CN116165383A - 一种子宫内膜癌诊断标志物及其应用 - Google Patents

一种子宫内膜癌诊断标志物及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116165383A
CN116165383A CN202310056428.7A CN202310056428A CN116165383A CN 116165383 A CN116165383 A CN 116165383A CN 202310056428 A CN202310056428 A CN 202310056428A CN 116165383 A CN116165383 A CN 116165383A
Authority
CN
China
Prior art keywords
endometrial cancer
g3bp1
reagent
protein
detecting
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310056428.7A
Other languages
English (en)
Inventor
葛一栋
金晓锋
叶孟
金加孛
林缦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ningbo University
Original Assignee
Ningbo University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ningbo University filed Critical Ningbo University
Priority to CN202310056428.7A priority Critical patent/CN116165383A/zh
Publication of CN116165383A publication Critical patent/CN116165383A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57442—Specifically defined cancers of the uterus and endometrial
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种子宫内膜癌诊断标志物及其应用，属于分子生物学领域，本发明首次公开了一种G3BP1蛋白质作为全新子宫内膜癌诊断标志物的应用，该蛋白质由466个氨基酸组成，蛋白大小约为68kDa，涉及蛋白质G3BP1在制备子宫内膜癌诊断试剂盒及相关药物中的应用。主要通过免疫组织化学技术进行分析，比较G3BP1蛋白质在子宫内膜癌患者样本和正常样本中的表达，以用于辅助诊断子宫内膜癌，具有灵敏性高、特异性强、周期短等特点，有利于子宫内膜癌的早期诊断和治疗，并且G3BP1在子宫内膜癌中具有成为新型生物标志物及有效治疗靶点的潜力。

Description

一种子宫内膜癌诊断标志物及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种子宫内膜癌诊断标志物及其应用，更具体地，涉及一种G3BP1蛋白及其在制备子宫内膜癌试剂盒以及制备治疗子宫内膜癌药物中的应用。
背景技术
子宫内膜癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，为全球第六大最常见的恶性疾病。据统计，发达国家子宫内膜癌的发病率高于发展中国家，然而由于医疗水平的差异，发展中国家子宫内膜癌的死亡率远高于发达国家。近年来，子宫内膜癌的发病率在许多发展中国家呈上升趋势。根据世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)最新发布的2020年全球最新癌症负担数据，我国女性癌症新发病例6575324例，其中子宫内膜癌占7％，排名第四。
