CN102830227A - 一种检测水样双酚a的酶联免疫试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

发明提供了一种检测水样双酚A的酶联免疫试剂盒，它含有：包被有包被原的酶标板，酶标二抗溶液，双酚A抗体溶液，双酚A标准品溶液，底物显色液，终止液和浓缩洗涤液；利用上述酶联免疫试剂盒检测对于悬浮物含量较高的水样双酚A的方法，先进行样品前处理，然后用试剂盒进行检测，最后分析检测结果。本发明提供的酶联免疫试剂盒用于水样双酚A的检测，具有操作简便和灵敏度高的优点，并且制作费用低廉，能够进行现场监控且适合大量样本筛查。

Description

一种检测水样双酚A的酶联免疫试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及检验检疫，特别涉及一种用于检测水样中双酚A的酶联免疫试剂盒。

背景技术

双酚A，中文名称2,2-双（4-羟基苯基）丙烷，英文名称2,2-bis(4-hydroxyphenyl)propane或Bisphenol A (简称为BPA)，易溶于醇、丙酮、乙醚、二氯甲烷、苯及稀碱液等，微溶于四氯化碳，几乎不溶于水。BPA是重要的有机化工原料，苯酚和丙酮的重要衍生物，主要用于生产聚碳酸酯、环氧树脂、聚砜树脂、聚苯醚树脂、不饱和聚酯树脂等多种高分子材料。也可用于生产增塑剂、阻燃剂、抗氧剂、热稳定剂、橡胶防老剂、农药、涂料等精细化工产品。

BPA在生产生活中几乎无处不在，从矿泉水瓶、医疗器械到及食品包装的内里，都有它的身影。每年全世界生产2700万吨含有BPA的塑料。但BPA也能导致内分泌失调，威胁着胎儿和儿童的健康。BPA是制造包括婴儿奶瓶、水瓶、其他食品和饮料容器等坚硬和透明聚碳酸酯塑料的关键物质。癌症和新陈代谢紊乱导致的肥胖也被认为与BPA有关。国内外市售婴儿用聚碳酸酯塑料奶瓶在沸水下检出双酚A析出，可能会危害婴儿的健康；桶装水因为其便利而在人们日常生活普及，已有文献报道在桶装水中检出的双酚A，长期摄入含有双酚A的饮用水会影响健康；而事实上研究表明长期暴露在食品包装物上的双酚A剂量水平要比实验室里双酚A致动物癌变的剂量水平高的多。由于欧盟认为含双酚A奶瓶会诱发性早熟，从2011年3月2日起，禁止含生产化学物质双酚A(BPA)的婴儿奶瓶。

随着人们对食品安全意识的提高，由于双酚A在环境中的广泛存在及其危害性。为保障食品安全，开发出快速、有效并能够适应现场检测需要的双酚A残留的检测手段显得尤为重要。

目前现有技术中对双酚A的测定多采用色谱法，但该方法中所用的仪器造价昂贵且耗时较长，样品前处理复杂，而且不能用于现场检测，使其应用范围受到一定的限制。与之相比，ELISA技术在大量样品的现场快速筛选方面有着无可比拟的独特优势。但是目前国内实际应用的检测双酚A的ELISA试剂盒很少，主要依赖进口。因此，本课题致力于研究制备效价高，亲和性好，特异性强的抗体，用于建立BPA免疫分析检测的产品和使用方法。

发明内容

本发明的目的是克服上述现有技术存在的不足，提供一种操作简便、费用低廉、灵敏度高、能够适合大量样本筛查的试剂盒，以及利用其检测水样中双酚A含量的检测方法。本发明提供的酶联免疫试剂盒用于水样双酚A的检测，要能够做到操作简便、费用低廉、灵敏度高并且能够进行现场监控，还适合大量样本筛查。

为了达到上述发明目的，本发明提供的技术的原理和技术方案如下：

一、本发明的检测原理为：

先在酶标板上固定一定量的双酚A偶联抗原，加入样本溶液或双酚A标准品溶液后，接着加入一定量的双酚A特异性抗体，使待测抗原和固定抗原竞争性地与溶液中游离的双酚A特异性抗体结合，充分洗涤未反应的抗体和抗原，再加入一定量的酶标二抗(抗抗体) 进行放大作用，充分洗涤后，加底物显色液显色。结果如待测抗原含量越多，与固相抗体结合的抗体越少，酶标二抗的量就越少，显色越浅，两者呈负相关。此实验的条件是：固定抗原限量，抗体定量，酶标二抗限量。固定抗原与待测抗原和抗体结合的位点相同，竞争性地与抗体结合。

