CN114113603B - Cytl1作为胃癌预后标志物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医学检测领域，具体涉及CYTL1作为胃癌预后标志物的应用。CYTL1可作为胃癌预后标志物，具体的，CYTL1可应用于制备胃癌预后检测试剂方面，尤其是，在制备胃癌预后检测试剂盒方面，CYTL1可应用于构建胃癌预后评估模型。本发明提供的方法能够迅速、准确、方便地预测和评估胃癌预后，从分子水平实现了胃癌危险度的分级分期，大大提高胃癌预后检测及评估的敏感性和特异性；将不同预后程度的患者进行分类治疗，不仅能指导个体化精准治疗，而且可以节约医疗成本，具有较高的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明属于医学检测领域，具体涉及CYTL1作为胃癌预后标志物的应用。
背景技术
我国胃癌每年新发病例约67.9万，死亡病例约49.8万，发病率和死亡率在恶性肿瘤中均居第2位，胃癌是严重影响国民健康的重大肿瘤疾病。但目前尚缺乏可广泛应用于临床的有效分子标志物用于指导胃癌的预后评估。
细胞因子样蛋白1(CYTL1)在骨髓CD34+造血干/祖细胞中表达，具有类似趋化因子CCL2(C–C chemokine ligand 2)的空间结构，通过趋化因子受体 (CCR2，CC chemokinereceptor 2)完成信号转导。但有关CYTL1的功能研究还十分有限，主要集中在软骨发育、骨关节炎发生和骨内稳态维持等方面。研究提示，CYTL1可通过TGF-β通路调节心肌纤维化；可增强子宫内膜细胞与胚胎绒毛膜细胞之间的黏附促进胚胎着床；其可作为血管生成因子促进血管生成。CYTL1可通过CCR2-EKR通路发挥炎性细胞趋化作用。因此，CCR2通路和TGF-β通路可能是CYTL1发挥功能的两条主要信号通路。CYTL1在肿瘤中的作用和机制尚不清楚。
发明内容
本发明的目的在于提供一种CYTL1作为胃癌预后标志物的应用。
本发明的另一目的在于提供胃癌患者预后评估模型的构建方法。
根据本发明具体实施方式，CYTL1可作为胃癌预后标志物，具体的，CYTL1 可应用于制备胃癌预后检测试剂方面，尤其是，在制备胃癌预后检测试剂盒方面，CYTL1可应用于构建胃癌预后评估模型。
根据本发明具体实施方式的胃癌患者预后评估模型的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
(1)获取患者胃部组织，通过免疫组化方法检测CYTL1的表达水平；
(2)利用十三点评分标准，以阳性细胞评分×染色颜色强度的评分进行判断。
十三点评分标准：
1.阳性细胞评分：
胞浆，胞膜或胞核无阳性信号<0％-0分-阴性
0％<阳性细胞占比<25％1分-阳性
25％≤阳性细胞占比<50％2分-阳性
50％≤阳性细胞占比<75％3分-阳性
阳性细胞占比≥75％4分-阳性
2.染色颜色强度评分：
胞浆，胞膜或胞核染色深浅评分0-3分
胞浆、胞膜或胞核及间质无信号颜色0分-阴性
胞浆、胞膜或胞核及间质浅黄色1分-阳性
胞浆、胞膜或胞核及间质棕黄色2分-阳性
胞浆、胞膜或胞核及间质深褐色3分-阳性
结果：阳性细胞评分*染色颜色强度评分判断IHC结果，分值越高抗体表达越高。0分-阴性，1-4分-阳性，5-8分-阳性++，9-12分-阳性+++。
当评分为0-4分时，CYTL1为低表达水平，提示相应胃癌患者临床预后良好；当评分为5-12分时，CYTL1为高表达水平，提示相应胃癌患者临床预后不良。
根据本发明具体实施方式的胃癌患者预后评估模型的构建方法，步骤(1) 中，免疫组化方法检测CYTL1，包括如下步骤：包埋患者胃部组织、切片、捞组织、脱蜡、抗原修复、血清封闭、加一抗、加二抗、加SABC、加显色剂、复染、脱水、封片、读片分析。
具体的，免疫组化方法检测CYTL1的步骤为：
(1)洗载玻片：将载玻片置于重铬酸钾和浓H2SO4混合液中，目的是为了是载玻片上的硅胶等除去，同时使一些肉眼看不见的凹凸不平的表面变平整，便于组织吸附，然后置于清水中清洗，除去残余的重铬酸钾和浓H2SO4(大约冲一个小时左右)，再将载玻片浸泡于酒精之中，然后放到架子上，置于37℃温箱中，将多聚赖氨酸涂布于玻片的表面，由于Lys带正电，而大多数的组织带负电荷，从而产生吸附作用。
