有点样仪的情况下，可以手工制备基因芯片：用10μL的移液枪，调至0.2μL后吸取相应稀释好的探针，在方形尼龙膜上点样(点样阵列如附图1所示)。芯片点制完成后放入紫外仪，交联反应10min后避光2h，使探针与载体充分交联，之后保存准备待用。
2.3不对称PCR反应特异性扩增衣原体
病原菌核酸的提取使用全式金(北京)生物技术有限公司的细菌基因组快速提取试剂盒(EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit，货号：EE161-01)进行病原菌核酸的提取，操作按说明书要求进行。
本发明中PCR体系的特征在于应用优化地不对称PCR体系提高芯片检测的灵敏度，上游引物(Chlamydia F)和下游引物(Chlamydia R)的终浓度分别为0.8μM和0.1μM，相对比例为8:1。同时在体系中加入PCR SuperMix体积的1％的dUTP，用以样本标记。如表3和表4配制PCR体系和进行程序。
表4不对称PCR体系
| 组分 | 体积 | 终浓度 |
| 模板 | 1.5μL | |
| Chlamydia F | 0.8μL | 0.8μM |
| Chlamydia R | 0.1μL | 0.1μM |
| dUTP | 0.1μL | |
| PCR SuperMix | 10μL | |
| ddH2O | 7.5μL |
表5优选的PCR扩增条件为
程序结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，目的条带大小为170bp。附图2为选取的衣原体菌株基因样品经PCR扩增后产物的电泳条带图。4℃保存PCR产物或进行下一步实验。
2.4基因芯片杂交与显色方案
2.4.1建立芯片杂交体系：
2.4.1.1杂交：首先预备好杂交反应液：取50μL PCR产物和1mL杂交液(A液)充分混匀，将基因芯片放入杂交盒内，将杂交反应液加于芯片阵列表面，水浴60℃杂交1h；杂交完成后，用47℃预热好的洗涤液(B液)淋洗3次；
2.4.1.2结合：提前配置好结合液D：用辣根过氧化物酶标记链酶亲和素(streptavidin－HRP)(Thermo Fisher Scientific公司)与A液以1：2000的比例配制2mL结合液D，在芯片反应区加入2mL结合液D，37℃水浴孵育20min；
2.4.1.3洗涤：取出孵育完成后的芯片，用A液室温淋洗芯片两次，C液室温淋洗两次，最后用C液37℃水浴洗涤10min，以达到充分洗涤的效果。
2.4.2建立显色体系：
在洗涤完成的芯片表面，避光轻轻滴加400mL W4液(沉淀型TMB显色液)，化学显色2-4min后去掉显色液。沉淀性TMB在HRP的催化下形成蓝色沉淀颗粒，即显色质控位点、阳性对照位点以及被捕获的靶基因位点呈现蓝色斑点，而背景为白色，这种TMB蓝色沉淀型显色的优点是背景值低、显色明显、不需要额外的扫描仪，可以直接肉眼清晰地观察，根据基因芯片的阵列以及阴阳性对照，即可直接判读被测菌株的种属性。
2.4.3杂交反应体系的最优化
使用最优化的杂交反应条件可以确保和提高本发明基因芯片的特异性及灵敏度，本发明优化了以下条件：探针点样浓度、杂交反应液配比比例、杂交反应温度与时间、洗涤条件、结合液孵育温度与时间、显色反应时间等多个参数进行探索，最优条件的摸索和筛选如下表6所示。
表6基因芯片杂交反应的条件优化参数
结论：
最终优选出的本芯片的最佳反应体系为：探针最佳点样浓度为5ng/μL，杂交过程中反应液最优配比比例为50μL:1mL，杂交反应的最优温度为60℃、最优时间为60min，洗涤条件为水浴37℃，2-3次，之后结合液孵育最优时间和温度为水浴37℃、20min，最终最佳显色时间为2min－4min。在一系列最优化体系条件下进行芯片反应，本芯片的检测结果达到最优，芯片特异性、重复性、稳定性都良好。
实施例2衣原体质粒标准参比品的构建
本实施例建立了一套该基因芯片的配套质粒标准参比品，从而减少从衣原体病原纯化标准基因组机会，降低感染几率，更方便的验证和检测基因芯片的效率；同时也作为衣原体种特异性芯片检测试剂盒相配套的标准参比品，在临床检样过程中建立阳性对照。
1、材料：
标准菌株：鹦鹉热衣原体：6BC株；沙眼衣原体：D/UW-3/CX株；肺炎衣原体：N16株；流产衣原体：B577株；鼠衣原体：Mopn株；家畜衣原体：E58株；猪衣原体：R22株。
细菌基因组DNA提取试剂盒：北京全式金生物技术有限公司的(EasyPureBacteria Genomic DNA Kit，货号：EE161-01。
质粒DNA可视化提取试剂盒：Plasmid MiniPrep Kit，货号：EM101-01。
pEASY-T1Cloning Kit试剂盒：北京全式金生物技术有限公司，货号：CT101-01。
微量分光光度计：Nano-300型，杭州奥盛仪器有限公司。
2、方法：
