CN101413944B - 一种全氟辛酸的酶联免疫检测方法 - Google Patents

Abstract

一种全氟辛酸的酶联免疫检测方法，属于免疫检测技术领域。本发明利用合成的全氟辛酸-BSA偶联物免疫原免疫得到多克隆抗体，以全氟辛酸为标准品，以全氟辛酸半抗原与OVA的偶联物作为包被抗原，建立了全氟辛酸的间接竞争酶联免疫分析方法。本发明建立了全氟辛酸的间接竞争ELISA方法，为全氟辛酸的残留检测提供了一种快速高效的检测方法，由于采用的是多克隆抗体，费用较低且稳定性和重复性好，灵敏度为0.1ng/mL，线性范围为0～100ng/mL，免疫反应的高特异性和亲和性使ELISA具有极高的选择性和灵敏度。

Description

一种全氟辛酸的酶联免疫检测方法

技术领域

本发明涉及一种全氟辛酸类物质残留检测方法，更具体的说是对全氟辛酸的一种酶联免疫检测方法，属于免疫检测技术领域。

背景技术

全氟辛酸及其盐(PFOA)是一种常用的氟表面活性剂，具有很强的疏水性和疏油性，其化学结构远较其它表面活性剂稳定。由于它优异的耐热、耐低温、自润滑性及化学稳定性等，被应用在航天、电子、化学和消防领域，并被用在生活部门如不粘锅具、防水透气材料(如防水衣物)、皮革、汽车部件及微波炉爆玉米花袋等。PFOA难以降解，在环境中具有积累性和持久性，但其对人及环境的影响至今还没得出明确的结论。PFOA可通过摄取、吸入、皮肤接触而被吸收，从而诱发癌症、肝肿大等疾病。一些动物实验表明，PFOA能够扰乱脂肪酸的新陈代谢，影响生殖系统，可能与乳腺、睾丸、胰和肝肿瘤有关。PFOA的生物毒性作用还包括对免疫系统产生抑制作用，干扰线粒体代谢，导致肝细胞损伤，疾病感染致死等。由于其疏水疏油的特点，PFOA全氟有机物被生物摄取后一般不在脂肪组织中积累，其大部分与血浆蛋白结合存在于血液中，其余一部分则蓄积在动物的肝脏组织和肌肉组织中。由于它的这种分布特点以及没有很好的检测方法，使得PFOA的污染问题很长时间没有受到科学家的重视。全氟表面活性剂的研究在国际上已然成为环境科学和毒理学研究的热点，国内研究还尚属起步阶段。现有的仪器检测法样品前处理复杂，所需的仪器昂贵，成本高，检测时间长，很难实现对PFOA进行快速、准确的检测，有必要研究针对PFOA的快速、便携的免疫检测技术。这就需要合成能产生簇特异性抗体的免疫原。目前为止，国内外尚没有针对全氟辛酸PFOA的免疫检测方法的报道，为了弥补这一空白，设计合成了直接以全氟辛酸(Perfluorooctanoic acid)为半抗原的用于全氟有机物检测的完全抗原。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速检测全氟辛酸残留的免疫学检测方法，并且有较高的灵敏度和特异性。

本发明的技术方案：一种全氟辛酸的酶联免疫检测方法，利用合成的全氟辛酸免疫原(胥传来、李灼坤、彭池方等：一种全氟辛酸类药物通用人工抗原的合成方法，中国专利申请号200810021105.X)免疫得到多克隆抗体，以全氟辛酸为标准品，以全氟辛酸半抗原与OVA的偶联物作为包被抗原，建立全氟辛酸的间接竞争酶联免疫检测方法；步骤如下：

(1)以0.05M的碳酸盐缓冲溶液稀释包被抗原1:5000～1:8000，加入酶标板中，每孔100μL，4℃孵育过夜，然后用含0.1％明胶的上述碳酸盐缓冲液作为封闭液，封闭2h；

(2)用PBS将全氟辛酸标准品稀释成0.01，0.1，0.5，1，5，10，20ng/mL系列浓度，及处理好的样品，分别加入到各自的酶标孔中，加50μL/孔；将多克隆抗体以抗体稀释液梯度稀释，然后每孔加入50μL稀释好的多克隆抗体，于37℃温育1h，然后以PBST洗涤液洗涤3～5次；

(3)将辣根过氧化物酶标记的羊抗兔GAR-HRP用抗体稀释液以1:3000～1:5000进行稀释，然后每孔加入100μL，37℃作用1h后以PBST洗涤液洗涤3～5次；