(2)包埋组织：先在铁模具中加入一些液态石蜡，先稍微冷却，然后再将待包埋的组织置于石蜡之中，并排列整齐，再将塑料模具盒盖上，最后加入少许液体石蜡，进行冷冻，使石蜡变成固态。
(3)切片：将包埋好的组织从模具上取下来，并置于石蜡切片机上，切片机通过调节上下左右来来使组织和切割方向一致，然后调节切片的厚度，一般为5μm，如果比较难切，则可以适当调整厚度，用毛笔将切割的载玻片向外拉，并用小镊子将包含有完整组织的载玻片置于40℃温水中。
(4)捞组织：当组织载玻片置于40℃温水中之前，要先将水浴中的气泡赶走，以免气泡受热上浮而贴到组织上，组织受热展开，最好是组织不起皱纹，用载玻片捞组织时，一般取载玻片的下1/3或者下1/2一般每种组织捞5-6张，其中2-3张是备用的，每张载玻片上通常捞两份组织，做对照使用，这样形成的误差就比较小了，而且捞载玻片的时候最好方向一致，以便观察，再将捞出来的载玻片置于架子上，放入37℃温箱中烘干。
(5)脱蜡：依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100％酒精-100％酒精-95％酒精-90％酒精-80％酒精-70％酒精，起脱蜡作用的主要是二甲苯，依据的是相似相溶的原理。一般在每个试剂中放10min,天气热可以少放几分钟,相反,天气较冷的话,就要适当延长脱蜡时间，一般为12-15min.
(6)抗原修复：脱蜡后在清水中冲洗一段时间，加入3％H2O2浸泡10min，从而除去内源性的过氧化氢酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗两次，再加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中蒸煮3min(中火)，一般刚到沸腾即可，冷却至室温，然后再蒸煮一次，冷却至室温，蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来。
(7)血清封闭：冷却至室温后，将柠檬酸缓冲液倒掉，水洗2次，并将载玻片置于PBS中5min，洗2次，擦干组织周围的PBS液，马上加上血清，使一些非特异性的位点封闭起来，然后放入37℃温箱中半小时。血清稀释10倍 (900μLPBS：100μL血清封闭液)。
(8)加一抗：将温箱中的载玻片取出，用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清，加一抗，如果做对照实验，就在对照的组织上加PBS。加完一抗后于4℃冰箱中保存过夜。
(9)加二抗：将载玻片从冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上二抗,然后置于37℃温箱中半小时。
(10)加SABC：将片子从温箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上SABC，然后置于37℃温箱中半小时。SABC稀释 100倍(990μL PBS：10μL SABC)。
(11)加显色剂：将片子从温箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上显色剂。(显色剂的配置：在1mL水中加1滴显色剂A，摇匀，然后加1滴显色剂B，摇匀，再加1滴显色剂C，摇匀)A： DAB B：H2O2 C：磷酸缓冲液
(12)复染：将显色后的片子用清水冲洗一段时间后，浸泡于苏木精中染色，一般动物组织为半分钟，植物组织3-5min。
(13)脱水：将复染后的片子置于水中冲洗后，依次将载玻片放入70％酒精-80％酒精-90％酒精-95％酒精-100％酒精-100％酒精-二甲苯-二甲苯。每个试剂中放置2min，最后浸泡在二甲苯中，搬到通风柜中。
(14)封片：用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干。
最后，依据公认的“十三点评分标准”评分，阳性细胞评分*染色颜色强度评分判断IHC结果，0-4分为低表达，5-12分为高表达。
本发明的有益效果：
本发明从临床现象，到细胞功能，再到分子机制，揭示了CYTL1促进胃癌转移的作用，并以CYTL1为关键目标分子探讨了胃癌转移的机制。因此，将CYTL1作为胃癌预后的标志物，制备用于胃癌预后的试剂盒，并构建胃癌预后的评估方法。