2.1提取基因组：将以上菌株分别培养纯化以后，进行提取基因组，用针对衣原体属23S rRNA基因的特异性引物做PCR靶序列扩增，PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳检测。琼脂糖凝胶回收试剂盒回收和纯化PCR产物，并提交与生工生物工程(上海)股份有限公司测序比对，以达到双重验证。其余衣原体种(豚鼠衣原体、猫衣原体、家禽衣原体、朱鹭衣原体和鸟衣原体)均未获得合适菌株或基因组样本，为满足实验需求，本研究委托生工生物工程(上海)股份有限公司根据NCBI网站GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)上已经公开的豚鼠衣原体、猫衣原体、家禽衣原体、朱鹭衣原体和鸟衣原体各标准株(朱鹭衣原体10-1398/6株，鸟衣原体10DC88株，猫衣原体FPbaker(VR-120)株，豚鼠衣原体GPIC株，家畜衣原体E58株)的23SrRNA脱氧核苷酸序列合成以上所述五个衣原体种的标准菌株的23SrRNA基因序列样品，并按一定浓度稀释后储存备用。
2.2克隆质粒的构建和制备：应用pEASY-T1Cloning Kit试剂盒进行克隆载体的构建：克隆反应体系如表7所示：
表7克隆反应体系
| 成分 | 体积 |
| PCR Product | 0.5-4μL |
| pEASY-T1 Cloning Vector | 1μL |
离心管中加好试剂后轻轻混合后，室温(20℃-37℃)反应5分钟。反应结束后，至于冰上。
加连接产物于50μL Trans1-T1感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴20-30分钟；42℃水浴热激30秒，立即至于冰上2分钟；取250μL至LB培养基，200rpm、37℃培养1小时；取200μL菌液均匀的涂在含有IPTG和X-gal的平板上，进行筛选培养。
2.3阳性克隆质粒的检测与质粒DNA的提取
通过PCR方法、限制性酶切分析以及测序三种方法对阳性克隆质粒进行检测和验证。对测序含目标片段的单克隆菌液使用质粒小提试剂盒提取质粒DNA，用微量分光光度计测定所提质粒的浓度，根据公式计算出拷贝数，无DNA酶水稀释成梯度：1×106copies/μL、
1×105copies/μL、1×104copies/μL、1×103copies/μL、1×102copies/μL、1×101copies/μL，分装后－20℃储存备用。
4、结果：
最终成功构建并获得12种衣原体各标准株的质粒标准参比品，如下：
鹦鹉热衣原体6BC株：pGM-T-6BC 23S质粒标准品；
流产衣原体B577株:pGM-T-B577 23S质粒标准品；
家禽衣原体08-1274/3株：pGM-T-08-1274/3 23S质粒标准品；
朱鹭衣原体10-1398/6株：pGM-T-10-1398/6 23S质粒标准品；
鸟衣原体10DC88株：pGM-T-10DC88 23S质粒标准品；
猫衣原体FP baker(VR-120)株：pGM-T-FP baker 23S质粒标准品；
鼠衣原体MoPn株：pGM-T-MoPn 23S质粒标准品；
猪衣原体R22株：pGM-T-R22 23S质粒标准品；
沙眼衣原体D/UW-3/CX株：pGM-T-D/UW-3/CX 23S质粒；
肺炎衣原体N16株：pGM-T-N16 23S质粒；
家畜衣原体E58株：pGM-T-E58 23S质粒；
豚鼠衣原体GPIC株:pGM-T-GPIC 23S质粒。
经过多重验证，所构建的质粒标准品准确无误，图3为12种衣原体种的质粒标准品验证本基因芯片的实验结果图。
5、结论：
本发明中构建的质粒标准品在芯片检测中效果良好，各种之间特异性达标，可以作为芯片验证和检样的标准依据，以及作为特异性和灵敏度检测的参考品。
实施例3衣原体种特异性检测的芯片的样本检测以及符合性评价
本实施例用于使用本发明所提供的芯片，检测细胞培养菌株标本、临床所采的咽喉拭子、粪便样本、肺泡灌洗液、胎盘膜、阴道分泌物中的衣原体病原以及对衣原体的种属性进行鉴别。
1、材料：
细菌基因组DNA提取试剂盒：全式金生物技术(北京)有限公司(EasyPureBacteria Genomic DNA Kit，货号：EE161-01。
基因芯片：实施例1制备的试剂盒。
参比组：衣原体23S rRNA基因测序(生工生物工程(上海)股份有限公司)。
样本来源：
(1)标准基因组来源：30份细胞培养菌株培养皿(包含鹦鹉热衣原体：6BC株；沙眼衣原体：D/UW-3/CX株；肺炎衣原体：N16株；流产衣原体：B577株；鼠衣原体：Mopn株；家畜衣原体：E58株；猪衣原体：R22株以及阴性纯细胞培养物)。
(2)临床样本：咽喉拭子、肺泡灌洗液、胎膜、阴道分泌物和肠道粪便样本。
2、方法：
基因组纯化：粪便样本用灭菌生理盐水充分洗涤，将洗涤液吸入EP管，进行离心去除颗粒杂质(6000r/min，5min)，吸取上清后置于新的离心管再进行病原的离心浓缩(13000r/min，30min)，收集沉淀后用商品化的核酸试剂盒提取核酸(全式金生物技术(北京)有限公司)；而细胞培养菌株标本、咽喉拭子、肺泡灌洗液、胎膜、阴道分泌物，经过适当灭菌生理盐水稀释后，可以直接用试剂盒提取核酸样品；完成核酸准备后，可以按照如实施示例1.中所述，利用本研究的衣原体种属特异性基因芯片进行待测基因样品的检测和衣原体种属性鉴别。