二、本发明的技术方案为：

本发明一方面提供了一种用于检测水样中双酚A的酶联免疫试剂盒，它含有：

(1) 包被有双酚A-BSA包被抗原的96孔酶标板；

 (2) 双酚A标准品溶液；

 (3) 双酚A特异性抗体；

 (4) 底物显色液；

 (5) 终止液；

 (6) 浓缩洗涤液；

 (7) 酶标二抗溶液   。  

在本发明检测水样中双酚A的酶联免疫试剂盒中，所述包被抗原为双酚A半抗原与牛血清蛋白的偶联物。通过Friedel-Crafts烷基化反应在双酚A上引入羧基，制得能够与蛋白质偶联的双酚A半抗原，再将其与N-羟基丁二酰亚胺和N,N’-二环己基碳二亚胺混合后反应，与蛋白质偶联制备双酚A完全抗原，

在本发明检测水样中双酚A的酶联免疫试剂盒中，双酚A特异性抗体为兔抗双酚A的多克隆抗体，用双酚A半抗原与牛血清蛋白的偶联物作为免疫原通过免疫兔制得。

在本发明检测水样中双酚A的酶联免疫试剂盒中，所述的洗涤液为0.05%的吐温-20（TWEEN-20）磷酸盐缓冲液。所述的显色剂由显色剂A液和显色剂B液组成（例如，体积比为1：1），显色剂A液为过氧化氢，显色剂B液为四甲基联苯胺溶液。

在本发明检测水样中双酚A的酶联免疫试剂盒中，所述的酶标二抗的标记酶为辣根过氧化物酶。

为方便现场检测和大量样本筛查，所述试剂盒还可以进一步包括双酚A-BSA包被的96孔酶标板、双酚A标准溶液、底物显色液、浓缩洗涤液、终止液。

另一方面，本发明还提供了一种检测样品中双酚A含量的方法，包括步骤：

 (1)样品前处理；

 (2)用上述的试剂盒进行检测，向包被有双酚A抗原的酶标板孔中加入标准品或样品溶液，再加入抗双酚A多克隆抗体，孵育后洗涤拍干，加入酶标记二抗，孵育后洗涤拍干，显色、终上，用酶标仪测定吸光度值；

(3)分析检测结果。

基于上述技术方案，本发明的试剂盒和检测方法与现有技术相比具有如下技术优点：

1.本发明检测双酚A的试剂盒主要采有间接竞争酶联免疫测定法定性或定量样品中双酚A含量；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品。

2.本发明该试剂盒采用高特异性的双酚A多克隆抗体，主要试剂以工作液形式提供，可以减少试剂盒的操作步骤，为使用者节省时间并降低因操作步骤冗繁造成的误差。

3.本发明具有灵敏度高、特异性强、高精确度、高准确度、对仪器设备要求低、试剂保存时间长、自动化程度高、无放射性同位素污染的等优点。

附图说明

图1 是本发明专利检测水样双酚A的酶联免疫试剂盒中的双酚A的检测标准曲线图。

具体实施方式

下面我们结合附图和具体的实施例来对本发明的检测水样双酚A的酶联免疫试剂盒及其检测方法做进一步的详细阐述，以求更为清楚明了地理解本发明的成分组成和工作流程，但不能以此来限制本发明的保护范围。

一、先进行双酚A完全抗原合成。

（1）半抗原的合成。

组织反应装置，将250mL三口反应烧瓶放入带有冰浴的1L玻璃容器中，玻璃容器盛有冰-盐水混合液，带有数字温度计可随时读数，然后将玻璃容器置于磁力搅拌器中；向三口烧瓶中加入磁力搅拌子，插入回流冷凝管（上装无水CaCl₂干燥管和尾气吸收装置）、插入滴液漏斗。再向三口烧瓶中加入50mL N,N’-二甲基甲酰胺、1.335g (0.01 mol)无水AlCl3 和2.280g (0.01mol) BPA，搅拌，冰浴冷却至0℃以下，缓慢滴加0.945g (0.01 mol)氯乙酸，滴加过程中保持温度在0～5℃，滴加完毕，在0℃反应3 h，再补加1.335g无水AlCl3，升温至60～70℃反应，使溶液沸腾，回流3h。反应结束后，冷却至室温，然后经离心、过滤、干燥得到白色固体，即为羧基化双酚A (半抗原)。