本发明发现CYTL1基因在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织(p<0.001)。结合临床病理数据，根据Mann-Whitney U分析，CYTL1基因的表达在肿瘤淋巴结转移(N分期)及病理分期(Stage分期)等病理资料中存在显著性差异。 Spearman等级相关性分析N分期和Stage分期的相关系数分别为0.261(p<0.01) 和0.185(p<0.05)，均具有统计学意义，说明CYTL1的表达与肿瘤淋巴结转移及病理分期呈正相关，即随着病理分期越晚，CYTL1表达随之增加。结合生存随访数据，根据Kaplan-Meier生存分析可知，CYTL1的表达与胃癌的总生存期 (Overall survival，OS)及无病生存期(Disease-free survival，DFS)显著相关，即随着患者CYTL1的表达升高，生存期减短。
本发明提供的方法能够迅速、准确、方便地预测和评估胃癌预后，从分子水平实现了胃癌危险度的分级分期，大大提高胃癌预后检测及评估的敏感性和特异性；将不同预后程度的患者进行分类治疗，不仅能指导个体化精准治疗，而且可以节约医疗成本，具有较高的临床应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1显示CYTL1表达的免疫组化分析，其中，A：胃癌癌旁组织中CYTL1 的表达情况；B：胃腺癌组织中CYTL1的表达情况；
图2显示CYTL1表达生存预后的关系，其中，(A)CYTL1高表达组和低表达组的总生存期OS的Kaplan-Meier生存分析情况(p<0.01)；(B)CYTL1 高表达组和低表达组的无病生存期DFS的Kaplan-Meier生存分析情况 (p<0.01)；
图3显示CYTL1的表达在胃癌和肺癌中对比分析情况；(A)CYTL1在胃正常组织vs胃腺癌和肺正常组织vs肺癌的表达情况；(B)CYTL1基因在胃癌和肺癌中的甲基化程度；(C)CYTL1的表达对胃癌和肺癌生存预后影响； (D)CYTL1的表达对胃癌和肺癌Stage分期(7th)影响的对比；(E)CYTL1 的表达对胃癌和肺癌M分期影响的对比；(F)CYTL1的表达对胃癌和肺癌T 分期影响的对比；
图4显示CYTL1的表达在胃癌不同Lanren分型中的差异；
图5显示CYTL1的表达对促进胃癌细胞的增殖作用；(A)胃癌细胞系中 CYTL1的表达状况分析；(B)Westernblot检测CYTL1干扰效果；(C)Celigo 细胞计数检测细胞增殖情况；(D)FACS细胞周期检测情况；(E)Annexin-V/PI 标记法检测细胞凋亡情况；
图6显示CYTL1的表达对胃癌细胞的迁移的促进作用，(A)划痕实验检测细胞迁移能力结果；(B)Transwell实验检测迁移能力结果。
图7显示显著性差异基因分析结果；(A)为火山图；(B)为层次聚类分析结果；
图8显示显著性差异基因的生物信息分析结果，(A)差异基因在疾病与功能中的显著性富集情况；(B)差异基因表达水平的变化对疾病与功能的激活抑制关系；(C)差异基因在经典通路中的显著性富集情况；(D)CYTL1 敲减后下游抑制性信号通路RhoA信号通路情况；(E)基于IPA的相互作用网络分析结果；(F)CYTL1敲减后下游抑制性信号通路TGF-β信号通路；
图9显示CYTL1调控RhoA的表达和活性情况，(A)qPCR分析不同CYTL1 表达状态下RhoA的mRNA表达水平；(B)Westernblot分析不同CYTL1表达状态下RhoA的蛋白表达水平和Rho-GTP活性状态水平。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1胃癌组织芯片分析
利用胃癌组织芯片通过免疫组化分析了129例胃腺癌组织和119例癌旁组织中CYTL1的表达及与临床特征的相关性和对生存的影响。
具体实验步骤：
(1)标本来源：标本来源于2012年12月-2015年3月在四川大学华西医院接受手术治疗的150例胃癌患者。患者年龄39-86岁，中位年龄61岁，其中男性患者110例，女性患者40例。所有患者术前均未接受化疗，均有完整的临床资料及术后回访资料。
(2)所有的标本均经过10％甲醛固定，常规石蜡包埋。将收集的150块蜡块应用组织芯片仪构建组织芯片。
(3)对目标蛋白CYTL1进行免疫组化染色，包括：脱蜡、抗原修复、血清封闭、加一抗、加二抗、加SABC、加显色剂、复染、脱水、封片等步骤。
