CN101398427A - 一种动物源食品中氨基糖苷类抗生素的酶联免疫检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种动物源食品中氨基糖苷类抗生素的酶联免疫检测方法，属于免疫分析领域。本发明利用碳二亚胺法通过四步合成具有氨基糖苷类抗生素多抗原决定簇的免疫原(NM)L－(KM)m－(GM)n－(SM)k－BSA，利用戊二醛法合成氨基糖苷类抗生素包被原，建立动物性食品中氨基糖苷类抗生素的酶联免疫检测方法；采用具有氨基糖苷类簇特异性的多克隆抗体作为检测试剂，以庆大霉素、新霉素、卡那霉素或链霉素为标准品，分别以此四种抗生素与OVA的偶联物为包被原，建立了氨基糖苷类抗生素多残留检测的ELISA方法，为氨基糖苷类抗生素在动物性食品中的多残留检测提供了快速高效的检测手段。本发明具有前处理简单，灵敏度高，精确度高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种定量检测动物源食品中氨基糖苷类抗生素含量的酶联免疫检测方法，属于免疫分析技术领域。
背景技术
氨基糖苷类抗生素(aminoglycoside antibiotics，AGs)是一类应用广泛，主要包括庆大霉素、新霉素、卡那霉素、链霉素等，此类抗生素的基本结构都是氨基环醇和氨基糖缩合而成的苷，由于结构中含有多个氨基和羟基，故呈碱性，极性和水溶性较高。该类抗生素应用广泛，是一种广谱抗生素。其作用特点是能够与核糖体30S亚单位结合，导致其合成异常蛋白，阻碍易合成蛋白的释放，从而抑制细菌的生长。临床上氨基糖苷类抗生素主要用来治疗大肠杆菌引起的肠道感染、细菌性痢疾、皮肤粘膜感染以及眼部感染等。但由于其使用方法不当或不遵守休药期规定超量或非法添加等原因，造成它在畜产品中的残留，给人类健康带来严重危害。现有的微生物检测法和仪器检测法很难实现对氨基糖苷类抗生素进行快速、准确、多残留的检测。目前国内外尚未有理想的针对氨基糖苷类药物多残留免疫检测方法的报道。
酶联免疫检测技术(ELISA)是目前能够满足上述检测要求的用于定量的免疫检测技术，用本实验室所获得的具有簇特异性的抗氨基糖苷类抗生素的多克隆抗体实现对至少三种氨基糖苷类抗生素的多残留检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种定量检测动物源食品中氨基糖苷类抗生素含量的酶联免疫检测方法，在于弥补现有氨基糖苷类免疫多残留技术的空白，满足对该种抗生素进行快速筛选的要求，提供一种快速，高灵敏度，成本低廉的检测动物源食品中氨基糖苷类抗生素的酶联免疫检测方法。
本发明的技术方案：一种动物源食品中氨基糖苷类抗生素的酶联免疫检测方法，利用碳二亚胺法通过四步合成具有氨基糖苷类抗生素多抗原决定簇的免疫原(NM)L-(KM)m-(GM)n-(SM)k-BSA，利用戊二醛法合成氨基糖苷类抗生素包被原，建立动物性食品中氨基糖苷类抗生素的酶联免疫检测方法；步骤如下：
(1)以碳酸盐缓冲液梯度稀释包被抗原，加入酶标板中，每孔100μL，4℃孵育过夜，然后用含0.1％明胶的碳酸盐缓冲液200μL/孔作为封闭液，封闭2h；
(2)用PBS将氨基糖苷类抗生素标准品稀释成0.01、0.1、1、2、10、100ng/mL系列浓度，及处理好的样品，分别加入到各自的酶标孔中，加50μL/孔；将多克隆抗体以抗体稀释液梯度稀释，然后每孔加入50μL稀释好的多克隆抗体，于37℃温育1h，然后以PBST洗涤液洗涤3～5次；
(3)以抗体稀释液将辣根过氧化物酶标记的羊抗兔GAR-HRP以1:4000～1:5000进行稀释，每孔加入100μL，37℃作用1h后以PBST洗涤3～5次；