(4)每孔加入显色液100μL，37℃显色15min；加入终止液2M硫酸溶液，每孔100μL；酶标仪450nm测吸光值A₄₅₀，与所作标准曲线对比算出待测样品的全氟辛酸含量。

配置显色液：

A液：0.933g柠檬酸，3.68g Na₂HPO₄·12H₂O，18μL30％H₂O₂用超纯水定容至100mL；

B：60mg3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)溶于100mL乙二醇中；

使用前将A液与B液以5:1体积比混合。

更详细的步骤为：

主要溶液配制

1)配制磷酸盐0.01M(PBS)缓冲液：

Na₂HPO₄.12H2O        3.62g

KH₂PO₄               0.2g

NaCl                 0.2g

KCl                  8.0g

加超纯水稀释至1000mL；

2)配制碳酸盐(CBS)缓冲溶液(0.05M)pH9.6

Na₂CO₃              1.59g

NaHCO₃              2.93g

加超纯水稀释至1000mL；

3)配制PBST溶液：含0.05％Tween-20的PBS溶液。

4)配制封闭液：含0.1％明胶的碳酸盐缓冲液

5)配制抗体稀释液：含0.1％明胶的PBST溶液。

6)显色液：

A液：0.933g柠檬酸，3.68g Na₂HPO₄·12H₂O，18μL30％H₂O₂用超纯水定容至100mL；

B液：60mg3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)溶于100mL乙二醇中；

使用前将A液与B液以5:1体积比混合。

7)终止液：2M的H₂SO₄。

间接竞争ELISA实验方法的步骤如下：

预先将全氟辛酸的标准品配制成100μg/mL的甲醇溶液作为工作母液，在4℃保存待用。配制PBST溶液(0.01mol/L，pH7.4，0.15mol/L NaCl，0.5％Tween-20)，以此为基础配制系列反应液，用以稀释竞争物标准液和多克隆抗体。

a、包被：用设定浓度的包被原包被酶标板，100μL/孔，4℃过夜。

b、洗涤：用PBST洗涤酶标板3次，每次3min，200μL/孔，然后甩干酶标板。

c、封闭：含0.1％明胶的碳酸盐缓冲液，200μL/孔，37℃封闭2h。

d、洗涤：同b。

e、竞争：用PBST将全氟辛酸稀释成0.01，0.1，0.5，1，5，10，20ng/mL系列浓度，另设一个PBST空白对照，50μL/孔。然后每孔加入50μL稀释8100倍的抗血清，于37℃温育1h。

f、洗涤：同b。

g、加酶标二抗(羊抗兔GAR-HRP，1:4000)，100μL/孔，37C反应1h。

h、洗涤：同b。

i、显色：加显色液100μL/孔，显色15min。

j、终止：加终止液100μL/孔。

k、测定：用酶标仪检测450nm的吸光值。

本发明的有益效果：本发明建立了全氟辛酸的间接ELISA方法，为全氟辛酸残留检测提供了一种快速高效的检测手段，由于采用的是多克隆抗体，费用较低且稳定性和重复性较好。灵敏度为0.1ng/mL，线性范围为0-100ng/mL，半数抑制量(IC₅₀)为10.3ng/mL。免疫反应的高特异性和高亲和性使ELISA具有极高的选择性和灵敏性，样本前处理过程简单。

附图说明

图1全氟辛酸的标准抑制曲线。

具体实施方案

以下通过实施例进一步说明本发明。

一、仪器：

TGL-40B台式低速离心机，上海安亭科学仪器厂；

KFLOW纯水机，凯佛隆公司；

ZD-9556水平摇床，太仓科教器材厂；

Costar96孔8×12可拆酶标板，上海吉泰生物科技有限公司；

MuLtiska Mks酶标仪，Thermo Labsystems公司；

可调试移液器，Thermo Labsystems公司；

涡旋混合器，上海沪西仪器分析厂。

二、试剂：

辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(GAR-HRP)，康成生物工程公司；

四甲基联苯胺(TMB)，华美生物工程公司；

其他试剂均为分析纯试剂。

三、步骤

1.免疫原和包被原的合成

合成免疫原(全氟辛酸半抗原与牛血清白蛋白BSA偶联物)和包被原(全氟辛酸半抗原和卵清蛋白OVA偶联物)，用碳二亚胺法偶联，具体步骤如下：

①称取2mg(0.00483mmol)全氟辛酸、8mg(0.000121mmol)牛血清蛋白BSA(或5.5mg卵清蛋白)溶于1mL0.1mol/L的PBS缓冲液，逐滴加入现配的水溶性碳二亚胺EDC的甲醇溶液，室温轻柔搅拌3小时，即得到人工抗原混合液。