(4)由两位病理学家独立阅片，判断免疫组化染色结果。去掉染色失败的样本后，得到实际可以分析的胃癌病理119例和癌旁正常组织118例。
(5)依据“十三点评分标准”评分，阳性细胞评分*染色颜色强度评分判断免疫组合(IHC)结果，0-4分为低表达，5-12分为高表达。
(6)应用SSPS19.0软件对结果分析，应用卡方检验(Fisher精确检验) 对两组间不同进行判别；应用spearman相关性检验对CYTL1与临床病理特征 (如肿瘤大小、分期、脉管神经浸润、HER2表达等)的相关性进行分析；应用Kaplan-meier法对CYTL1对胃癌患者的生存时间进行分析比较。
结果如表1，图1中A、B所示。
表1胃腺癌组织和癌旁组织中CYTL1表达的免疫组化分析
结果如表1所示，CYTL1基因在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织(p<0.001)。
利用Spearman等级相关性分析N分期和Stage分期的相关系数，结果见表 2：
表2胃腺癌组织中CYTL1表达与N分期和Stage分期的相关性分析
结果如表2所示，N分期的相关系数为0.278(p<0.01)，Stage分期的相关系数为0.215(p<0.05)，均具有统计学意义，说明CYTL1的表达与肿瘤淋巴结转移及病理分期呈正相关，即随着病理分期越晚，CYTL1表达随之增加。
结合生存随访数据总生存期(Overall survival，OS)和无病生存期 (Progression-free survival，PFS)，根据Kaplan-Meier生存分析，结果如图2 所示。CYTL1的表达与胃癌的总生存期OS及无病生存期DFS显著相关，即随着患者CYTL1的表达升高，生存期减短。
注：
总生存期(Overall survival，OS)：从随机化分组开始，至因任何原因引起死亡的时间。对于死亡之前就已经失访的受试者，通常将最后一次随访时间计算为死亡时间。
无进展生存期(Progression-free survival，PFS)：指肿瘤疾病患者从接受治疗开始，到观察到疾病进展或者发生因为任何原因的死亡之间的这段时间。
本发明考察肺癌和胃癌的CYTL1在对比正常组织的表达量、甲基化修饰、生存预后和临床分期的区别。
具体分析步骤：
1、从GDC官网下载TCGA胃癌和肺癌基因表达数据、基因甲基化数据和临床数据；
2、从GTEx官网下载正常胃癌和肺癌的基因表达数据；
3、基于瘤种(胃癌和肺癌)，分别合并TCGA和GTEx的基因表达数据，得到胃正常组织206例、胃腺癌375例，肺正常组织347例、肺癌535例。提取CYTL1基因的表达数据，利用wilcoxTest统计方法，比较正常组织和肿瘤组织中CYTL1的表达情况(图3A)。
4、基于TCGA数据库下载的甲基化数据，利用wilcoxTest方法分析在正常组织和癌组织中CYTL1甲基化修饰程度的差异(表3)。
5、合并TACG数据库下载的基因甲基化数据和表达数据，绘制散点图，评估甲基化与表达的相关性(图3B)。
6、以CYTL1在该肿瘤中表达的中位值为界区分为“高表达组”和“低表达组”，胃癌和肺癌的样本量分别为367例和467例，应用Kaplan-meier法对 CYTL1不同表达水平下的生存时间进行分析比较，绘制生存曲线，对比CYTL1 的表达对胃癌和肺癌生存预后影响(图3C)。
7、合并基因表达数据和临床数据(如T分期、M分期和Stage分期)，利用wilcoxTest或KruskalTest方法分析在不同临床特征下CYTL1的表达差异 (图3D、3E和3F)。
8、进一步针对胃癌不同Lauren分型下(弥漫型、肠型、混合型)，其中包含弥漫型74例，肠型70例，其他分型不明或混合型为231例,利用KruskalTest 方法分析不同分型下CYTL1基因表达差异(图4)
结果：
如图3中A所示，CYTL1在胃正常组织、胃腺癌和肺正常组织、肺癌的表达模型明显不同。在胃组织中，相对于胃正常组织，肿瘤组织中CYTL1呈高表达(p<0.0001)；在肺组织中，相对于肺正常组织，肺癌组织CYTL1呈低表达(p<0.01)。
表3 CYTL1基因甲基化修饰程度在胃正常组织/胃腺癌和肺正常组织/肺癌中的对比