目前子宫内膜癌的治疗首选手术切除，并根据手术的病理分期和组织学分级，辅以放疗和化疗。此外，雌激素受体和孕激素受体阳性的患者也可以考虑进行内分泌治疗。研究表明，抗雌激素药物他莫昔芬(Tamoxifen，TAM)对雌激素受体阳性乳腺癌患者的治疗效果显著，但对子宫内膜癌的治疗效果甚微，甚至可能导致子宫内膜癌发病率的增加。这些治疗对提高子宫内膜癌患者的生存率固然有效，但对于III、IV期子宫内膜腺癌患者，传统的手术治疗和辅助放化疗并不能提高患者的生存率，反而会导致预后不良。而随着人们对子宫内膜癌发病机制的深入研究，越来越多的分子标志物被发现与子宫内膜癌诊断、治疗、预后相关，研究子宫内膜癌相关分子机制及生物标志物对子宫内膜癌的早诊、早治、预后评估以及治疗有着重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的第一个问题是提供一种新的子宫内膜癌检测标志物，所述标志物为G3BP1蛋白。
进一步地，所述G3BP1蛋白由466个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
Ras-GTPase激活蛋白结合蛋白1(Ras-GTPase-activating protein bindingprotein 1，G3BP1)是一种含有466个氨基酸的蛋白质，其最主要的功能是促进应激颗粒(stress granules，SGs)在真核细胞的细胞质中组装，以应对某些特殊的环境压力。其在癌症中，G3BP1则主要作为癌蛋白来发挥其促癌功能。我们主要利用免疫组织化学技术探究G3BP1在子宫内膜癌中的表达水平，探讨G3BP1作为子宫内膜癌标志物的可能性，同时利用克隆形成以及Transwell迁移实验在子宫内膜癌细胞中发现了G3BP1对其增殖迁移的影响，将有助于子宫内膜癌早期诊断、靶向抗肿瘤药物研发、预后评估等，以实现精准医疗及个体化治疗。目前，国内外还没有公开任何关于在子宫内膜癌癌中将G3BP1作为诊断标志物的相关研究报道。
本发明第二方面提供一种用于检测子宫内膜癌生物标志物的试剂在制备用于检测、诊断、分类或预测子宫内膜癌或相关病症转归的试剂盒和/或试剂的应用，所述生物标志物为G3BP1蛋白。
进一步地，所述试剂盒和/或试剂用于如下方法：
(1)采用生物信息学和免疫组化分析子宫内膜癌标本及癌旁组织中G3BP1蛋白的表达情况；
(2)制备Negative Control、siG3BP1、FLAG-G3BP1质粒，并将三种质粒分别导入子宫内膜癌细胞中；
(3)通过qRT-PCR实验和Western Blot筛选技术手段(2)中转染成功的细胞；
(4)通过克隆形成实验验证G3BP1表达水平对子宫内膜癌的影响；
(5)通过transwell迁移实验验证G3BP1表达水平对子宫内膜癌细胞迁移的影响。
(6)通过CCK-8实验验证G3BP1表达水平对子宫内膜癌细胞生长的影响。
进一步地，所述siG3BP1设计有4条寡核苷酸序列，分别如SEQ IDNo.2～SEQ IDNo.5所示，分别为：
si-G3BP1-1：5’-GAAAGAACUCUUCUUAUGU-3’；
si-G3BP1-2：5’-CAAGAUUCGCCAUGUUGAU-3’；
si-G3BP1-3：5’-GUAAUGACAUGGAAGAACA-3’；
si-G3BP1-4：5’-CAAAUCAGAGCUUAAAGAU-3’。
进一步地，所述siG3BP1质粒的载体为pCMV-myc载体；
所述FLAG-G3BP1质粒的载体为pCMV-FLAG载体；
所述siG3BP1质粒插入的序列如SEQ ID No.6所示
所述FLAG-G3BP1质粒插入的序列如SEQ ID No.6所示。
进一步地，在qRT-PCR中，共使用了2对引物，其中一对为G3BP1检测引物，所述G3BP1检测引物序列如SEQ ID No.7～SEQ ID No.8所示，一对为GAPDH内参引物，所述GAPDH内参引物序列如SEQ ID No.9～SEQ ID No.10所示，具体为：
G3BP1-RTF：AAGAGTGCGAGAACAACGAA；
G3BP1-RTR：TGGTGACTGTCAGGGTGTCT；
GAPDH-RTF：CATGGCCTTCCGTGTTCCTA；
GAPDH-RTR：CCCTCAGATGCCTGCTTCA。
进一步地，所述qRT-PCR中，PCR反应程序为：
预变性：循环次数:1；95℃：30sec；
循环反应：循环次数:40；95℃：3-10sec；60℃：10-30sec；
融解曲线：循环次数:1：95℃：15sec；60℃：60sec；95℃：15sec。