②将人工抗原混合液移入透析袋中，用6×1L的去离子水透析4-6天。最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原：全氟辛酸-牛血清蛋白(或包被原全氟辛酸-卵清蛋白)。

2、ELISA反应过程：

抗体效价测定步骤：

1)将包被原用碳酸盐缓冲液作系列稀释包被96孔酶标板，100μL/孔，于4℃冰箱过夜。次日取出酶标板回至室温，每孔注入200μLPBST溶液，摇床上振荡3min，用力甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，继续洗涤2次。以下洗涤方法相同。

2)充分洗涤后，用封闭缓冲液封闭酶标板，200μL/孔，于37℃温育箱内温育2h后取出烘干待用。

3)将阳性血清系列稀释对应加入到酶标板的前7行列，第8行加入阴性血清，100μL/孔，37℃孵育1h后洗涤、拍干。

4)每孔加入100μL，1:4000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG，37℃孵育1h后洗涤、拍干。

5)每孔加入100μL显色液(TMB与底物液比例为1:5)，暗处37℃反应15min，取出后每孔加入100μL终止液(2mol/L的硫酸)，用酶标仪测定吸光值A₄₅₀。

抗体特异性测定步骤：

a、包被：用设定浓度的包被原包被酶联反应板，100μL/孔，4℃过夜。

b、洗涤：用PBST洗涤酶标板三次，每次3min，200μL/孔，然后甩干酶标板。

c、封闭：含0.1％明胶的碳酸盐缓冲液，200μL/孔，37℃封闭2h。

d、洗涤：同b。

e、竞争：用PBST将全氟辛酸母液稀释成0.01，0.05，0.1，1，5，10，50ng/mL系列浓度，另设一个PBST空白对照，50μL/孔。然后每孔加入50μL稀释4000倍的多克隆抗体，于37℃温育1h。

f、洗涤：同b。

g、加酶标二抗(羊抗兔GAR-HRP，1:4000)，100μL/孔，37C反应1h。

h、洗涤：同b。

i、显色：加显色液100μL/孔，显色15min。

j、终止：加终止液100μL/孔。

k、测定：用酶标仪检测450nm的吸光值。

试验结果如下：

1、标准曲线：本实验所获得的抗体检测的线性范围是为0～100ng/mL。

2、灵敏度：灵敏度是所得90％最大吸光值所对应的标准品的浓度，即IC₉₀为0.1ng/mL。

Claims (1)

1.一种全氟辛酸的酶联免疫检测方法，其特征在于利用合成的全氟辛酸免疫原免疫得到多克隆抗体，以全氟辛酸为标准品，以全氟辛酸半抗原与OVA的偶联物作为包被抗原，建立全氟辛酸的间接竞争酶联免疫检测方法；步骤如下：

(1)以0.05M的碳酸盐缓冲溶液稀释包被抗原1∶5000～1∶8000，加入酶标板中，每孔100μL，4℃孵育过夜，然后用含0.1％明胶的上述碳酸盐缓冲液作为封闭液，封闭2h；

(2)用PBS将全氟辛酸标准品稀释成0.01，0.1，0.5，1，5，10，20ng/mL系列浓度，将上述稀释后的标准品及处理好的样品，分别加入到各自的酶标孔中，加50μL/孔；将多克隆抗体以抗体稀释液梯度稀释，然后每孔加入50μL稀释好的多克隆抗体，于37℃温育1h，然后以PBST洗涤液洗涤3～5次；

(3)将辣根过氧化物酶标记的羊抗兔GAR-HRP用抗体稀释液以1∶3000～1∶5000进行稀释，然后每孔加入100μL，37℃作用1h后以PBST洗涤液洗涤3～5次；

(4)每孔加入显色液100μL，37℃显色15min；加入终止液2M硫酸溶液，每孔100μL；酶标仪450nm测吸光值A₄₅₀，与根据标准品制备的标准曲线对比算出待测样品的全氟辛酸含量；

所述合成的全氟辛酸免疫原是通过碳二亚胺法将全氟辛酸半抗原与牛血清白蛋白BSA偶联获得的偶联物。

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