如表3、图3中B所示，在胃组织中，肿瘤组织的CYTL1甲基化程度高于正常组织(logFC-0.36)，CYTL1甲基化与CYTL1表达的相关性不具有统计学意义(Cor＝-0.007,p＝0.90)；而在肺组织中，肿瘤组织中CYTL1的甲基化程度高于正常组织(见表3,logFC 0.22)，并且甲基化与表达具有统计学意义的相关性(Cor＝-0.101,p<0.05)。由此可见，CYTL1基因在胃癌和肺癌中的甲基化程度 (相对于正常组织)明显不同。
如图3中C所示，在胃癌中，CYTL1的高表达组和低表达组之间生存具有显著性生存差异(p<0.0001)，低表达组生存期更长。在肺癌中，CYTL1的高表达组与低表达组生存没有统计学差异(p＝0.81)。
如图3中D所示，在两种肿瘤中，CYTL1的表达在不同Stage分期之间均无统计学差异，但在胃癌中存在随Stage分期程度增加，CYTL1表达量增加的趋势，而肺癌中未观察该趋势。
如图3中E所示，在胃癌中，CYTL1的表达与是否发生远处转移(即M分期)具有统计学意义的相关性(p＝0.002)，而肺癌中几乎没有差异(p＝0.8)。
如图3中F所示，在两种肿瘤中，CYTL1的表达在不同T分期之间均无统计学差异，但在胃癌中存在随T分期程度增加，CYTL1表达量增加的趋势，尤其是胃癌在局限于黏膜层(T1)与已经侵犯浆膜层(T4)之间也具有边缘统计学差异(p＝0.084)，而肺癌中未观察该趋势。
Lanren分型对于胃癌的临床治疗指导意义重大，Lanren分型中的肠型预后较好，对治疗反应性较好，而弥漫性预后极差，对治疗反应也较差。如图4所示，弥漫型胃癌的CYTL1表达明显高于肠型胃癌，差异具有统计学意义 (p<0.001)。
因此，相对于癌旁正常组织，CYTL1在胃腺癌组织中呈高表达。在胃腺癌组织中的CYTL1表达量与临床分期、生存预后和组织分型均具有显著相关性，说明CYTL1是与胃癌的发生发展重要的分子。
实施例2体外细胞实验证实CYTL1可以促进胃癌细胞的恶性生物学表型增殖和迁移
具体实验步骤：
(1)利用Western Blot分析CYTL1的表达：从培养箱中取出细胞，弃去细胞培养液，PBS洗涤1次；弃去PBS，加入Western及IP细胞裂解液和PMSF, 配制比例为100:1，置于4℃冰上，用移液枪头吹打至细胞充分裂解，将细胞裂解样品转移入离心管中，冰上继续裂10～15min；4℃，12000rpm，离心10min，取上清转移到新的离心管中，加入loading Buffer，恒温器孵育，100℃，20min； 4℃，12000rpm，离心1min，-20℃保存备用。取样进行SDS-PAGE胶电泳，电泳结束后，使用转移电泳装置，在4℃，300mA恒流条件下电转90min，将蛋白转移到PVDF膜上。进行免疫显色：封闭：用封闭液(含5％脱脂牛奶的TBST溶液)室温摇床封闭PVDF膜1h；一抗孵育：封闭液稀释抗体，然后不封闭好的PVDF膜室温孵育2h或4℃过夜；洗膜：TBST洗膜3次，每次10min；二抗孵育：用封闭液稀释相应的二抗，室温下孵育PVDF膜1h；洗膜：TBST洗膜3次，每次10min；采用Millipore公司immobilon Western ChemiluminescentHRP Substrote试剂盒进行显色；化学发光：使用化学发光成像仪进行化学发光。
(2)Celigo细胞计数检测细胞增殖：将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，计数；根据细胞生长快慢决定铺板细胞密度(大多数细胞铺板数设定为2000cell/well)。每组3复孔，培养体系为 100μL/孔，铺板过程中需确保每孔加入细胞数目一致37℃、5％CO2培养箱培养；从铺板后第二天开始，每天Celigo检测读板一次，连续检测读板5天；通过调整analysis settings的输入参数，准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量；对数据进行统计绘图，绘出5天的细胞增殖曲线。
(3)FACS细胞周期检测：待细胞生长至覆盖率为70％时药物诱导凋亡； (药物作用时间和药物浓度需要提前预实验摸索)。收集培养上清于5mL离心管中，D-Hanks洗涤细胞一次，并收集于同一5mL离心管中，胰酶消化细胞，培养上清终止消化，收集细胞于同一5mL离心管中；1500rmp 5min离心，弃去上清；D-Hanks液洗涤细胞沉淀一次，1500rmp 3min离心，收集细胞；5. 1×binding buffer洗涤细胞沉淀一次，1500rmp 3min离心，收集细胞；6.0.1-1ml(使细胞悬液最终密度为1x106to 1x107cell/mL)1×细胞染色缓冲液重悬细胞沉淀；取细胞悬液100μL(1x105to 1x106细胞)，加入5μL annexin V-APC染色；避光保存样品，在15分钟内赶到上机地点；1500rmp 3min离心去上清，100μL 1×binding buffer重悬细胞；5μL PI染色(40×PI染液稀释10倍使用)，1×细胞染色缓冲液补足上机体系至300μL；转移至流式上机管中，上机检测；