本发明第三方面提供一种G3BP1蛋白在制备治疗子宫内膜癌药物中的应用，所述应用为G3BP1蛋白在制备治疗子宫内膜癌分子靶向药物中的应用。
优选地，所述应用包括G3BP1的基因片段、基因剪切体表达产物、基因编码的蛋白质抗体在制备治疗子宫内膜癌分子靶向药物中的应用。
本发明具备的有益效果：本发明首次公开了一种G3BP1蛋白质作为全新子宫内膜癌诊断标志物的应用，该蛋白质由466个氨基酸组成，蛋白大小约为68kDa，其特点是蛋白质G3BP1在制备子宫内膜癌诊断试剂盒中的应用。主要通过免疫组织化学技术进行分析，比较G3BP1蛋白质在子宫内膜癌患者样本和正常样本中的表达，以用于辅助诊断子宫内膜癌，具有灵敏性高、特异性强、周期短等特点，有利于子宫内膜癌的早期诊断和治疗，并且G3BP1在子宫内膜癌中具有成为新型生物标志物及有效治疗靶点的潜力。
附图说明
图1为120对人子宫内膜癌组织中，G3BP1免疫组织化学染色的三个代表性图像；
图2为120对人子宫内膜癌组织及配对癌旁组织免疫组化学染色结果的堆积柱状图；
图3为克隆形成实验检测AN3CA和HEC-1-A集落形成能力实验结果图；
图4为克隆形成试验结果的量化实验结果图；
图5为CCK8实验检测G3BP1表达水平对AN3CA细胞生长的影响实验结果图；
图6为CCK8实验检测G3BP1表达水平对HEC-1-A细胞生长的影响实验结果图；
图7为过表达或敲除G3BP1后AN3CA和HEC-1-A细胞的迁移实验结果图；
图8为细胞迁移实验结果量化图；
图9为qRT-PCR和蛋白质免疫印迹技术筛选G3BP1敲除的AN3CA实验结果图；；
图10qRT-PCR和蛋白质免疫印迹技术筛选G3BP1敲除的HEC-1-A实验结果图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面对本发明的具体实施例做详细的说明。需要说明的是，以下各实施例仅用于说明本发明的实施方法和典型参数，而不用于限定本发明所述的参数范围，由此引申出的合理变化，仍处于本发明权利要求的保护范围内。
需要说明的是，在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
如背景技术所述，研究子宫内膜癌相关分子机制及生物标志物对子宫内膜癌的早诊、早治、预后评估以及治疗有着重要的意义。
本发明的具体实施方式首次提供了一种子宫内膜癌的诊断标志物，该诊断标志物为G3BP1蛋白，由466个氨基酸组成，蛋白大小约为68kD，其NCBI登录号为：NP_005745.1，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
下面结合具体实施例阐述G3BP1蛋白在制备子宫内膜癌检测试剂盒和制备治疗子宫内膜癌药物中的应用
实施例1
免疫组化
收集组织样本，纳入研究的120对人子宫内膜癌组织白片源自2019年01月01日至2022年12月31日宁波市临床病理诊断中心和宁波大学附属人民医院确诊为子宫内膜癌。其中70对人子宫内膜癌组织白片来源于宁波市临床病理诊断中心，50对人子宫内膜癌组织白片来源于宁波大学附属人民医院。
(1)免疫组织化学染色
a.烤片：将附有组织的载玻片置于已预热65℃的烤片机上进行烤片，至少烘烤2h，或放于37℃烘箱过夜。
b.脱蜡与复水：将满载切片的玻片架依次放入二甲苯中浸泡20min；无水乙醇溶液中浸泡5min×2次；95％乙醇溶液中浸泡5min×1次；75％乙醇溶液中浸泡5min×1次；最后将玻片架置于去离子水中洗涤5min。
c.抗原修复：将50×的pH9.0的EDTA抗原修复液用去离子水稀释到1×并摇晃均匀，将1×EDTA抗原修复液倒进高压锅中，合上锅盖，待锅内液体沸腾，将装有切片的玻片架置于高压锅中，使柠檬酸钠抗原修复液完全浸没切片，旋紧锅盖，待高压锅气阀开始均匀冒气后开始计时，9min后关闭电磁炉电源，结束加热。将高压锅置于流动自来水下降温，打开锅盖，使石蜡切片冷却至室温。
d.洗涤：首先使用去离子水充分洗涤切片5min，接着用PBST缓冲液洗涤切片3min，重复洗涤3次。
e.封闭内源性过氧化物酶：将30％过氧化氢水溶液用去离子水稀释至3％浓度，每次现配现用，将石蜡切片放于湿盒内，在载玻片上组织所在位置滴加适量3％过氧化氢水溶液，合上湿盒的盖子，37℃封闭10-20min。
f.洗涤：用PBST缓冲液洗涤切片3min×3次，甩掉载玻片上的液体。
