CN101413945A - 一种双酚a的酶联免疫检测方法 - Google Patents

Abstract

一种双酚A的酶联免疫检测方法，属于免疫检测技术领域。本发明利用合成的双酚A免疫原免疫得到多克隆抗体，以双酚A为标准品，以双酚酸半抗原与OVA的偶联物作为包被抗原，建立双酚A的间接竞争酶联免疫检测方法。本发明建立了双酚A的间接竞争ELISA方法，为双酚A的残留检测提供了一种快速高效的检测方法，由于采用的是多克隆抗体，费用较低且稳定性和重复性好。灵敏度为0.1ng/ml，线性范围为0～100ng/ml。免疫反应的高特异性和亲和性使ELISA具有极高的选择性和灵敏度。

Description

一种双酚A的酶联免疫检测方法

技术领域

本发明涉及一种烷基酚残留检测方法，更具体的说是对双酚A的一种酶联免疫检测方法，属于免疫检测技术领域。

背景技术

双酚A(Bisphenol A，BPA)是近几年从食品包装材料中新发现的一种“破坏内分泌化学物质(Endocrine Disrupting Chemicals，ECD)”，具有某些雌激素特性。BPA的发现引起了各国对食品及包装材料的广泛关注，已相继有从蔬菜罐头、婴儿用调制液、食品罐等检出BPA的报道。BPA是生产PC树脂及环氧(EP)树脂的主要原料，又用于酚醛树脂、可塑性聚酯、抗氧剂及聚氯乙烯(PVC)稳定剂等。因此，在食品包装材料、容器内壁涂料等方面有着重要的用途。在职业生产和日常生活中，BPA可通过皮肤、呼吸道、消化道等途径进入人体，BPA对皮肤、呼吸道、消化道和角膜均有中等强度刺激性。人类主要通过食用含有BPA材料包装的食物，使用婴儿奶瓶，牙科填充物和密封罐等摄入BPA。双酚A是一种弱雌性激素，对雄性生殖系统有一定的损害，具有内分泌干扰物作用，可能会引起性早熟，对胚胎也会有一定影响。BPA在低剂量时即具有DNA氧化损伤作用。BPA能诱导染色体异常，并能影响宿主的非特异性免疫防御系统。因此其食品包装材料中的残留也越来越引起了国内外的重视。目前，国内外有关双酚A的检测主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、气-质联用法(GC-MS)、液-质联用法(LC-MS)等。现有的这些仪器检测法虽然有灵敏度高、适用范围广等优点，但是样品前处理复杂，所需的仪器昂贵，成本高，检测时间长，因此有必要研究特异性强，灵敏度高，同时价格低廉，快速简便的免疫检测技术。近年来，国内外已经开展了对烷基酚类免疫分析方法的研究。但目前为止，国内尚没有更好的针对双酚结构多残留的免疫检测方法的报道，为此设计合成了以双酚A的类似物双酚酸为半抗原的用于双酚A结构检测的完全抗原。

发明内容

本发明的目的在于提供一种双酚A的酶联免疫检测方法，快速检测双酚A残留的免疫学检测方法，并且有较高的灵敏度和特异性。

本发明的技术方案：一种双酚A的酶联免疫检测方法，利用合成的双酚A免疫原(胥传来、李灼坤、彭池方等：一种双酚A类药物通用人工抗原的合成方法，中国专利200810021104.5)免疫得到多克隆抗体，以双酚酸半抗原与OVA的偶联物作为包被抗原，建立了双酚A残留的间接竞争酶联免疫检测方法。

本发明通过以下步骤实现：

(1)以0.05M的碳酸盐缓冲溶液稀释包被抗原1:5000～1:8000，加入酶标板中，每孔100μL，4℃孵育过夜，然后用含0.1％明胶的上述碳酸盐缓冲液作为封闭液，封闭2h；

(2)将系列浓度梯度的双酚A标准品、及处理好的样品，分别加入到各自的酶标孔中，每孔50μL；将多克隆抗体以抗体稀释液以1:6000～1:9000的比例稀释，然后每孔加入50μL稀释后的多克隆抗体；37℃温育1h后以PBST洗涤液洗涤3～5次；

(3)将辣根过氧化物酶标记的羊抗兔GAR-HRP用抗体稀释液以1:3000～1:5000进行稀释，然后每孔加入100μL，37℃作用1h后以PBST洗涤液洗涤3～5次；