(4)加入显色液100μL，37℃显色15min；加入终止液2M硫酸溶液，酶标仪450nm测吸光值A450，与所作标准曲线对比算出待测样品的氨基糖苷类抗生素含量。
所述氨基糖苷类抗生素包括庆大霉素、新霉素、卡那霉素或链霉素。
配置显色液：
A液配方为：每100mL水中加入0.933g柠檬酸，3.68g Na2HPO4·12H2O，18μL30％H2O2；
B液配方为：60mg四甲基联苯胺溶于100mL乙二醇；
使用前将A液与B液以5:1体积比混合。
所述的样品的处理：牛奶样品：取10-15mL牛奶样品于50mL离心管中，加入200μL50％的三氯乙酸，混匀，4000rpm离心20min去蛋白，取上清液200μL，用0.01M、pH7.0的PBS稀释50倍，用于ELISA测定。
动物组织样品：2g肌肉、肝脏或肾脏组织匀浆后，置于50mL离心管中，加入3％的三氯乙酸溶液5mL，混匀，4000rpm离心20min，取上清，上清液用NaOH调pH到中性，用蒸馏水稀释10倍，用于ELISA测定。
更详细的步骤为：
1)配制磷酸盐(PBS)缓冲液：
Na2HPO4·12H2O 3.12g
NaH2PO4·2H2O 1.76g
加超纯水稀释至1000mL。
2)配制碳酸盐(CBS)缓冲溶液(0.05M)pH9.6
Na2CO3 1.59g
NaHCO3 2.93g
加超纯水稀释至1000mL。
3)配置PBST溶液：含0.05％ Tween-20的PBS溶液。
4)配制封闭液：含0.1％明胶的CBS缓冲液。
5)配制抗体稀释液：含0.1％明胶的PBST溶液。
6)显色液：
A液：0.933g柠檬酸，3.68g Na2HPO4·12H2O，18μL 30％ H2O2用超纯水定容至100mL；
B液：60mg3，3/，5，5/-四甲基联苯胺(TMB)溶于100mL乙二醇中；
使用前将A液与B液以5:1体积比混合。
7)终止液：2M的H2SO4。
间接竞争ELISA实验方法的步骤如下：
预先将氨基糖苷类标准品配制成1mg/mL的工作母液，在4℃保存待用。配制PBS溶液(0.01mol/L，pH 7.4，0.15mol/L NaCl)，以此为基础配制系列反应液，用以稀释竞争物标准液。
a、包被：用设定浓度的包被原包被酶标板，100μL/孔，4℃过夜。
b、洗涤：用PBST洗涤酶标板三次，每次3min，200μL/孔，甩干酶标板。
c、封闭：含0.1％明胶的CBS，200μL/孔，37℃封闭2h。
d、洗涤：同b。
e、竞争：用PBS将氨基糖苷类抗生素稀释成系列浓度，及处理好的样品，另设一个PBS空白对照，分别加入各自的酶标孔中，50μL/孔。然后每孔加入50μL稀释好的抗血清，于37℃温育1h。
f、洗涤：同b。
g、加酶标二抗(羊抗兔GAR-HRP，1:5000)，100μL/孔，37C反应1h。
h、洗涤：同b。
i、显色：加显色液100μL/孔，显色15-30min。
j、终止：加终止液100μL/孔。
k、测定：用酶标仪检测A450，与所作标准曲线对比算出待测样品的氨基糖苷类抗生素含量。
本发明的有益效果：本发明采用间接竞争酶联免疫技术(ELISA)制备检测氨基糖苷类抗生素的试剂盒，具有前处理简单，灵敏度高，精确度高等优点。且通过使用具有簇特异性的多克隆抗体，实现对氨基糖苷类抗生素的多残留检测。为实现酶联免疫检测技术的多残留检测提供了一种新的思路，从而满足当前对多批量药物的筛选的需要。
附图说明
图1所采用多克隆抗体对庆大霉素的抑制率曲线。
具体实施方式
下面结合具体的实施例来进一步阐明本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。