(4)PI染色检测细胞周期：胰酶消化收集所有经过实验处理，用冷的PBS 清洗3次；用70％的冷酒精固定，4℃过夜；1500rpm/min离心3min，用PBS 清洗3次；1500rpm/min离心3min，应用RNase(125U/ml,Calbiochem)处理， 37℃孵育30min；1500rpm/min离心3min，Propidium iodide(50mg/mL, Sigma-Aldrich)1mL染色DNA，室温孵育30min，避光；应用FACScan(Beckman Coulter)检测DNA-PI的荧光强度，流式细胞仪的激发光和发射光的波长分别为 488nm和530nm。
(5)Annexin-V/PI标记法检测细胞凋亡：用不含EDTA的胰酶消化收集细胞后，用冷的PBS洗细胞2遍，加入1×Binding Buffer 100ul重悬细胞，细胞浓度为1×106/mL；加入5ul Annexin-V和10uL PI，混匀，室温避光15min染色。加入1×Binding Buffer 400uL置于冰上，样品在1小时内用流式细胞仪检测。
(6)Transwell实验：把小室擦干净后在超净工作台照紫外过夜。将小室倒扣并在小室的底部外侧滴加0.1％的明胶室温放置20-30分钟。将细胞消化并调浓度。24孔板加600mL的含有刺激因子的培养基。小室上还未干的明胶甩掉，加细胞放入24孔板里。放入细胞培养箱培养4-6h。取出小室，倒掉里边的培养基。将小室放入装有600mL结晶紫的24孔板染色1小时。移到空的24 孔板后即可在显微镜下观察了。
(7)克隆形成实验：将8×103–80×103个胃癌癌细胞接种于35mm培养皿中，培养过夜使细胞贴壁，加入相应药物后培养7-14天。其间每3天更换一次新鲜培养基和药物，待集落形成后，先用PBS洗3遍，再用4％多聚甲醛固定 15分钟，PBS洗3遍，然后用0.5％结晶紫染色15分钟，PBS洗3-5遍后，晾干，数码相机拍照采图。
实验结果如图5中A所示，相对于MGC-803细胞系，AGS、BGC-823和 SGC-7901细胞系明显高表达CYTL1(p<0.05)，选用高表达细胞株进行后续实验。构建CYTL1-shRNA干扰质粒载体，利用qRT-PCR筛选高效干扰靶点，进行慢病毒载体构建及病毒包装，以CYTL1-shRNA慢病毒感染胃癌细胞AGS、 BGC-823和SGC-7901，通过Westernblot验证干扰CYTL1的表达效果。结果如图5中B所示：在胃癌AGS和SGC-7901细胞中，对CYTL1的干扰效果显著，蛋白表达明显减少。
利用Celigo细胞计数检测细胞增殖以及流式分析细胞周期和细胞凋亡，考察干扰CYTL1表达对抑制胃癌细胞系的增殖能力的作用。结果如图5中C所示，在AGS和SGC-7901细胞中，干扰组shCYTL1抑制增殖率分别为shCtrl 对照组的2.3倍和2.0倍(p<0.001)。
图5中C所示为FACS细胞周期检测结果，相对于对照组shCtrl,在AGS 和SGC-7901细胞中，干扰CYTL1表达后S期细胞显著减少(p<0.001)，G0/G1 期细胞增多(p<0.05)。
图5中E所示Annexin-V/PI标记法检测细胞凋亡结果，在AGS和SGC-7901 细胞中，干扰组shCYTL1细胞凋亡比例分别为shCtrl对照组的2.1倍和5.3倍 (p<0.001)。
利用划痕实验和Transwell实验考察干扰CYTL1表达对抑制胃癌细胞系的迁移能力影响。图6中A显示划痕实验检测细胞迁移能力结果，在AGS细胞中，干扰CYTL1后细胞8h迁移率下降44％(p<0.001)；在SGC-7901细胞中，干扰CYTL1后细胞48小时迁移率下降64％(p<0.001)。图6中B显示Transwell 实验检测迁移能力结果，在AGS细胞中，干扰CYTL1后细胞迁移率下降52％ (p<0.001)；在SGC-7901细胞中，干扰CYTL1后细胞迁移率下降36％(p<0.001)。
