CN203178273U

CN203178273U - 赛庚啶elisa检测试剂盒

Info

Publication number: CN203178273U
Application number: CN 201320201814
Authority: CN
Inventors: 冯才伟; 聂雯莹; 吴小胜; 齐向武; 贾芳芳; 张娇娇; 王立志; 张夏; 石洁
Original assignee: Beijing Kwinbon Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing Kwinbon Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2013-04-19
Filing date: 2013-04-19
Publication date: 2013-09-04
Anticipated expiration: 2023-04-19

Abstract

本实用新型涉及一种赛庚啶ELISA检测试剂盒。该试剂盒组成包括：96孔酶标板、酶结合物浓缩液、酶结合物稀释液、7个浓度的标准品溶液、底物液A液、底物液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液。采用竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的赛庚啶将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗赛庚啶的酶标抗体，用底物液显色，利用样本吸光度值计算出样本中赛庚啶的残留量。与仪器分析技术相比具有操作简便、费用低廉、灵敏度高等特点，可在赛庚啶的残留量检测中发挥重要作用。

Description

赛庚啶ELISA检测试剂盒

技术领域

本实用新型涉及一种检测赛庚啶的试剂盒，特别是检测赛庚啶的酶联免疫（ELISA）检测试剂盒。

背景技术

赛庚啶（Cyproheptadine，分子式：C₂₁H₂₁N），又称二苯环庚啶，是一种抗组胺药，具有抗5-HT、阻断H₁受体及抗胆碱作用，主要用于治疗荨麻疹、湿疹、接触性皮炎、皮肤瘙痒、过敏性鼻炎等过敏性疾病，也可用于改善患者的食欲。

赛庚啶是一种人用处方药，但目前在国内某些饲料产品中发现添加，分析原因可能是通过促进动物食欲以达到增重的目的。食用含有赛庚啶残留的动物源性产品，对人体健康具有一定的危害性，对儿童的作用更为明显，高浓度可直接引发昏迷、呼吸急促、全身无力等中毒症状，严重者则直接导致儿童死亡。因此，根据欧盟指令2001/82的要求，赛庚啶禁止作为兽药在动物中使用；我国农业部也于2010年12月27日发布1519号公告，禁止在饲料和动物饮水中使用赛庚啶。

目前对赛庚啶的研究主要集中在医药领域，仅有饲料中赛庚啶的检测标准方法，而动物尿液和动物组织中残留的相应检测方法研究报道较少，且多为仪器检测，存在复杂、繁琐、检测通量小、需要专业人员和专业技能、检测成本昂贵等缺陷，不能实现大批量样品的快速检测分析，限制了其应用。与之相比，酶联免疫方法具有特异性好、灵敏度高、操作简便、检测成本低、适合于批量样品的筛选检测等优点，而且所需设备少，操作简单易学，成本低廉，能够更好地满足我国食品企业、政府职能监管部门等开展检测工作。

实用新型内容

本实用新型所要解决的问题是提供一种小巧轻便的赛庚啶残留检测试剂盒，其操作简便，检测快速、准确、灵敏度高，成本低，稳定性好，需要的技术含量不高，可进行一次连续多个样品中赛庚啶残留量的测定，减少了检测样本所需要的时间。

本实用新型的技术方案是：一种赛庚啶ELISA检测试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的聚苯乙烯酶标板、一张盖板膜、14瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋，其特征在于：酶标板是采用96孔的聚苯乙烯试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被赛庚啶偶联抗原制成的检测板，14瓶试剂分别为7瓶标准品溶液、酶结合物浓缩液、酶结合物稀释液、底物液A液、底物液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液，下凹瓶位共15个。