一种定量检测动物源食品中氨基糖苷类抗生素含量的试剂盒的制备包括以下步骤：
1、制备具有多抗原决定簇氨基糖苷类抗生素的免疫原，详见中国专利，申请号200810123016.6。该专利合成了人工抗原(NM)L-(KM)m-(GM)n-BSA，本发明在此基础上进而合成了免疫原(NM)L-(KM)m-(GM)n-(SM)k-BSA。
(1).偶联物(NM)L-BSA的制备
20-50mg新霉素NM、40mg牛血清蛋白BSA溶于3mL 0.01mol/L的PBS缓冲液，逐滴加入现配的水溶性碳二亚胺EDC的甲醇溶液，室温轻柔搅拌3小时，即得偶联物(NM)L-BSA混合液；
将偶联物(NM)L-BSA混合液放入透析袋于0.01mol/L的PBS中透析3天，每天三次换液，用聚乙二醇20000浓缩至3mL备用；
(2).偶联物(NM)L-(KM)m-BSA的制备
将20-50mg卡那霉素KM加入到(NM)L-BSA的PBS溶液中，逐滴加入现配的水溶性碳二亚胺的甲醇溶液，室温轻柔搅拌3小时，即得偶联物(NM)L-(KM)m-BSA混合液；
将偶联物(NM)L-(KM)m-BSA混合液放入透析袋于0.01mol/L的PBS中透析3天，每天三次换液，用聚乙二醇20000浓缩至3mL备用；
(3).偶联物(NM)L-(KM)m-(GM)n-BSA的制备
将20-50mg庆大霉素GM加入到(NM)L-(KM)m-BSA的PBS溶液中，逐滴加入现配的水溶性碳二亚胺的甲醇溶液，室温轻柔搅拌3小时，即得人工抗原(NM)L-(KM)m-(GM)n-BSA的混合液，然后4℃、在0.01mol/L PBS中透析3天，每天三次换液，用聚乙二醇20000浓缩至3mL备用；
(4).免疫原(NM)L-(KM)m-(GM)n-(SM)k-BSA的制备
将链霉素(SM)50mg加入到(NM)L-(KM)m-(GM)n-BSA的浓缩液中，逐滴加入现配的水溶性碳二亚胺的甲醇溶液(100μLEDC溶于120μL甲醇)，室温轻柔搅拌3小时。即得人工抗原(NM)L-(KM)m-(GM)n-(SM)k-BSA的混合液。
透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用。
将反应液放入透析袋于0.01mol/L的PBS中透析3天，每天三次换液，然后用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。4℃保存备用。
最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到具有氨基糖苷类药物多抗原决定簇的人工抗原。
2、制备抗氨基糖苷类抗生素的簇特异性多克隆抗体
用免疫原(NM)L-(KM)m-(GM)n-(SM)k-BSA免疫获得抗氨基糖苷类抗生素的簇特异性多克隆抗体。
3、制备氨基糖苷类抗生素包被原
15-30mg庆大霉素、30mg卵清蛋白OVA溶于3mL 0.01mol/L的PBS缓冲液，逐滴加入现配的水溶性碳二亚胺EDC的甲醇溶液，室温轻柔搅拌3小时，即得庆大霉素-OVA偶联物混合液；
将庆大霉素-OVA偶联物混合液放入透析袋于0.01mol/L的PBS中透析3天，每天三次换液，即得庆大霉素包被原。
新霉素包被原、卡那霉素包被原或链霉素包被原的合成方法同上述庆大霉素包被原的合成方法。
4、ELISA反应过程：
1)将包被原用碳酸盐缓冲液作系列稀释包被96孔酶标板，100μL/孔，于4℃冰箱过夜。次日取出酶标板回至室温，每孔注入200μL PBST溶液，摇床上振荡3min，用力甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，继续洗涤2次。以下洗涤方法相同。