g.血清封闭：洗涤后的切片摆放于湿盒内，每张切片上滴加适量10％驴血清封闭液，室温下封闭15min后，甩掉切片上的封闭液。
h.一抗孵育：擦净组织周围的封闭液，用免疫组织化学染色专用疏水笔围绕组织画圈，将切片置于湿盒内，滴加适当浓度的G3BP1抗体稀释液，使抗体稀释液浸没组织，合上湿盒盖子，置于4℃冰箱过夜。
i.洗涤：用PBST缓冲液洗涤切片3min×3次。
j.二抗孵育：擦干组织周围的液体，在组织上滴加适当浓度的HRP标记驴二抗，使抗体完全覆盖组织，合上湿盒盖子，37℃孵育1h。
k.洗涤：用PBST缓冲液洗涤切片3min×3次。
l.DAB显色：将DAB显色液滴加到载玻片上组织所在位置，将载玻片置于倒置显微镜上观察组织染色情况，待染色强度达到最佳时甩掉显色液，使用去离子水洗涤3min×3次。
m.苏木素复染：在载玻片上组织所在位置滴加适量改良Lillie-Mayer苏木素染液，染色10s，甩掉染色液，将装有载玻片的玻片架置于流动自来水下洗涤1min以返蓝。
n.脱水：将装有切片的玻片架依次浸泡于75％乙醇溶液5min×1次；95％乙醇溶液中浸泡5min×1次；无水乙醇溶液中浸泡5min×3次。
o.透明：将切片置于二甲苯溶液中浸泡5min×2次。
p.封片：在载玻片上组织所在位置滴加适量中性树胶，用镊子夹取一张盖玻片轻轻覆盖在载玻片上，置于通风橱中晾干成片。
q.评分：所有样本均由两名在IHC评估方面经验丰富的独立病理学家审查，他们不了解这些患者的临床结果。评估阳性染色细胞的百分比和染色强度，以半定量地确定G3BP1表达。阳性染色细胞百分比评分如下：0，<10％；1，10％-50％；2，>50％。染色强度分级如下：0(无或弱染色＝浅黄色)、1(中度染色＝黄褐色)和2(强染色＝棕色)。G3BP1表达的总分是对阳性染色评分的细胞百分比和染色强度评分的总和，总分从0到4。对于统计分析，最终分数是本研究中报告的两位病理学家分配的独立分数的组合。通过两位病理学家之间的讨论解决了分数上的任何差异。
相关实验结果如图1～2所示，图1～2为免疫组化验证G3BP1在人子宫内膜癌组织中的表达情况。图1为120对人子宫内膜癌组织中，G3BP1免疫组织化学染色的三个代表性图像(n＝120，比例尺：10μm)；图2为120对人子宫内膜癌组织及配对癌旁组织免疫组化学染色结果的堆积柱状图(n＝120，****P<0.0001)。
实施例2
克隆形成
(1)取分别瞬时转染Negative Control，siG3BP1，FLAG-G3BP1质粒24h后、生长良好的AN3CA和HEC-1-A子宫内膜癌细胞，将贴壁细胞消化成均匀细胞悬液。
siG3BP1为G3BP1敲除质粒，FLAG-G3BP1(G3BP1-OE)为G3BP1过表达质粒，NegativeControl，siG3BP1，FLAG-G3BP1均合成于擎科公司，其中siG3BP1设置有四条4条寡核苷酸序列，分别如SEQ ID No.2～SEQ IDNo.5所示，FLAG-G3BP1的载体为pCMV-Flag，siG3BP1的载体为pCMV-Myc，siG3BP1和FLAG-G3BP1所插入的序列如SEQ ID No.6所示。
(2)吸取20μL上述均匀细胞悬液加入细胞计数板中，利用细胞计数仪测量其浓度，按照相应的比例稀释细胞悬液，用移液枪吹打均匀。
(3)取数个6孔细胞板，每孔加入2×103个细胞，定量2mL，每个处理组设置3个复孔，利用“8”字法摇匀，置于恒温培养箱，每5天换液一次，共培养10-15天。
(4)当六孔板内肉眼可见细胞集落时，弃去孔内培养基，用PBS缓冲液润洗2次，每孔加入适量4％多聚甲醛固定细胞，放置30min。
(5)弃去固定液，用PBS缓冲液润洗2次，向每孔加入800μL 0.1％结晶紫染料，放于摇床上染色10min，回收染料，用PBS缓冲液润洗3次，置于37℃烘箱过夜，待六孔板晾干后拍照并统计数据。
相关实验结果如图3～4所示，图3～4为克隆形成验证G3BP1表达水平对子宫内膜癌细胞生长的影响。图3为克隆形成实验检测AN3CA和HEC-1-A集落形成能力；图4为克隆形成试验结果的量化(ns代表无统计学差异，***P<0.001)。(NC：Negative control，G3BP1-OE：G3BP1高表达，si-G3BP1：G3BP1敲除)。
实施例3
CCK-8增值实验