酶标板由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装的酶标反应微孔条有8个反应孔，放入真空铝箔袋中，盒体为硬纸盒，下凹瓶位由塑料泡沫制成，以塑料硬膜为盖板膜，盖板膜大小与酶标板横切面大小一致，将14瓶试剂用不同大小、不同颜色的试剂瓶盛装并固定在下凹瓶位中，与酶标板、盖板膜、自封袋一同封装在硬纸盒内，以便于携带和运输。14瓶试剂分别为7瓶1mL梯度浓度的标准品溶液、1mL酶结合物浓缩液、10mL酶结合物稀释液、7mL底物液A液、7mL底物液B液、7mL终止液、40mL浓缩洗涤液、50mL浓缩复溶液。每一个试剂盒中的试剂足够进行96次测定（包括标准分析孔），既可进行一次连续多个样品的检测，也可以将板孔拆开多次检测。将剩下的放回铝箔袋中用自封袋密封，这样可以保证试剂盒检测结果的准确性。检测时，样本中的残留物（赛庚啶）将和酶标板微孔条上预包被的赛庚啶偶联抗原竞争抗赛庚啶的酶标抗体，用底物液显色，样本吸光度值与所含残留物（赛庚啶）的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中赛庚啶的残留量，其操作简便易行。

经实验表明本试剂盒具有很高的灵敏度：猪尿样本的最低检测限为0.5μg/L，回收率为100%±15%；血清、猪肉、牛肉、猪肝样本的最低检测限为0.3μg/L(kg)，回收率为100%±20%。相对于其他赛庚啶检测方法，本试剂盒所需仪器较少，只需要酶标仪、均质器、振荡器、离心机、微量加样器等，同类实验室一般均有配备，所需成本较低。

本实用新型的有益效果是：能快速、简便、灵敏、准确地用于赛庚啶残留量的检测。

附图说明

图1为本实用新型酶标板的侧面纵剖面图（长为8.55cm）；

图2为本实用新型酶标板的侧面横剖面图（长为12.8cm）；

图3为本实用新型酶标板的俯视图；

图4为本实用新型盖板膜平面图；

图5为本实用新型试剂瓶纵剖面平面图；

图6为本实用新型固定泡沫模具的俯视图；

图7为本实用新型盒体与固定泡沫模具的侧视图。

具体实施方式

一、赛庚啶ELISA检测试剂盒的组装

参见附图：酶标反应微孔条（2）预包被赛庚啶偶联抗原（3）固定于酶标板的外框支撑架（1）上，酶标反应微孔条（2）可随要求拆卸；盖板膜（4）用于酶标板置水浴或恒温箱内反应时封盖酶标反应微孔条（2），盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；透明帽的半透明PE塑料试剂瓶（5）用于封装40mL浓缩洗涤液；蓝色帽的半透明PE塑料试剂瓶（5）用于封装50mL浓缩复溶液；白色帽的白色PE塑料试剂瓶（6）用于封装7mL底物液A液，红色帽的黑色PE塑料试剂瓶（6）用于封装7mL底物液B液，黄色帽的白色PE塑料试剂瓶（6）用于封装7mL终止液，红色帽的白色PE塑料试剂瓶（7）用于封装1mL酶结合物浓缩液，绿色帽的白色PE塑料试剂瓶（7）用于封装10mL酶结合物稀释液，黑色帽的棕色玻璃瓶（8）用于封装1mL/瓶的标准品溶液；泡沫塑料模具（10）有15个下凹瓶位，放置位置依次为：40mL浓缩洗涤液瓶位（18），50mL浓缩复溶液瓶位（11），7mL底物液A液瓶位（14），7mL底物液B液瓶位（13），7mL终止液瓶位（12），1mL酶结合物浓缩液瓶位（16），10mL酶结合物稀释液位（15），7个1mL/瓶各种浓度的标准品溶液瓶位（17），盒体（9）是硬纸盒。

二、样本的前处理

1、猪尿样本

取50μL清亮尿样直接测定（如尿样浑浊必须通过过滤或3000g以上，室温（20~25℃）离心10min直至清亮），暂不使用的样本应冷冻保存（稀释倍数：1倍）。

2、血清、猪肉、牛肉、猪肝样本

称取2.0g±0.05g均质后的组织、肝脏样本/吸取2.0mL血清样本至50mL聚苯乙烯离心管中；分别加入0.3mL 2mol/L硫酸溶液和3.7mL乙腈，用振荡器振荡5min，混匀，3000g以上，室温（20~25℃）离心5min；移取2mL上层有机相至50mL聚苯乙烯离心管中，加入0.2mL 2mol/L氢氧化钠溶液，轻轻振荡20s，再分别加入2mL三氯甲烷、4mL正己烷，用振荡器振荡5min，混匀，3000g以上，室温（20~25℃）离心5min；移取2mL上层有机相至10mL干净玻璃试管中，于50~60℃水浴氮气流下吹干；加入1mL复溶液，用涡旋仪涡动30s，取50μL用于分析（稀释倍数：6倍）。

三、试剂盒的操作步骤

1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20~25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放回自封袋，封口，保存于2~8℃。

3、浓缩洗涤液和浓缩复溶液在使用前也需回温。

4、编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

5、酶结合物工作液配制：根据需要量将酶结合物浓缩液用酶结合物稀释液按照1:10的体积进行稀释（即1份酶结合物浓缩液加入10份酶结合物稀释液）。注：配制好的酶结合物工作液不可保存。

6、加标准品/样本和酶结合物工作液：加标准品/样本50μL到对应的微孔中，然后加入酶结合物工作液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应40min。

7、洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入去离子水250μL/孔，充分洗涤4~5次，每次间隔10s，泼掉板孔内洗涤液，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破）。

8、显色：加入底物液A液50μL/孔，再加入底物液B液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境反应15min。

9、测定：加入终止液50μL /孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，请在5min内读完数据），测定每孔OD值（若无酶标仪，则不加终止液用目测法可进行判定）。

四、结果判定

结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与其所含赛庚啶的含量成负相关。

1、用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围（μg/L）。假设样本1的吸光度值为0.351，样本2的吸光度值为0.801，标准液吸光度值分别是：0μg/L为1.864；0.05μg/L为1.509；0.15μg/L为1.051；0.45μg/L为0.591；1.35μg/L为0.297；4.05μg/L为0.137。则样本1的浓度范围是0.45~1.35μg/L再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中赛庚啶残留的浓度范围；样本2的浓度范围是0.15~0.45μg/L再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中赛庚啶残留的浓度范围。

2、定量分析

（1）百分吸光率的计算：标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即：

B——标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B₀——0μg/L标准溶液的平均吸光度值

（2）标准曲线的绘制与计算

以标准品百分吸光率为纵坐标，赛庚啶标准品浓度（μg/L）的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中赛庚啶的实际浓度。

五、试剂盒中用到的材料制备方法

1、赛庚啶半抗原的制备

（1）称取0.55g去甲基赛庚啶和1mL吡啶溶于10mL二甲基亚砜（DMSO）中；

（2）称取0.39g溴乙酸叔丁酯溶于5mL DMSO后40℃下缓慢滴加入步骤（1）所述溶液中，继续反应4小时后蒸除溶剂，通过柱层析分离获得赛庚啶半抗原中间体；

（3）在步骤（2）制备得到的赛庚啶半抗原中间体中加入20mL DMSO和5mL甲酸，室温反应20小时后蒸除溶剂，乙醇-水体系中重结晶得到目标半抗原，经氢谱实验鉴定，结构正确。

2、赛庚啶人工抗原的制备

免疫原的制备——赛庚啶与牛血清白蛋白（BSA）的偶联：

（1）称取20mg的赛庚啶半抗原溶于1mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中；

（2）取30mg碳化二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）用0.2mL水充分溶解后加入到半抗原溶液中，室温下搅拌反应24小时；

（3）称取50mg BSA溶于3.8mL CB（pH 9.6）溶液中，将步骤（2）反应后的溶液逐滴缓慢加入到BSA-CB溶液中，并于室温下搅拌反应24小时；

（4）将经步骤（3）反应后的溶液装于透析袋，在4℃用0.01mol/L的PBS溶液透析72小时，期间每天换透析液3次，即得到目的产物，分装后-20℃保存。

包被原的制备——赛庚啶与卵清蛋白（OVA）的偶联：

制备方法同包被原，只是将BSA换成同质量的OVA。

人工抗原的鉴定：

取赛庚啶半抗原、载体蛋白和赛庚啶抗原分别进行紫外（200nm-400nm）扫描，通过比较三者的最高吸光值鉴定半抗原与载体蛋白是否发生偶联。结果发现，赛庚啶抗原的吸光值与赛庚啶半抗原和载体蛋白明显不同，说明半抗原已经与载体蛋白成功偶联制得赛庚啶抗原。经计算，赛庚啶半抗原与BSA的结合摩尔比为21:1，与OVA的结合摩尔比为13:1。

3、赛庚啶酶标抗体的制备

（1）单克隆抗体的制备

动物免疫：将免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。

细胞融合和克隆化：取产生特异性抗体的Balb/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP20融合，采用间接竞争酶联免疫分析方法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，得到并建立产单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

细胞冻存和复苏：取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

单克隆抗体的制备与纯化：采用体内诱生法，将Balb/c小鼠（8周龄）腹腔注入灭菌石蜡油，7~14天后腹腔注射杂交瘤细胞，7~10天后采集腹水。经辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，纯度经SDS-PAGE电泳鉴定，小瓶分装，-20℃保存。

（2）酶标抗体的制备

将上述单克隆抗体与辣根过氧化物酶（HRP）采用过碘酸钠法进行偶联制备获得酶标抗体。

4、酶标板的制备

用包被缓冲液将包被原稀释至0.2μg/mL，包被96孔聚苯乙烯酶标板，每孔100μL，37℃温育2h，倾去包被液，用洗涤液洗涤3次，每次30s，拍干，然后在每孔加入200μL封闭液，37℃温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。

包被缓冲液：pH9.6、0.05mol/L的碳酸钠缓冲液；

封闭液：每1L封闭液按照如下方法配制：将5mL马血清、1g叠氮化钠、30g酪蛋白混合，用磷酸盐缓冲液溶解并定容至1000mL；其中，磷酸盐缓冲液的浓度为0.02mol/L，pH值为7.2。

Claims

1.一种赛庚啶ELISA检测试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、14瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋，其特征在于：酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被赛庚啶偶联抗原制成的检测板，14瓶试剂分别为7瓶标准品溶液、酶结合物浓缩液、酶结合物稀释液、底物液A液、底物液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液，下凹瓶位共15个。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：盒体是硬纸盒；96孔的聚苯乙烯酶标板，放于真空铝箔袋内；盖板膜是塑料硬膜；标准品溶液用黑色帽的棕色玻璃瓶，酶结合物浓缩液用红色帽的白色PE塑料瓶，酶结合物稀释液用绿色帽的白色PE塑料瓶，底物液A液用白色帽的白色PE塑料瓶，底物液B液用红色帽的黑色PE塑料瓶，终止液用黄色帽的白色PE塑料瓶，浓缩洗涤液用透明帽的半透明PE塑料瓶，浓缩复溶液用蓝色帽的半透明PE塑料瓶，下凹瓶位由塑料泡沫制成。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：酶标板是由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔；盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；标准品溶液7瓶，1ml/瓶；酶结合物浓缩液1瓶，1ml；酶结合物稀释液1瓶，10ml；底物液A液1瓶，7ml；底物液B液1瓶，7ml；终止液1瓶，7ml；浓缩洗涤液1瓶，40ml；浓缩复溶液1瓶，50ml。