(4)每孔加入显色液100μL，37℃显色15min；加入终止液2M硫酸溶液，每孔100μL；酶标仪450nm测吸光值OD，与所作标准曲线对比算出待测样品的双酚A含量。

配置显色液：

A液：0.933g柠檬酸，3.68g Na₂HPO₄·12H₂O，18μL 30％H₂O₂用超纯水定容至100mL；

B液：60mg3，3^/，5，5^/-四甲基联苯胺(TMB)溶于100mL乙二醇中；

使用前将A液与B液以5:1体积比混合。

更详细的步骤为：

主要溶液配制

1)配制磷酸盐0.01M(PBS)缓冲液：

Na₂HPO₄·12H₂O       3.62g

KH₂PO₄               0.2g

NaCl                 0.2g

KCl                  8.0g

加超纯水稀释至1000mL；

2)配制碳酸盐(CBS)缓冲溶液(0.05M)pH9.6

Na₂CO₃       1.59g

NaHCO₃       2.93g

加超纯水稀释至1000mL；

3)配制PBST溶液：含0.05％Tween-20的PBS溶液。

4)配制封闭液：含0.1％明胶的碳酸盐缓冲液。

5)配制抗体稀释液：含0.1％明胶的PBST溶液。

6)显色液：

A液：0.933g柠檬酸，3.68g Na₂HPO₄·12H₂O，18μL 30％H₂O₂用超纯水定容至100mL；

B液：60mg 3，3^/，5，5^/-四甲基联苯胺(TMB)溶于100mL乙二醇中；

使用前将A液与B液以5:1体积比混合。

7)终止液：2M的H₂SO₄。

间接竞争ELISA实验方法的步骤如下：

预先将双酚A的标准品配制成100μg/mL的甲醇溶液作为工作母液，在4℃保存待用。配制PBST溶液(0.01mol/L，pH7.4，0.15mo l/L NaCl，0.5％Tween-20)，以此为基础配制系列反应液，用以稀释竞争物标准液和抗血清。

a、包被：设定浓度的包被原包被酶联反应板，100μL/孔，4℃过夜。

b、洗涤：PBST洗涤酶标板3次，每次3min，200μL/孔，然后甩干酶标板。

c、封闭：含0.1％明胶的碳酸盐缓冲液，200μL/孔37℃封闭2h。

d、洗涤：同b。

e、竞争：用PBST将双酚A稀释成0.01，0.1，0.5，1，5，10，20ng/mL系列浓度，另设一个PBST空白对照，50μL/孔；然后每孔加入50μL稀释8100倍的多克隆抗体，于37℃温育1h。

f、洗涤：同b。

g、加酶标二抗(羊抗兔HRP-IgG，1:4000)，100μL/孔，37C反应1h。

h、洗涤：同b。

i、显色：加显色液100μL/孔，显色15min。

j、终止：加终止液100μL/孔。

k、测定：用酶标仪检测450nm的吸光值。

本发明的有益效果：本发明建立了双酚A的间接ELISA方法，为双酚A残留检测提供了一种快速高效的检测手段，由于采用的是多克隆抗体，费用较低且稳定性和重复性较好。灵敏度为0.1ng/mL，线性范围为0-100ng/mL，半数抑制量(IC₅₀)为11.8ng/mL。免疫反应的高特异性和高亲和性使ELISA具有极高的选择性和灵敏性，样本前处理过程简单。

附图说明

图1双酚A的标准抑制曲线。

具体实施方案

以下通过实施例进一步说明本发明。

一、仪器：

TGL-40B台式低速离心机，上海安亭科学仪器厂；

KFLOW纯水机，凯佛隆公司；

ZD-9556水平摇床，太仓科教器材厂；

Costar96孔8×12可拆酶标板，上海吉泰生物科技有限公司；

MuLtiska Mks酶标仪，Thermo Labsystems公司；

可调试移液器，Thermo Labsystems公司；

涡旋混合器，上海沪西仪器分析厂。

二、试剂：

辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(GAR-HRP)，康成生物工程公司；

四甲基联苯胺(TMB)，华美生物工程公司；

其他试剂均为分析纯试剂。

三、步骤

1.免疫原和包被原的合成

合成免疫原(双酚酸半抗原与牛血清白蛋白BSA偶联物)和包被原(双酚酸半抗原与卵清蛋白OVA偶联物)用碳二亚胺法偶联，具体步骤如下：

①制备A液：取7.2mg(0.025mmol)半抗原溶于1mL二甲基亚砜(即DMSO)溶液中，充分溶解后分别加入6.7μL(0.029mmol)1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺(即EDC)和3.5mg(0.029mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(即NHS)，室温搅拌反应3h，此液为A液。