（2）双酚A完全抗原的合成及纯化。

采用DCC+NHS法合成双酚A完全抗原，具体步骤如下：

1、将22mg半抗原（MW=228）溶于1mL N,N-二甲基甲酰胺，通过磁力搅拌的方式使其完全溶解成溶液。

2、称取13.3mg NHS和17.4mg DCC加入上述溶液中，室温下磁力搅拌过夜，反应现象为：搅拌过程中逐渐出现白色沉淀。

3、将该溶液以2000r/min离心10min，弃沉淀，收集上清即为溶液A。

4、称取50mg BSA（Roche，200g）溶于5mL 0.01M (pH7.4) PBS中，为溶液B。

5、将溶液B预冷至约4℃。

6、将溶液A利用200μL的移液枪逐滴加入到溶液B中，控制速度使其在30~45min加完，加完后低温下继续搅拌3h生成反应混合液。反应现象为：随着溶液A的滴入，溶液B逐渐出现浑浊。

7、将反应混合液装入透析袋透析。

8、在4℃下用0.01M (pH7.4) PBS透析两天，每天换液3次。

9、收集透析后的浑浊溶液，2000r/min离心10min，弃沉淀，收集上清溶液。

二、双酚A多克隆抗体的制备。

在免疫前一周取家兔耳缘静脉血，分离血清作为阴性对照。采用合成的完全抗原双酚A-BSA对两只家兔进行免疫。

为了获得针对半抗原双酚A质量良好的抗体，采用小剂量长程免疫方案：

(1) 免疫途径选用背部6点皮下注射，这6点分别为靠近淋巴结的腋下、背部、腹股沟各两侧。

(2) 初次免疫剂量为1.2mg免疫原/只左右，约含半抗原90μg。取1.5mL完全抗原(浓度为2mg/mL)与等体积弗氏完全佐剂充分乳化后进行免疫。考虑到乳化过程中的损失以及免疫前因排除针头内空气的损失，所以完全抗原稍过量。

(3) 加强免疫采用弗氏不完全佐剂，剂量与首次免疫相同。初次免疫3周后进行第一次加强免疫，以后再次加强免疫，时间间隔同样为3周。第二次加强免疫后第10天左右采血，测定血清抗体效价。采用饱和硫酸铵盐析沉淀法纯化抗血清。

获得的检测水样双酚A的酶联免疫试剂盒包括有如下组分：

(1) 包被有双酚A-BSA包被抗原的96孔酶标板；

(2) 双酚A标准品溶液；

 (3) 双酚A特异性抗体；

 (4) 底物显色液；

 (5) 终止液；

 (6) 浓缩洗涤液；

 (7) 酶标二抗溶液 。

三、建立双酚A的ELISA检测方法。

（1）包被抗原和抗体最佳浓度的确定。

取包被抗原羧基化双酚A-OVA（5.65mg/mL），用包被缓冲液稀释1000倍，按照酶标板上A→G的方向进行纵向稀释，每行浓度相同，包被体积为100μL /孔，4℃过夜后洗涤，封闭液封闭。

双酚A抗体从1:2000开始，再作2倍梯度稀释，按照酶标板上1->6的方向进行横向稀释，每一列的稀释度相同，共6个梯度，抗体体积为50μL /孔，接着加入羊抗兔二抗（推荐浓度1:5000），37℃温育30min，洗涤3次，TMB显色10min，1M H₂SO₄终止反应，酶标仪测定其OD450nm。

表1是双酚A方阵试验结果的试验结果，该实验结果表明：包被抗原稀释2000，抗体稀释8000时，对应点正好位于线性区间的中间位置，变化梯度最大，而且吸光值1.315>1.0，适合用于竞争实验。

（2）酶标二抗最佳稀释度的确定。

取羊抗兔二抗（推荐浓度1:5000）。为确定中合适的酶标二抗的稀释度，进行如下实验：用最佳工作浓度的包被抗原包被，封闭后加入最佳稀释度的单抗，反应过程同间接竞争ELISA基本程序。羊抗兔二抗做6个稀释度：1:1000、1:2000、1:4000、1:6000、1:8000、1:10000，每行的稀释度相同，体积均为100μL /孔，后续显色和测定步骤同上。