(1)取分别瞬时转染Negative Control,siG3BP1,FLAG-G3BP1 24h后、生长良好的AN3CA和HEC-1-A子宫内膜癌细胞，将贴壁细胞消化成均匀细胞悬液。
(2)吸取20μL上述均匀细胞悬液加入细胞计数板中，利用细胞计数仪测量其浓度，按照相应的比例稀释细胞悬液，用移液枪吹打均匀。
(3)取6个96孔细胞板，每孔加入2×103个细胞，定量0.1mL，每个处理组设置5个复孔，利用“8”字法摇匀，置于恒温培养箱。
(4)6块96孔细胞培养板分别培养至0，1，2，3，4，5天时，避光条件下每孔加入10μLCCK8试剂，放入恒温培养箱培养2h，见孔板变橙黄色。设置酶标仪波长为450nm，测定每个孔的吸光度，重读3次，记录并整理相应数据。
相关实验结果如图5～6所示，图5～6为CCK8实验验证G3BP1表达水平子宫内膜癌细胞生长的影响。图5为CCK8实验检测G3BP1表达水平对AN3CA细胞生长的影响；图6为CCK8实验检测G3BP1表达水平对HEC-1-A细胞生长的影响(ns代表无统计学差异，***P<0.001)。(NC：Negative control，G3BP1-OE：G3BP1高表达，si-G3BP1：G3BP1敲除)。
实施例4
Transwell迁移实验
(1)取分别转染Negative Control，si-G3BP1，FLAG-G3BP1质粒24h后、生长良好的AN3CA和HEC-1-A子宫内膜癌细胞，将贴壁细胞消化成均匀细胞悬液。
(2)将细胞悬液收集至1.5mL离心管中，以1,000rpm转速离心4min。
(3)弃上清液，用1mL PBS溶液重悬细胞沉淀，按上述方法再次离心，用1mL DMEM重悬细胞，取细胞计数板对其进行计数，用DMEM按需稀释。
(4)无菌镊子夹取3个Transwell小室，放进新的24孔细胞板，向上室中均加入150μL上述细胞悬液，定量5×104个细胞，在下室中加入500μL完全培养基，静置30min后将孔板放入恒温培养箱。
(5)48h后弃去小室内外培养基，用PBS缓冲液润洗小室和孔板底部2次。
(6)向小室内加入500μL多聚甲醛固定液，放置30min.
(7)弃固定液，PBS溶液润洗2次，加入500μL 0.1％结晶紫染料，将孔板放于摇床上染色20min。
(8)回收染色剂，用PBS溶液润洗3次，自然晾干小室，拍照并统计数据。
相关实验结果如图7～8所示，图7～8为Transwell迁移实验验证G3BP1表达水平对子宫内膜癌细胞迁移的影响，图7为过表达或敲除G3BP1后AN3CA和HEC-1-A细胞的迁移实验；图8为细胞迁移实验结果量化(NC：Negative control，G3BP1-OE：G3BP1高表达，si-G3BP1：G3BP1敲除)。
实施例5
qRT-PCR实验
(1)吸尽培养液，每孔加入1ml TRIGene，用加样器吹打数次，以确保细胞完全裂解，然后转移至离心管中；
(2)裂解产物于室温放置5min，使核酸-蛋白复合物完全分离；
(3)每1ml TRIGene加入0.2ml氯仿，盖紧管盖，剧烈振荡15s，室温放置2-3min；
(4)4℃12000×g离心15min，样品会分成三层：桔黄色的下层有机相，中间层和无色的上层水相；
(5)吸取含总RNA的上层水相至一新的离心管中，吸取水相的体积为所用TRIGene试剂的60％；
(6)按照每1ml TRIGene的最初使用量加入0.5ml异丙醇，颠倒数次混匀，室温放置10min；
(7)4℃12000x g离心10min，弃除上清，可见胶状的RNA沉淀；
(8)按照每1ml TRIGene的最初使用量加入1ml 75％乙醇，颠倒数次混匀，洗涤沉淀；
(9)4℃12,000×g离心5min，弃除上清；
(10)室温倒置5-10min晾干；
(11)加入25μl DEPC-ddH2O，吹打数次溶解RNA；
(12)通过RNA电泳以及紫外分光光度计检测RNA的浓度、纯度和完整性；
(13)所得的RNA应立即使用或适量分装后-80℃保存，避免反复冻融；
(14)逆转录反应体系：
RNase-free ddH2O to 20μL；Enzyme Mix：1μL；5×All-in-one qRT SuperMix：4μL；模板RNA Total RNA：1pg-1μg。
反应程序：
50℃：15min；85℃：5sec。
(15)qRT-PCR检测：
qRT-PCR引物：