综上，由此可见，通过体外细胞实验证实，敲减CYTL1可以显著抑制胃癌细胞的增殖和迁移能力。即CYTL1可以促进胃癌细胞的增殖和迁移恶性生物学表型。
实施例3考察CYTL1调控胃癌恶性生物学表型的下游分子
利用shCtrl和shCYTL1慢病毒感染胃癌细胞系(AGS,SGC-7901， BGC-823)，每个处理设置3次实验重复，将提取的合格RNA样本(浓度≥ 50ng/uL且RIN值≥7)，利用全基因表达谱芯片(Affymetrix Clariom S)分析 CYTL1高表达组(shCtrl)和低表达组(shCYTL1)之间的差异表达基因。通过IPA进行显著差异表达基因功能分析(疾病和功能分析、经典通路富集分析、上游因子预测分析和因果网络分析等)，筛选出候选的通路和下游基因。利用qPCR和Westernblot验证该下游基因的表达。
显著性差异分析基于经验贝叶斯分布的线性模型，计算显著差异性水平 P-value。显著性差异基因的筛选标准为：|Fold Change|≥1.5且P.Value<0.05，得到上调基因数目1199个，下调基因数目1445个。采用两组样本间的基因表达差异倍数(Fold change)和显著性检验得到的P.Value两个因素共同绘制火山图，如图7中A所示，横坐标为差异倍数(以2为底的对数变换)，纵坐标为差异的显著性P.Value(以10为底的对数变换)，红色点为以Fold Change ≥1.5且P.Value<0.05为标准筛选的显著性差异基因，绿色点为以FoldChange ≤-1.5且P.Value<0.05为标准筛选的显著性差异基因，灰色点为其他无显著差异的基因。
以|Fold Change|≥1.5，且P.Value<0.05为标准筛选的差异基因的表达谱，对 KD和NC两组样本进行层次聚类的热图，结果如图7中B所示的层次聚类分析图。
利用IPA(Ingenuity Pathway Analysis)进行显著性差异基因的生物信息分析。IPA是一个商业化的一体化并以网络为基础的应用软件，能够分析、整合基因表达的数据，实现疾病和功能分析，经典通路分析，上游因子预测分析和因果网络分析。基于IPA的疾病和功能分析发现，干扰CYTL1表达后的下游差异基因在肿瘤和胃肠道疾病中的显著富集，如图8中A、B所示。
基于IPA的经典通路分析发现,干扰CYTL1表达后下游差异基因富集在多条经典信号通路中，经典通路Ephrin Receptor Signaling，TGF-βSignaling，RhoA Signaling，Cyclins and Cell Cycle Regulation通路被显著抑制，Z-score分别为 -2.191，-2.626，-2.5和2.909。提示与肿瘤密切相关的TGF-β信号通路和Rho 家族信号通路的调控，在CYTL1下游调控中发挥着重要作用，如图8中C、D 和F所示。
基于IPA的相互作用网络分析。显著富集的Cyclins and Cell Cycle Regulation通路和经典通路PI3K/AKT Signaling,mTOR Signaling通路基因与目的基因CYTL1相互作用关系网络构建。其中CYTL1能够间接通过其他基因 FMR1，AP2M1等基因影响IL-8Signaling,Cyclins and Cell Cycle Regulation，PI3K/AKT Signaling,mTORSignaling通路中包括RHOA等下游基因,如图8中 C、D和F所示。
图8中A为差异基因在疾病与功能中的显著性富集情况，横坐标为通路名称，纵坐标为富集的显著性水平(以10为底的负对数变换)，可以看出，差异基因在肿瘤和胃肠道疾病中的显著富集。
图8中B为差异基因表达水平的变化对疾病与功能的激活抑制关系。橙色代表疾病或功能状态被激活(Z-score>0)，蓝色代表疾病或功能状态被抑制 (Z-score<0)，灰色表示疾病或功能状态未确定(Z-score无法计算)；依照IPA 的内部算法和标准，认为Z-score≥2代表该疾病或功能被显著激活，Z-score≤ -2代表该疾病或功能被显著抑制。