酶标二抗工作稀释度为1:1000~2000时，实验结果表现为加底物后显色很快不易控制，虽有梯度但本底值明显偏高许多。原因应该是与抗体结合的酶过多，导致催化反应加快，不易控制；同时由于酶浓度过高，非特意性吸附增强，致使本底值明显偏高。

酶标二抗工作稀释度为1: 5000~10000时，实验结果为显色较慢，颜色较浅，阴性孔颜色不高；若放置时间过长，则半抗原浓度较低的孔梯度不明显。主要原因应该是一抗能结合到的酶标二抗不多，使显色过程变长，显色不深。

酶标二抗工作稀释度为1:4000时，实验结果较为理想，本底值较低，同时所得到的最大吸光度能达到1.0以上，故本研究采用酶标二抗的工作稀释度为1:4000。

四、利用制成的试剂在实践中对水样双酚A进行检测。

（1）样品预处理。

对于较干净的水样(如饮用水)可直接测定；对于悬浮物含量较高的水样或其它液态样品，预处理如下：取5 mL样品，使用0.45μm超滤膜过滤，或者10000rpm离心20min；对于悬浮物含量很高的样品，建议先采用较粗的纤维素膜过滤，再使用0.45μm膜过滤。若样品中双酚A含量较高(>20.0μg/L)，可用超纯水对样品进行适当稀释后再测定；若样品中双酚A含量较低(<0.2μg/L)，必要时可以采用固相萃取对样品进行适当浓缩再测定。

（2）试剂盒检测。该过程是先向包被有双酚A抗原的酶标板孔中加入标准品或样品溶液，再加入抗双酚A多克隆抗体，孵育后洗涤拍干，加入酶标记二抗，孵育后洗涤拍干，显色、终上，用酶标仪测定吸光度值。具体包括如下步骤：

a. 将试剂盒从冰箱取出，放置室温下，平衡10min。

b. 将浓缩洗涤液用蒸馏水稀释20倍，试剂盒上每孔加入约350μL洗涤液即可注满，请按此计算使用量。

c. 阴性孔和标准品孔分别加入50μL双酚A标准品：0μg/L， 0.1μg/L， 0.5μg/L， 1.0μg/L， 3.0μg/L， 10.0μg/L；样品孔各加入50μL待测样品。

d. 每孔同时各加入50μL抗双酚A抗体和50μL酶标二抗溶液。

e. 在反应环节，轻轻振摇混匀，室温下反应30分钟。

f. 在洗涤环节，甩掉板中液体，每孔加满洗涤液，放置30s后用力甩掉洗涤液，共洗涤4~5次。

g. 在显色环节，每孔加入50μL底物A后，再同时加入50μL底物B溶液，轻轻振摇混匀，室温下显色5~10分钟。

h. 在终止环节，在每个微孔中加入50μL终止液，终止显色反应，此时蓝色将迅速变为黄色。

i. 轻轻摇动微孔板，30分钟内在450nm处测定各孔的吸光度(A450nm)。

（3）分析检测结果。以测定的双酚A标准品的吸光度(A)平均值为纵坐标，以各标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线；将横坐标设置成对数坐标，应用Excel可对标准曲线进行对数拟合，得出方程A = a×lnC + b，得出R²值，计算出各样品孔平均吸光度(A)对应的样品浓度。

在计算过程中，A－吸光度，a－斜率，C－双酚A浓度，b－截距，R2－决定系数，Cs－待测样品双酚A浓度。

在实验中，我们分别测试了双酚A抗体与其它7种类固醇物质的交叉反应性。并对可进行Logistic模型拟合的曲线进行拟合，计算出半抑制浓度，再计算交叉反应率，结果列于表2。表2是 双酚A抗体交叉反应。

类固醇物质	CAS No.	CR (%)
			双酚A	80-05-7	100%
双酚B	77-40-7	10%
			己烯雌酚	6898-97-1	5%
双烯雌酚	13029-44-2	0%
			雌二醇	50-28-2	0%
孕酮	57-83-0	0%
			皮质醇	50-23-7	0%
壬基酚	25154-52-3	0%