随机选取基因芯片非相关人员培养的30份细胞培养菌株培养皿(包含鹦鹉热衣原体：6BC株；沙眼衣原体：D/UW-3/CX株；肺炎衣原体：N16株；流产衣原体：B577株；鼠衣原体：Mopn株；家畜衣原体：E58株；猪衣原体：R22株以及阴性纯细胞培养物)进行盲测；选取临床采集的80份病料(包含咽喉拭子、肺泡灌洗液、胎膜、阴道分泌物)进行检测，以上检测同时用测序法结果比对，从而验证本发明基因芯片的准确性和符合性。
3、结果：
用本发明衣原体种属特异性基因芯片对标准菌株细胞培养样本以及临床疑似病料样本进行检测，并与生工生物工程(上海)股份有限公司对相应衣原体23S rRNA基因的测序结果进行比对，芯片法与测序法检测结果如表8所示。
表8衣原体种属特异性基因芯片的样本检测以及符合性验证
统计芯片法检测样本的符合率如下：
图4为细胞培养菌株以及临床疑似病料所提取的基因组进行基因芯片检测的结果图。
4、结论：
从该基因芯片检测结果与测序结果的符合率统计得出：该芯片针对背景比较简单、干净的细胞培养物样品，检测的准确性与符合性可达100％，在临床采集的背景复杂且病原载量相对很低的病料检测方面，芯片检测的准确性与符合性可达98.75％。因此，可判断本研究的衣原体种属特异性基因芯片的准确性和符合性都相对很高，不仅能用于实验室诊断研究，也可以在实际中准确检测样品。
实施例4衣原体种特异性检测芯片的特异性评价
本实施例用于对衣原体种特异性检测芯片进行特异性评价。
1、材料：
菌种来源：选择大肠杆菌、沙门氏菌、肺炎支原体、鸡毒支原体、H9N2禽流感病毒作为样本。
细菌基因组DNA提取试剂盒：全式金生物技术(北京)有限公司的(EasyPureBacteria Genomic DNA Kit，货号：EE161-01。
基因芯片：实施例2制备的试剂盒。
2、方法：
用衣原体种属特异性基因芯片在优化的条件下进行检测，验证该基因芯片的特异性。
3、结果：
如图5所示，上述常见病原体的检测结果均为阴性，说明该基因芯片特异性良好。
随机取3-4种衣原体基因组混合后，用该基因芯片检测，验证该基因芯片特异性。如图5所示，12种衣原体可以明显区分，说明该基因芯片特异性良好。
4、结论：
本发明所述的基因芯片特异性良好，针对每个单独的菌种或者模拟临床实际多种衣原体混合感染的情况下，进行衣原体种属特异性检测，芯片依然能区分各衣原体病原，达到良好的检测效果，适用于临床实际样品分析。
实施例5衣原体种特异性检测芯片的灵敏性评价
本实施例用于对衣原体种特异性检测芯片的灵敏性进行评价。
1、材料：
质粒标准品：实施例2制备的质粒；
基因组样本：提取的鹦鹉热衣原体6BC株全基因组；提取的流产衣原体B577株全基因组；
基因芯片：实施例1制备的试剂盒；
灵敏度参比试剂盒：英国Primerdesign公司产鹦鹉热衣原体Taqman-Probe q-PCR试剂盒(Chlamydia psittaci genesig q-PCR Standard Kit)。
2、方法
本发明应用上述实施例2所构建的质粒标准品作为参考品，将质粒标准品设置稀释浓度梯度，检测基因芯片的敏感性和最低检测限度。浓度分别为106copies/μL、105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL、102copies/μL、101copies/μL，采用优化后的芯片反应体系进行芯片检测。
为进一步比较性验证本发明芯片的灵敏度，芯片法和q-PCR试剂盒同时检测10倍梯度稀释的鹦鹉热衣原体基因组，比较灵敏度。
3、结果
结果表明鹦鹉热衣原体、沙眼衣原体、鼠衣原体、豚鼠衣原体、猫衣原体、流产衣原体、家禽衣原体和朱鹭衣原体检测限为2×103copies/反应(2指PCR反应时添加的质粒模板的量)，猪衣原体、肺炎衣原体、家畜衣原体、鸟衣原体检测限为2×104copies/反应。图6所示为选取的鹦鹉热衣原体、流产衣原体标准质粒进行芯片敏感性检测的图谱。
用芯片法和鹦鹉热衣原体q-PCR试剂盒同时检测10倍梯度稀释的鹦鹉热衣原体核酸样本，结果显示本发明的基因芯片的灵敏度为鹦鹉热衣原体Taqman-Probe q-PCR试剂盒的1/10。
4、结论
本发明的基因芯片检测各种衣原体的最低检测限为2×104copies/反应，性能较优。
实施例6衣原体种特异性检测芯片的重复性评价
本实施例选取5种衣原体标准质粒，对衣原体种特异性检测芯片的重复性进行检测。
1、材料：
质粒标准品：实施例2制备的鹦鹉热衣原体质粒、肺炎衣原体质粒、家畜衣原体质粒、家禽衣原体质粒、猪衣原体质粒；
基因芯片：实施例1制备的试剂盒。
2、方法：
选取5种衣原体标准质粒，浓度为104copies/μL进行芯片检测：每个衣原体种做5次重复芯片检测；芯片内探针做5次重复点样，用两种形式进行芯片重复性检测。
3、结果：
经过种内重复和探针重复检测，结果显示，每一条探针的重复检测结果均一致，种内重复性检测结果也都呈现一致性。
4、结论：