G3BP1-RTF：AAGAGTGCGAGAACAACGAA；
G3BP1-RTR：TGGTGACTGTCAGGGTGTCT；
GAPDH-RTF：CATGGCCTTCCGTGTTCCTA；
GAPDH-RTR：CCCTCAGATGCCTGCTTCA。
qPCR管中配制如下混合液：
2×Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix：10.0μl；Primer1(10μM)：0.4μl；Primer2(10μM)：0.4μl；Template DNA/Cdna：xμl；ddH2O To20.0μl。
反应步骤：
Stage1预变性：Reps:1；95℃：30sec；
Stage2循环反应：Reps:40；95℃：3-10sec；60℃：10-30sec；
Stage3融解曲线：Reps:1：95℃：15sec；60℃：60sec；95℃：15sec。
相关实验结果如图9～10所示，图9～10为qRT-PCR和蛋白质免疫印迹技术筛选G3BP1敲除的siRNA，证实si-G3BP1-3为敲除的siRNA，作为后续实验所描述的si-G3BP1。图9为qRT-PCR和蛋白质免疫印迹技术筛选G3BP1敲除的AN3CA；图10qRT-PCR和蛋白质免疫印迹技术筛选G3BP1敲除的HEC-1-A。
本具体实施方式中所有实施例均确保了实验数据及收集的原始临床资料进行全面检查、校对、整理，确保资料尽可能的完整、准确、无误。然后利用Excel软件分别建立组织、细胞数据库，对涉及的临床原始资料进行分组、归纳后将其录入表格中。最后利用SPSS26.0统计软件对最终的实验数据进行整理、分析。所有数据统计检验均取双侧概率，按照α＝0.05的检验水准进行统计检验，若P<0.05，即认为两组间的差异有统计学意义，反之则认为差异无统计学意义。柱状图、折线图等实验结果图的绘制，利用GraphPad Prism 9.0、SPSS 26.0软件共同完成。
为了检验G3BP1在子宫内膜癌组织中的表达情况，我们收集了120对人子宫内膜癌组织白片，利用免疫组织化学染色检测临床样本中G3BP1的表达水平。免疫组织化学染色结果显示，G3BP1染色表现为深浅不同的棕黄色且主要定位在子宫内膜癌组织及癌旁组织的细胞质内，与子宫内膜癌组织相比，G3BP1在相应癌旁组织中表达较弱或不表达。请病理科医生对免疫组织化学染色图片进行分析，结果显示子宫内膜癌组织中G3BP1表达水平集中在Negative(0分)、Low positive(1-2分)、High positive(3-4分)这三个等级。同时在子宫内膜癌组织中，G3BP1的阳性表达率为88.33％(106/120)，而癌旁组织仅为28.33％(34/120)，差异有统计学意义(X2＝81.52,P<0.0001)。G3BP1在子宫内膜癌组织中的表达水平明显高于相应的癌旁组织(P<0.0001)。
为了后续我们进一步验证G3BP1蛋白功能的细胞功能实。我们使用siRNA敲除子宫内膜癌细胞中的G3BP1，利用蛋白质免疫印迹技术及RT-PCR技术进行进一步的确认。
在进一步验证G3BP1对于子宫内膜癌细胞增殖以及迁移能力的影响的实验中，我们采用了CCK8实验，克隆形成实验和Transwell迁移实验。CCK8实验显示，与野生型子宫内膜癌细胞相比，G3BP1高表达组细胞增殖能力明显增加，而G3BP1低表达组细胞细胞增殖能力明显减弱。克隆形成实验显示，与野生型子宫内膜癌细胞相比，G3BP1高表达组细胞集落的数量明显增加，而G3BP1低表达组细胞集落的数量明显减少。表明了G3BP1具有可以促进子宫内膜癌细胞的增殖的能力。
Transwell迁移实验显示，在AN3CA细胞中，G3BP1高表达组较Negative Control组穿透Transwell小室的细胞数量明显增加。表明了G3BP1具有可以促进子宫内膜癌细胞迁移的能力。
这些结果提示检测G3BP1蛋白质的相对用于子宫内膜癌的诊断具有较高价值。
该发明通过检测G3BP1在子宫内膜癌组织的表达以及G3BP1高表达以及低表达对子宫内膜癌细胞增殖迁移的影响，结合统计学原理和现代生物学技术，提供、灵敏度高、特异性强、周期短和结果稳定的检测方法，为子宫内膜癌患者的诊断和治疗提供科学依据，为分子靶向治疗提供可能。