2)充分洗涤后，用封闭缓冲液封闭酶标板，200μL/孔，于37℃温育箱内温育2h后取出烘干待用。
3)将阳性血清系列稀释对应加入到酶标板的前7行列，第8行加入阴性血清，100μL/孔，37℃孵育1h后洗涤、拍干。
4)每孔加入100μL，1:5000稀释的HRP标记的羊抗兔GAR-HRP，37℃孵育1h后洗涤、拍干。
5)每孔加入100μL显色液(TMB与底物液比例为1:5)，暗处37℃反应15min，取出后每孔加入100μL终止液(2mol/L的硫酸)，用酶标仪测定吸光值A450。
5、样品处理方法：
牛奶样品：取10-15mL牛奶样品于50mL离心管中，加入50％的三氯乙酸200μL，混匀，4000rpm离心20min去蛋白，取上清液200μL，用pH7.0、0.01M的PBS稀释50倍，用于ELISA测定。
动物组织样品：2g组织(肌肉、肝脏或肾脏)匀浆后，置于50mL离心管中，加入3％的三氯乙酸溶液5mL，混匀，4000rpm离心20min，取上清，上清液用NaOH调pH到中性，用蒸馏水稀释10倍，用于ELISA测定。
Claims (3)
1、一种动物源食品中氨基糖苷类抗生素的酶联免疫检测方法，其特征在于：利用碳二亚胺法通过四步合成具有氨基糖苷类抗生素多抗原决定簇的免疫原(NM)L-(KM)m-(GM)n-(SM)k-BSA，利用戊二醛法合成氨基糖苷类抗生素包被原，建立动物性食品中氨基糖苷类抗生素的酶联免疫检测方法；步骤如下：
(1)以碳酸盐缓冲液梯度稀释包被抗原，加入酶标板中，每孔100μL，4℃孵育过夜，然后用含0.1％明胶的碳酸盐缓冲液200μL/孔作为封闭液，封闭2h；
(2)用PBS将氨基糖苷类抗生素标准品稀释成0.01、0.1、1、2、10、100ng/mL系列浓度，及处理好的样品，分别加入到各自的酶标孔中，加50μL/孔；将多克隆抗体以抗体稀释液梯度稀释，然后每孔加入50μL稀释好的多克隆抗体，于37℃温育1h，然后以PBST洗涤液洗涤3～5次；
(3)以抗体稀释液将辣根过氧化物酶标记的羊抗兔GAR-HRP以1:4000～1:5000进行稀释，每孔加入100μL，37℃作用1h后以PBST洗涤3～5次；
(4)加入显色液100μL，37℃显色15min；加入终止液2M硫酸溶液，酶标仪450nm测吸光值A450，与所作标准曲线对比算出待测样品的氨基糖苷类抗生素含量；
所述氨基糖苷类抗生素包括庆大霉素、新霉素、卡那霉素或链霉素。
2、根据权利要求1所述的动物源食品中氨基糖苷类抗生素的酶联免疫检测方法，其特征在于配置显色液：
A液配方为：每100mL水中加入0.933g柠檬酸，3.68g Na2HPO4·12H2O，18μL30％H2O2；
B液配方为：60mg四甲基联苯胺溶于100mL乙二醇；
使用前将A液与B液以5:1体积比混合。
3、根据权利要求1所述的动物源食品中氨基糖苷类抗生素的酶联免疫检测方法，其特征在于所述的样品的处理：牛奶样品：取10-15mL牛奶样品于50mL离心管中，加入50％的三氯乙酸200μL，混匀，4000rpm离心20min去蛋白，取上清液200μL，用0.01M、pH7.0的PBS稀释50倍，用于ELISA测定；
动物组织样品：2g肌肉、肝脏或肾脏组织匀浆后，置于50mL离心管中，加入3％的三氯乙酸溶液5mL，混匀，4000rpm离心20min，取上清，上清液用NaOH调pH到中性，用蒸馏水稀释10倍，用于ELISA测定。
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