结果表明，本发明获得的针对双酚A的多克隆抗体，对双酚B有一定的交叉反应性(10%)，对己烯雌酚有较小的交叉反应性，而对于其它5种类固醇物质没有表现出交叉反应性。从而证明了抗体整体特异性良好，具有检测双酚A的实践应用价值。

Claims (8)

1.一种检测水样双酚A的酶联免疫试剂盒，其特征在于，酶联免疫试剂盒中含有：

 (1) 包被有双酚A-BSA包被抗原的96孔酶标板；

(2) 双酚A标准品溶液；

 (3) 双酚A特异性抗体；

 (4) 底物显色液；

 (5) 终止液；

 (6) 浓缩洗涤液；

 (7) 酶标二抗溶液 。

2.如权利要求1所述的检测水样双酚A的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述酶标板中包被的包被抗原为双酚A半抗原与载体蛋白的偶联物，所述载体蛋白为牛血清白蛋；通过Friedel-Crafts烷基化反应在双酚A上引入羧基，制得能够与载体蛋白偶联的双酚A半抗原，再将其与N-羟基丁二酰亚胺和N,N’-二环己基碳二亚胺混合后反应，与载体蛋白偶联制备双酚A完全抗原。

3.如权利要求1所述的检测水样双酚A的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述的双酚A标准品溶液的浓度分别为0μg/L, 0.1μg/L, 0.5μg/L, 1.0μg/L, 3.0μg/L和 10μg/L。

4.如权利要求1所述的检测水样双酚A的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述双酚A特异性抗体为兔抗双酚A的多克隆抗体，用双酚A半抗原与牛血清蛋白的偶联物作为免疫原通过免疫兔制得。

5.如权利要求l所述的检测水样双酚A的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述的浓缩洗涤液为pH 7.4，含有1%吐温20和0.5%叠氮化钠防腐剂的磷酸盐缓冲液。

6.如权利要求1所述的检测水样双酚A的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述的酶标二抗为羊抗兔IgG。

7.如权利要求1所述的检测水样双酚A的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗的酶为辣根过氧化物酶，底物显色液A液为过氧化氢，底物显色液B液为四甲基联苯胺溶液，终止液为2mol/L的硫酸。

8.一种样品中双酚A含量的检测方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

第一步，样品前处理：对于较干净的水样可直接测定；对于悬浮物含量较高的包括水样在内的液态样品，取样品使用超滤膜过滤，或者离心处理；对于悬浮物含量很高的样品，先采用粗纤维素膜过滤，再使用细纤维素膜膜过滤；若样品中双酚A含量>20.0μg/L，可用超纯水对样品进行适当稀释后再测定；若样品中双酚A含量<0.2μg/L，采用固相萃取对样品进行适当浓缩再测定；

第二步，用上述的酶联免疫试剂盒进行检测：

a. 将试剂盒从冰箱取出，放置室温下平衡；

b. 将浓缩洗涤液用蒸馏水稀释，试剂盒上每孔加入洗涤液即可注满；

c. 阴性孔和标准品孔分别加入双酚A标准品：0μg/L， 0.1μg/L， 0.5μg/L， 1.0μg/L， 3.0μg/L， 10.0μg/L；样品孔各加入待测样品；

d. 每孔同时各加入抗双酚A抗体和酶标二抗溶液；

e. 在反应环节，轻轻振摇混匀，室温下反应；

f. 在洗涤环节，甩掉板中液体，每孔加满洗涤液，放置后用力甩掉洗涤液，共洗涤4~5次；

g. 在显色环节，每孔加入底物A溶液后，再同时加入底物B溶液，轻轻振摇混匀，室温下显色；

h. 在终止环节，在每个微孔中加入终止液，终止显色反应，此时蓝色将迅速变为黄色；

i. 轻轻摇动微孔板测定各孔的吸光度；

(3) 分析检测结果：以测定的双酚A标准品的吸光度平均值为纵坐标，以各标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线；将横坐标设置成对数坐标，对标准曲线进行对数拟合，得出方程A = a×lnC + b，得出R²值，计算出各样品孔平均吸光度(A)对应的样品浓度                                               

，其中，A－吸光度   ，a－斜率  ，C－双酚A浓度  ，b－截距，  R2－决定系数，Cs－待测样品双酚A浓度。

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