图8中C为差异基因在经典通路中的显著性富集情况，横坐标为通路名称，纵坐标为富集的显著性水平(以10为底的负对数变换)；其中，橙色标注表示通路被激活(Z-score>0)，蓝色标注表示通路被抑制(Z-score<0)，橙色和蓝色的深浅(或Z-score的绝对值)代表激活或抑制的程度(依照IPA的内部算法和标准，认为Z-score≥2代表该通路被显著激活，Z-score≤-2代表该通路被显著抑制)；Ratio表示在此信号通路中差异基因数与该通路中包含的所有基因数的比值。肿瘤相关经典通路Ephrin Receptor Signaling，TGF-βSignaling， RhoA Signaling，Cyclins and Cell Cycle Regulation通路被显著抑制，Z-score分别为-2.191，-2.626，-2.5和2.909。
图8中D为CYTL1敲减后下游抑制性信号通路RhoA信号通路，红色代表该基因在实验结果中表现为显著上调，绿色代表该基因在实验结果中表现为显著下调。
图8中E为基于IPA的相互作用网络分析，显著富集的Cyclins and Cell CycleRegulation通路和经典通路PI3K/AKT Signaling,mTOR Signaling通路基因与目的基因CYTL1相互作用关系网络构建。其中CYTL1能够间接通过其他基因FMR1，AP2M1等基因影响IL-8Signaling,Cyclins and Cell Cycle Regulation，PI3K/AKT Signaling,mTORSignaling通路中ABL1，CCNA2， CCND1，EGFR，EIF4A1，EIF4G1，GNAI2，HSP90AA1，ITGB3，MAP4K4， MDM2，MYL9，NFKB1，NFKBIA，PAK2，PDGFC，PRKAB1，PRKD1，PTGS2， RAC2，RHOA，RPS8，RRAS2等下游基因。
图8中F为CYTL1敲减后下游抑制性信号通路TGF-β信号通路，红色代表该基因在实验结果中表现为显著上调，绿色代表该基因在实验结果中表现为显著下调。
根据以上实验结果，本发明选择RhoA作为后续研究的重点下游分子进行深入验证，并阐明相关调节通路。
利用qPCR和Westernblot分析RhoA在CYTL1不同表达状态下的表达和活性状况，结果证实CYTL1可以调控RhoA的mRNA和蛋白表达水平，还可以促进RhoA-GDP失活状态向RhoA-GTP活性状态转化。
图9中A显示qPCR分析不同CYTL1表达状态下RhoA的mRNA表达水平，结果证实，敲除CYTL1后，可以显著降低AGS、SGC-7901和BGC-823 胃癌细胞系中RhoA的mRNA表达水平。
图9中B显示Western blot(包含pull-down获得的Rho-GTP活性状态 Westernblot分析)分析不同CYTL1表达状态下RhoA的蛋白表达水平和 Rho-GTP活性状态水平。结果证实，敲除CYTL1后可以显著降低AGS、 SGC-7901和BGC-823胃癌细胞系中RhoA的蛋白表达水平和RhoA活性状态水平。
由此可见，在胃癌细胞中，CYTL1的下游差异表达基因和通路富集分析发现CYTL1可影响多条肿瘤经典通路，尤其是RhoA通路和TGF-β通路。Western blot实验进一步证实CYTL1可调控RhoA的表达和活性。因此，RhoA是介导 CYTL1调控胃癌恶性生物学行为的重要下游效应分子。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (1)
1.胃癌患者预后评估模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：
（1）获取患者胃部组织，通过免疫组化方法检测CYTL1的表达水平；
（2）利用十三点评分标准，以阳性细胞评分×染色颜色强度的评分进行判断，当评分为0-4分时，CYTL1为低表达水平，判断胃癌患者预后良好；当评分为5-12分时，CYTL1为高表达水平，判断胃癌患者预后不良；
步骤（1）中，免疫组化方法检测CYTL1，包括如下步骤：包埋患者胃部组织、切片、捞组织、脱蜡、抗原修复、血清封闭、加一抗、加二抗、加SABC、加显色剂、复染、脱水、封片和读片分析；
免疫组化方法检测CYTL1步骤中，包埋患者胃部组织步骤前，还包括洗载玻片。
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
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