虽然本公开披露如上，但本公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员，在不脱离本公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种子宫内膜癌诊断标志物，其特征在于，所述标志物为G3BP1蛋白。
2.如权利要求1所述的子宫内膜癌诊断标志物，其特征在于，所述G3BP1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
3.一种用于检测子宫内膜癌生物标志物的试剂在制备用于检测、诊断、分类或预测子宫内膜癌或相关病症转归的试剂盒和/或试剂的应用，其特征在于，所述生物标志物为G3BP1蛋白。
4.如权利要求3所述的用于检测子宫内膜癌生物标志物的试剂在制备用于检测、诊断、分类或预测子宫内膜癌或相关病症转归的试剂盒和/或试剂的应用，其特征在于，所述试剂盒和/或试剂用于如下方法：
(1)采用生物信息学和免疫组化分析子宫内膜癌标本及癌旁组织中G3BP1蛋白的表达情况；
(2)制备Negative Control质粒、siG3BP1质粒、FLAG-G3BP1质粒，并将三种质粒分别导入子宫内膜癌细胞中，所述siG3BP1质粒为G3BP1敲除质粒，所述FLAG-G3BP1为G3BP1过表达质粒；
(3)通过qRT-PCR实验和Western Blot筛选转染成功的细胞；
(4)通过克隆形成实验验证G3BP1表达水平对子宫内膜癌的影响；
(5)通过transwell迁移实验验证G3BP1表达水平对子宫内膜癌细胞迁移的影响；
(6)通过CCK-8实验验证G3BP1表达水平对子宫内膜癌细胞生长的影响。
5.如权利要求4所述的用于检测子宫内膜癌生物标志物的试剂在制备用于检测、诊断、分类或预测子宫内膜癌或相关病症转归的试剂盒和/或试剂的应用，其特征在于，所述siG3BP1设计有4条寡核苷酸序列，分别如SEQ ID No.2～SEQ ID No.5所示。
6.如权利要求4所述的用于检测子宫内膜癌生物标志物的试剂在制备用于检测、诊断、分类或预测子宫内膜癌或相关病症转归的试剂盒和/或试剂的应用，其特征在于，所述siG3BP1质粒的载体为pCMV-myc载体；
所述FLAG-G3BP1质粒的载体为pCMV-FLAG载体；
所述siG3BP1质粒插入的序列如SEQ ID No.6所示
所述FLAG-G3BP1质粒插入的序列如SEQ ID No.6所示。
7.如权利要求4所述的用于检测子宫内膜癌生物标志物的试剂在制备用于检测、诊断、分类或预测子宫内膜癌或相关病症转归的试剂盒和/或试剂的应用，其特征在于，在qRT-PCR中，共使用了2对引物，其中一对为G3BP1检测引物，所述G3BP1检测引物序列如SEQ IDNo.7～SEQ ID No.8所示，一对为GAPDH内参引物，所述GAPDH内参引物序列如SEQ IDNo.9～SEQ ID No.10所示。
8.如权利要求4所述的用于检测子宫内膜癌生物标志物的试剂在制备用于检测、诊断、分类或预测子宫内膜癌或相关病症转归的试剂盒和/或试剂的应用，其特征在于，所述qRT-PCR中，PCR反应程序为：
预变性：循环次数:1；95℃：30sec；
循环反应：循环次数:40；95℃：3-10sec；60℃：10-30sec；
融解曲线：循环次数:1：95℃：15sec；60℃：60sec；95℃：15sec。
9.一种G3BP1蛋白在制备治疗子宫内膜癌药物中的应用，其特征在于，所述应用为G3BP1蛋白在制备治疗子宫内膜癌分子靶向药物中的应用。
10.如权利要求9所述的G3BP1蛋白在制备治疗子宫内膜癌药物中的应用，其特征在于，所述应用包括G3BP1的基因片段在制备治疗子宫内膜癌分子靶向药物中的应用；
所述应用包括G3BP1的基因剪切体表达产物在制备治疗子宫内膜癌分子靶向药物中的应用；
所述应用包括G3BP1的基因编码的蛋白质抗体在制备治疗子宫内膜癌分子靶向药物中的应用。
CN202310056428.7A 2023-01-19 2023-01-19 一种子宫内膜癌诊断标志物及其应用 Pending CN116165383A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310056428.7A CN116165383A (zh) 2023-01-19 2023-01-19 一种子宫内膜癌诊断标志物及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310056428.7A CN116165383A (zh) 2023-01-19 2023-01-19 一种子宫内膜癌诊断标志物及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116165383A true CN116165383A (zh) 2023-05-26