本研究制备的基因芯片组内结果稳定，重复性较好。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种用于衣原体种特异性检测的芯片及应用
<141> 2018-09-14
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
attgamaggc gawgaagga 19
<210> 2
<211> 20
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<210> 17
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
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<210> 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atatacctat gtattcagta tataatggta gacg 34
<210> 19
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atacacttag tggcggaagg gttagtaata catg 34
<210> 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctatagccta tgtattcagc taaagataat gggag 35
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
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<400> 21
tttttttttt tttttttttt btn 23
<210> 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tccttcwtcg cctktcaat 19
Claims (10)
1.一种用于衣原体种特异性检测的探针组，其特征在于，包括：
鹦鹉热衣原体种特异性探针，如SEQ ID NO.3～4所示；
流产衣原体种特异性探针，如SEQ ID NO.5～6所示；
家禽衣原体种特异性探针，如SEQ ID NO.7所示；
朱鹭衣原体种特异性探针，如SEQ ID NO.8所示；
鸟衣原体种特异性探针，如SEQ ID NO.9所示；
猫衣原体种特异性探针，如SEQ ID NO.10所示；
鼠衣原体种特异性探针，如SEQ ID NO.11所示；
猪衣原体种特异性探针，如SEQ ID NO.12所示；
沙眼衣原体种特异性探针，如SEQ ID NO.13所示；
肺炎衣原体种特异性探针，如SEQ ID NO.14～16所示；
家畜衣原体种特异性探针，如SEQ ID NO.17所示；
豚鼠衣原体种特异性探针，如SEQ ID NO.18所示。
2.一种用于衣原体种特异性检测的芯片，其特征在于，包括芯片载体和权利要求1所述的探针组。
3.一种用于衣原体种特异性检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的芯片。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括1对衣原体属通用且特异性引物，如SEQ ID NO.1～2所示。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述芯片还包括1条显色质控兼定位探针，序列如SEQ ID NO.21所示；1条阳性对照探针，序列如SEQ ID NO.22所示；1条阴性对照探针，所述阴性对照探针为点样稀释液。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述显色质控兼定位探针的5’端连接有生物素。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述芯片还包括2条属特异性质控探针，为新衣原体属的特异性探针和原衣原体属的特异性探针，序列分别为SEQ ID NO.19和SEQID NO.20所示。
8.根据权利要求3～7任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述芯片上探针的点样浓度为5ng/μL。
9.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括一套与所述芯片配套使用的质粒标准参比品，所述质粒标准参比品由分别含有鹦鹉热衣原体、流产衣原体、家禽衣原体、朱鹭衣原体、鸟衣原体、猫衣原体、鼠衣原体、猪衣原体、沙眼衣原体、肺炎衣原体、家畜衣原体、豚鼠衣原体标准株的23S rRNA基因的重组质粒组成。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述重组质粒由pMD18-T质粒制备。
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