②制备B液：称取45mg(0.00068mmol)牛血清白蛋白(或30.6mg卵清蛋白)溶于4mL NaHCO₃(pH7.0，0.1mol/L)溶液中，低温保存。此液为B液。

③在低速搅拌下，将A液逐滴地滴加到B液中，室温下搅拌反应3h，即得到人工抗原混合液。

④将人工抗原混合液移入透析袋中，用6×1L的去离子水透析4-6天。最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原：双酚A-牛血清蛋白(或包被原：双酚A-卵清蛋白)。

2、ELISA反应过程：

抗体效价测定步骤：

1)将包被原用碳酸盐缓冲液作系列稀释，包被96孔酶标板，100μL/孔，于4℃冰箱过夜。次日取出酶标板回至室温，每孔注入200μLPBST溶液，摇床上振荡3min，用力甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，继续洗涤2次。以下洗涤方法相同。

2)充分洗涤后，用封闭缓冲液封闭酶标板，200μL/孔，于37℃温育箱内温育2h后取出烘干待用。

3)将多克隆抗体系列稀释对应加入到酶标板的前7行列，第8行加入阴性血清，100μL/孔，37℃孵育1h后洗涤、拍干。

4)每孔加入100μL，1:4000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG，37℃孵育1h后洗涤、拍干。

5)每孔加入100μL显色液(TMB与底物液比例为1:5)，暗处37℃反应15min，取出后每孔加入100μL终止液(2mol/L的硫酸)，用酶标仪测定吸光值A₄₅₀。

抗体特异性测定步骤：

a、包被：用设定浓度的包被原包被酶联反应板，100μL/孔，4℃过夜。

b、洗涤：用PBST洗涤酶标板三次，每次3min，200μL/孔，然后甩干酶标板。

c、封闭：含0.1％明胶的碳酸盐缓冲液，200μL/孔，37℃封闭2h。

d、洗涤：同b。

e、竞争：用PBST将双酚A母液稀释成0.01，0.05，0.1，1，5，10，50ng/mL系列浓度，另设一个PBST空白对照，50μL/孔。然后每孔加入50μL稀释4000倍的多克隆抗体，于37℃温育1h。

f、洗涤：同b。

g、加酶标二抗(羊抗兔HRP-IgG，1:4000)，100μL/孔，37C反应1h。

h、洗涤：同b。

i、显色：加显色液100μL/孔，显色15min。

j、终止：加终止液100μL/孔。

k、测定：用酶标仪检测450nm的吸光值。

试验结果如下：

1、标准曲线：本实验所获得的抗体检测的线性范围是为0～100ng/mL。

2、灵敏度：灵敏度是所得90％最大吸光值所对应的标准品的浓度，即IC₉₀为0.1ng/mL。

Claims (1)

1、一种双酚A的酶联免疫检测方法，其特征在于利用合成的双酚A免疫原免疫得到多克隆抗体，以双酚A为标准品，以双酚酸半抗原与OVA的偶联物作为包被抗原，建立双酚A的间接竞争酶联免疫检测方法；步骤如下：

(1)以0.05M的碳酸盐缓冲溶液稀释包被抗原1:5000～1:8000，加入酶标板中，每孔100μL，4℃孵育过夜，然后用含0.1％明胶的上述碳酸盐缓冲液作为封闭液，封闭2h；

(2)将系列浓度梯度的双酚A标准品、及处理好的样品，分别加入到各自的酶标孔中，每孔50μL；将多克隆抗体以抗体稀释液以1:6000～1:9000的比例稀释，然后每孔加入50μL稀释后的多克隆抗体；37℃温育1h后以PBST洗涤液洗涤3～5次；

(3)将辣根过氧化物酶标记的羊抗兔GAR-HRP用抗体稀释液以1:3000～1:5000进行稀释，然后每孔加入100μL，37℃作用1h后以PBST洗涤液洗涤3～5次；

(4)每孔加入显色液100μL，37℃显色15min；加入终止液2M硫酸溶液，每孔100μL；酶标仪450nm测吸光值OD，与所作标准曲线对比算出待测样品的双酚A含量。

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