Family

ID=86414205

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310056428.7A Pending CN116165383A (zh) 2023-01-19 2023-01-19 一种子宫内膜癌诊断标志物及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116165383A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117310167A (zh) * 2023-08-23 2023-12-29 宁波大学 一种蛋白质amotl2在制备子宫内膜癌诊断标志物中的应用

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117310167A (zh) * 2023-08-23 2023-12-29 宁波大学 一种蛋白质amotl2在制备子宫内膜癌诊断标志物中的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108315414B (zh) 一种预测食管鳞状细胞癌预后的生物标志物
CN108179134B (zh) 基于EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片及其制备方法和应用
CN107177683B (zh) 一种膀胱癌筛选检测试剂盒
CN116165383A (zh) 一种子宫内膜癌诊断标志物及其应用
CN105200152B (zh) 长链非编码rna基因loc553103在制备鼻咽癌预后制剂上的应用
CN109022580B (zh) 一种作为犬乳腺肿瘤诊断标志物的犬环状rna基因
CN112359118B (zh) 长链非编码rna ac073352.1作为乳腺癌诊断标志物和治疗靶点的应用
CN108660212A (zh) Wdr1基因在制备非小细胞肺癌治疗和检测产品中的应用
CN108034655A (zh) 一种长非编码rna及其组合物在诊断／治疗结直肠癌中的应用
CN105200156B (zh) 长链非编码rna基因loc553103的应用
CN105988009B (zh) Netrin‑4在制备检测胃癌及预后标志物的制剂中的用途
CN110951873A (zh) 一种骨肉瘤标志物及其应用、试剂盒
CN113755594B (zh) 一种预测小细胞肺癌辅助化疗获益和识别化疗耐药治疗靶点的系统和应用
CN108342478B (zh) 循环肿瘤细胞代谢分型标志物及其应用
CN110846414A (zh) 一种卵巢癌的预后诊断标志物组合及其应用
CN112410429B (zh) Fxyd3作为胃癌诊断标志物和治疗靶标的应用
CN114085909A (zh) Top1作为宫颈癌标志物和/或治疗靶点的应用
CN106521022A (zh) Set基因在制备诊断和/或治疗胃癌产品中的应用
CN117310167A (zh) 一种蛋白质amotl2在制备子宫内膜癌诊断标志物中的应用
CN108490180B (zh) EphA8基因在制备胃癌药物及其诊断试剂盒中的应用
CN114113603B (zh) Cytl1作为胃癌预后标志物的应用
CN105267987A (zh) 长链非编码rna基因loc553103在制备胃癌细胞抑制剂上的应用
CN104740649B (zh) Plekha5在制备肿瘤诊断试剂中的应用
CN109321636A (zh) 一种用于衣原体种特异性检测的芯片及应用
CN110438225B (zh) 一种肿瘤迁移侵袭能力和/或增殖能力评价试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination