CN101788560A - 检测残留的氯霉素的酶联免疫试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测残留的氯霉素(CAP)的酶联免疫试剂盒及其检测方法。该试剂盒包括包被有CAP抗体的微孔板(1)、CAP标准品(2)、浓缩洗涤液(3)、浓缩酶标CAP(4)、酶标稀释液(5)、底物液(6)和终止液(7)。本发明的检测方法采用直接竞争法，使CAP标准品或待测样品与酶标CAP竞争微孔板上的CAP抗体，没有与CAP抗体结合的酶标CAP在洗涤步骤中被去除，被抗体结合的酶标CAP将无色的发色剂转化为蓝色产物，最后通过测试吸光度，得到吸光度比值，并与标准曲线比对，即可获得残留的氯霉素含量。本发明方法可以直接检测动物源食品、尿液和血清样品中的CAP，其操作更简便、快捷，操作时间仅须50分钟，且灵敏度可达0.025μg/kg。

Description

检测残留的氯霉素的酶联免疫试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种检测检测残留的氯霉素的酶联免疫试剂盒及其检测方法，属于酶联免疫(ELISA)和兽药残留检测技术领域。更具体地，本发明涉及用于检测动物源食品、血液及尿液中残留的氯霉素(CAP)的含量的酶联免疫试剂盒以及使用该试剂盒的检测方法。

背景技术

氯霉素(chloramphenicol，CAP)是第一个人工合成的广谱抗生素，因其具有很好的抗菌效果，价格低廉，曾广泛应用于畜牧业生产，成为畜禽疾病防治的重要药物。但近年来，人们逐渐认识到氯霉素能引起人的再生障碍性贫血、粒状白细胞缺少症以及新生儿、早产儿灰色中合症等，对人类健康构成巨大的潜在威胁。因此，欧盟、美国以及我国等许多国家已相继禁止氯霉素用于动物源食品，并明确规定氯霉素残留限量为不得检出。

现在国内外的氯霉素检测技术主要有微生物法、气相色谱法(GC)、液相色谱法(HPLC)、质谱分析等。微生物法灵敏度偏低；仪器分析方法设备昂贵，且样品前处理要求高。而酶联免疫吸附法(ELISA)特异性强、灵敏度高，样品前处理简单，检测时间短、适合大量样本的初步筛查。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于检测动物源食品、血液及尿液中残留的氯霉素(CAP)的含量的酶联免疫试剂盒。进一步地，本发明提供一种高效、准确、快速且操作简单地检测动物源食品、血液及尿液中残留的氯霉素(CAP)的含量的方法。

为了解决上述技术问题，本发明的发明人通过深入研究和大量实验，提供以下技术方案：

1.一种检测残留的氯霉素的酶联免疫试剂盒，包括微孔板(1)、氯霉素标准样品(2)、浓缩洗涤液(3)、浓缩酶标氯霉素(4)、酶标稀释液(5)、底物液(6)和终止液(7)，

其中所述微孔板(1)是包被有兔抗氯霉素IgG的微孔板，即用0.05mol/L的pH值为9.6的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液将兔抗氯霉素IgG稀释至0.1μg/mL，按每孔100μL的量添加到所述微孔板中，在4℃下放置过夜，弃去包被液，用洗涤液洗板3次，真空抽干，将该微孔板密封后置-20℃下保存；

所述浓缩酶标氯霉素(4)是10～100倍浓缩酶标氯霉素，其用碳二亚胺法将琥珀酸钠氯霉素(CAP)连接到卵清白蛋白(OVA)上制备CAP-OVA，然后用高碘酸钠法将辣根过氧化物酶(HRP)标记到CAP-OVA上制备成CAP酶标物(CAP-OVA-HRP)，用酶联免疫吸附试验测定CAP-OVA-HRP原液的工作浓度，将CAP-OVA-HRP原液用含10％小牛血清(体积比)的PBS稀释至工作浓度(浓度在0.1μg/mL～1μg/mL之间)的10～100倍，该酶标CAP溶液即为10～100倍浓缩酶标氯霉素。

2.根据上述第1项所述的检测残留的氯霉素的酶联免疫试剂盒，其中所述氯霉素标准品(2)的浓度分别为0μg/kg、0.03μg/kg、0.09μg/kg、0.27μg/kg、0.81μg/kg和2.43μg/kg。

3.根据上述1项所述的检测残留的氯霉素的酶联免疫试剂盒，其中所述浓缩洗涤液(3)是5～10倍浓缩洗涤液；

所述酶标稀释液(5)由小牛血清和洗涤液按体积比1∶9组成；

所述底物液(6)包含5.37g/L的一水柠檬酸(C₆H₈O₇·H₂O)、19.38g/L的Na₂HPO₄·12H₂O、50mg/L的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)、25mg/L的过氧化氢脲和5％(体积比)的N，N-二甲基甲酰胺；

所述终止液(7)是0.5mol/L的盐酸。

4.根据上述第3项所述的检测残留的氯霉素的酶联免疫试剂盒，其中，所述浓缩洗涤液(3)是10倍浓缩洗涤液，其包含80g/L的NaCl、2g/L的KCl、29g/L的Na₂HPO₄.12H₂O、2g/L的KH₂PO₄和5ml/L的吐温-20；所述浓缩酶标氯霉素(4)是20倍浓缩酶标氯霉素。

5.一种用上述第1项所述的试剂盒检测残留的氯霉素的酶联免疫方法，所述方法是基于抗原抗体反应进行竞争性抑制测定，其包括以下步骤：

(I)待测样品的预处理，即将待测试的样品处理为体液样品，或者用有机溶剂提取待测样品、蒸干并且将其复溶于PBS制得溶液样品；

(II)取包被有兔抗氯霉素IgG的微孔板，加入100μL氯霉素标准品和处理后的样品到对应微孔中；

(III)加入50μL用酶标稀释液将所述的浓缩酶标氯霉素稀释至工作浓度的酶标氯霉素，振荡混匀后于37℃下避光静置孵育30分钟，用洗涤液洗涤3次，在吸水纸上拍干；

(IV)加入100μL底物液，于室温下避光静置10分钟，加入100μL反应终止液到微孔中，混合均匀后尽快在450nm或双波长450nm/630nm处测量吸光度值；以及

(V)以标准品测试的结果绘制标准曲线，对照标准曲线计算测试样品中的氯霉素的含量。

6.根据上述第5项所述的检测残留的氯霉素的酶联免疫方法，其中，所述酶标氯霉素的制备过程分两步：先用碳二亚胺法将琥珀酸钠氯霉素(CAP)连接到卵清白蛋白(OVA)上制备CAP-OVA，然后用高碘酸钠法将辣根过氧化物酶(HRP)标记到CAP-OVA上制备成CAP酶标物(CAP-OVA-HRP)；

7.根据上述第5项所述的检测残留的氯霉素的酶联免疫方法，其中，所述处理后的样品是经过以下处理的样品：

1)取尿液样品置离心机中，用12000g的离心力离心2分钟，取上清，用0.15mol/L的pH值为7.4的PBS稀释1倍；

2)取血清样品置离心机中，用12000g的离心力离心2分钟，取上清，用0.15mol/L pH值7.4的PBS稀释1倍；

3)取3.0克已均质后的猪肉样品于离心管中，加入6mL乙酸乙酯，漩涡混合1分钟，然后离心(3000rpm)10分钟，取2mL上层液(乙酸乙酯)，在50℃下氮气吹干，再加入正己烷1mL，待残余物完全溶解后，再加入1mL的含0.05％的吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBST)，漩涡混合30秒钟。离心(3000rpm)10分钟，吸去包含中间乳化层部分的上层液(正己烷)，吸取下层液(水层)作为处理后的样品。

本发明采用所述酶联免疫试剂盒通过直接竞争法来检测残留的CAP。该检测方法的技术主要在两个方面：1)酶标记CAP，采用CAP-OVA-HRP作为CAP酶标记物能提高检测灵敏度。其原理是：小分子物质CAP先与载体蛋白(卵清蛋白(OVA)、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、匙孔戚血蓝蛋白(KLH)或其他用作载体的蛋白)连接，然后通过载体蛋白与辣根过氧化物酶(HRP)连接。由于载体蛋白是具有较大分子量的蛋白质，与HRP有多个结合位点，这样每分子CAP结合的HRP分子就可以超过1个，而没有载体的介入时每分子CAP最多只能结合1个HRP分子。由于每分子CAP结合的HRP变多，每分子CAP上的酶反应信号放大，从而使检测灵敏度提高，检测限得以降低。2)特异性多克隆抗体的制备，利用CAP与HSA偶联制备的抗原免疫家兔，获得含有抗体的血清，经过分离纯化得到IgG。本发明的酶联免疫试剂盒采用高特异性的CAP多克隆抗体，主要试剂以工作液形式提供，可以减少试剂盒的操作步骤，为使用者节省时间，并降低因操作步骤的冗繁造成的误差。此外，本发明具有灵敏度高、特异性强、精确度高、准确度高且对仪器设备要求低，可在动物源性食品中CAP残留量的检测中发挥重要作用。

附图说明

图1是本发明的实施例与对比例的CAP-ELISA标准曲线图。

图2是本发明的CAP-ELISA检测方法与HPLC方法的符合实验图。

具体实施方式

以下采用更具体的实施方式或实施例来描述本发明，但是本发明的保护范围并不打算限制于此处所述的具体实施方式或实施例。

本发明采用所述酶联免疫试剂盒通过直接竞争法来检测CAP，即基于抗原抗体反应进行竞争性抑制测定，使CAP标准品或待测样品与酶标CAP竞争微孔板上的CAP抗体，没有与CAP抗体结合的酶标CAP在洗涤步骤中被去除，被抗体结合的酶标CAP将无色的发色剂转化为蓝色产物，加入反应终止液后使颜色由蓝转变为黄色。在450nm处测量吸光度值，吸光度比值与克仑特罗浓度的自然对数成反比，对照标准曲线计算样品中氯霉素的含量。

根据本发明的优选实施方式，本发明方法首先预处理待测样品，即将待测试的样品处理为液体样品，或者用有机溶剂提取待测样品、蒸干并且将其复溶于PBS。例如将待测样品处理为澄清的尿液、血液或其他体液样品，或者经过有机溶剂提取、蒸干，复溶于PBS而制得的样品。

本发明的试剂盒或检测方法可以检测各种动物源性食品或者动物排泄物，例如肉类、蛋类、乳类制品；动物排泄物、动物饲料；以及其它动物源性食品或物质。

根据本发明的优选实施方式，预处理样品需要配制以下配液：

配液1：称取10.7g的二水亚硝基铁氰化钠加去离子水溶解定容至100mL，即得到0.36M的亚硝基铁氰化钠(Na₂Fe(CN)₅NO·2H₂O)溶液；

配液2：称取28.8g的七水硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)加去离子水溶解定容至100mL，即得到1M的硫酸锌溶液。

各种不同样品的处理方法如下：

(1)生乳

a、稀释法

用0.15mol/L的pH值为7.4的PBS(样品稀释液)将生乳稀释4倍(即取250μL乳品与750μL样品稀释液混合)，漩涡混合1分钟后备用。其中样品的最低检测限为0.1μg/kg，稀释倍数为4倍。

b、萃取法

取乳品4mL于离心管，加入200μL乳品样品处理液(配液1)后漩涡混合5秒钟，再加入200μL乳品样品处理液(配液2)，漩涡混合10秒钟。置于冰上5分钟使其反应完全，离心(3000rpm)10分钟。取2.2mL上清液于离心管中，加入4mL乙酸乙酯后漩涡混合1分钟。再离心(3000rpm)10分钟，取2mL上层液(乙酸乙酯)于50℃下，氮气吹干。加入0.5mL样品稀释液，混合备用。其中，样品的最低检测限为0.05μg/kg，稀释倍数为0.5倍，一般推荐使用该方法。

(2)蜂蜜

取2g蜂蜜于离心管中，加入4mL蒸馏水与4mL乙酸乙酯，漩涡混合30秒。离心(3000rpm)10分钟，取1mL上层液(乙酸乙酯)于50℃下，氮气吹干。加入0.5mL样品稀释液，混合备用。其中，样品的最低检测限为0.1μg/kg，稀释倍数为1倍。

(3)蜂王浆

取2g蜂王浆于离心管中，加入3mL的0.5M的NaOH及8mL乙酸乙酯，漩涡混合30秒。离心(3000rpm)10分钟，取1mL上层液(乙酸乙酯)于50℃下，氮气吹干。加入0.5mL样品稀释液，混合备用。其中样品的最低检测限为0.1μg/kg，稀释倍数为1倍。

(4)鱼虾、鸡肉、猪肉及血清

取3克已均质后的样品于离心管中，加入6mL乙酸乙酯，漩涡混合1分钟。离心(3000rpm)10分钟，取2mL上层液(乙酸乙酯)于50℃下，氮气吹干。再入正己烷1mL，待残余物完全溶解后，再加入1mL样品稀释液，漩涡混合30秒钟。离心(3000rpm)10分钟，吸去包含中间乳化层部分的上层液(正己烷)，吸取下层液(水层)备用。其中，样品的最低检测限为0.025μg/kg，稀释倍数为1倍。

(5)白虾

取6克已均质的样本于15mL离心管中，加入6mL乙酸乙酯，漩涡混合1分钟，离心(3000rpm)10分钟，取4mL上层液(乙酸乙酯)于50℃下，氮气吹干。加入正己烷2mL，待残余物完全溶解后，再加入0.5mL样品稀释液，漩涡混合30秒钟。离心(3000rpm)10分钟，吸去包含中间乳化层部分的上层液(正己烷)，吸取下层液(水层)备用。其中，样品的最低检测限为0.003μg/kg，稀释倍数为0.125倍。该方法可以将样品进行8倍浓缩以增加样品敏感度。

(6)饲料

取2克磨碎后的饲料于离心管中，加入4mL乙酸乙酯，漩涡混合1分钟。离心(3000rpm)10分钟，取1mL上层液(乙酸乙酯)于50℃下，氮气吹干。再入正己烷1mL，待残余物完全溶解后，再加入0.5mL样品稀释液，漩涡混合30秒钟。离心(3000rpm)10分钟，吸去包含中间乳化层部分的上层液(正己烷)，吸取下层液(水层)稀释10倍后(即50μL下层液加450μL样品稀释液)备用。其中，样品的最低检测限为0.25μg/kg，稀释倍数为10倍。

(7)全蛋

取1克全蛋液于离心管中，加入0.5mL的0.5M的HCl，漩涡混合1分钟，再加入4mL乙酸乙酯混匀后，离心(3000rpm)10分钟，取2mL上层液(乙酸乙酯)于50℃下，氮气吹干。再入正己烷1mL，待残余物完全溶解后，再加入0.5mL样品稀释液，漩涡混合30秒钟。离心(3000rpm)10分钟，吸去包含中间乳化层部分的上层液(正己烷)，吸取下层液(水层)稀释10倍后(即50μL下层液加450μL样品稀释液)备用。其中样品的最低检测限为0.025μg/kg，稀释倍数为1倍。

进一步地，用本发明所述的试剂盒检测已经处理后的样品；

取包被有兔抗氯霉素IgG的包被板，加入50μL氯霉素标准品和处理好的样本到对应微孔中，加入100μL用酶标稀释液(5)以1∶20倍稀释的20倍浓缩酶标氯霉素(4)，振荡混匀后于37℃避光静置孵育30分钟，用洗涤液洗涤3次，在吸水纸上拍干，加入100μL底物液，于室温下避光静置10分钟，加入100μL反应终止液到微孔中，混合好后尽快在450nm或双波长450nm/630nm测量吸光度值，对照标准曲线计算样品中氯霉素的含量。

在使用本发明的酶联免疫试剂盒检测残留的氯霉素时，将试剂盒内所有试剂和待测样品，于室温环境下至少回温40分钟，使用前每种试剂均须摇匀。

具体操作步骤如下：

(1)加入100μL标准品(0μg/kg、0.03μg/kg、0.09μg/kg、0.27μg/kg、0.81μg/kg和2.43μg/kg)和已处理好的样品与对应微孔中。

(2)再加入50μL酶标CAP工作液。

(3)振动盘子四周，使其充分混合，于室温避光静置60分钟。(使用稀释法做乳品处理方法时，请轻敲盘子1到2分钟确保充分混合)。

(4)将微孔中反应液甩掉，再将洗涤液250μL加满每个微孔后甩掉，重复洗涤3次。最后一次甩掉后，在吸水纸上拍干。

(5)加入底物液100μL后，轻敲盘子四周，使其充分混合。于室温下避光静置20分钟。

(6)加入反应终止液100μL于每个微孔中。

(7)设定酶标仪波长450nm或双波长450nm/630nm，测试每孔吸光度(OD)值(在5分钟内进行测试)。

最后，分析检测结果：

计算标准品对应的百分比吸光度比值，并绘制与标准品浓度相关的对数坐标系统的曲线图，即以标准品浓度的自然对数值为横坐标，百分比吸光度比值(即其它浓度标准品的吸光度(B)与0μg/kg标准品吸光度(B₀)的比值B/B₀)为纵坐标，做线性回归分析，再将样本百分比吸光度比值代入，计算样本浓度，在乘以样本稀释倍数，为样本中的实际浓度。

另外，计算残留的氯霉素的浓度时，应当注意：

(1)计算出的氯霉素浓度若低于该样品敏感度即可视为该样品背景值，无须回乘稀释倍数。反之若所得的氯霉素浓度若高于该样品敏感度，即可能为氯霉素阳性样品，建议使用再其它检测方法检测，如HPLC等。

(2)阴性生乳的吸光度(OD)值可能会高于标准品0μg/kg的吸光值，但不会影响对氯霉素阳性检体的判定。

本发明的有益效果：该试剂盒结构简单，比常用的间接竞争ELISA试剂盒少一个抗原-抗体反应步骤，整个检测过程仅需50分钟，使用更方便、同时又保证了极高的灵敏度(0.025μg/kg)。

实施例

实施例1：制备CAP-ELISA试剂盒

CAP是小分子半抗原，仅有反应原性，却没有免疫原性，需要与大分子物质结合后才能用于免疫动物制备抗体。琥珀酸钠CAP在酸性环境下带有活性基团羧基，可以采用碳二亚胺法与蛋白质的氨基结合。

CAP-HSA抗原的制备

称取5-10mg琥珀酸钠CAP与2.5-5mg碳二亚胺溶于10mL去离子水中，用0.1mol/L盐酸调节pH至4左右，室温搅拌2小时，加入50-100mg HSA，在4℃冰箱搅拌过夜，用0.15mol/L pH7.4的PBS透析两天，换透析液6次，即得到CAP-HSA结合物。

CAP-OVA的制备

与CAP-HSA抗原的制备方法相同，将HSA换成OVA即可。

兔抗CAP抗体的制备

选取3月龄健康新西兰大白兔，用0.15mol/L的pH值为7.4的PBS将CAP-HSA稀释成浓度为1mg/mL，与等体积弗氏佐剂混合，用涡旋振荡器乳化10分钟得到油包水的抗原乳化剂。兔子首次免疫用弗氏完全佐剂乳化抗原，每只兔子注射含0.5mg的CAP-HSA的抗原乳化剂，注射方式为颈背部皮下多点注射；以后每隔4周加强免疫1次，抗原用弗氏不完全佐剂乳化，共免疫5次。心脏采血分离血清，从血清中分离纯化出IgG，分装后-70℃下保存。

酶标CAP的制备

1)CAP-OVA-HRP的制备：称取5mg的HRP溶解于1mL蒸馏水中，加入0.2mL新配的0.1M的NaIO₄溶液，室温下避光搅拌20分钟。将溶液装入透析袋中，用1mM的pH值为4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。加入5mg的CAP-OVA，调节pH值至9.5，室温避光轻轻搅拌2小时，加0.1mL新配的4mg/mL的NaBH₄液，混匀，4℃静置2小时。在4℃下，用0.15M的pH值为7.4的PBS透析两天，换透析液6次。即得到酶标CAP(CAP-OVA-HRP)。

2)CAP-HRP的制备：称取1mg的琥珀酸钠CAP与0.5mg的碳二亚胺溶于10mL去离子水中，用0.1mol/L的盐酸调节pH至4左右，室温搅拌2小时，调节pH值至7.4，加入50-100mg的HRP，在4℃冰箱搅拌过夜，用0.15mol/L的pH值为7.4的PBS透析两天，换透析液6次，即得到CAP-HRP结合物。

包被微孔板的制备：

用0.05mol/L的pH值为9.6的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液将兔抗CAP抗体IgG稀释至0.1μg/mL作为包被液，按照每孔100μL加到96(或48)孔酶标板中，4℃放置过夜。弃去包被液，用洗涤液洗板3次。真空抽干，置-20℃冷冻保存。

试剂的配制：

(1)氯霉素标准品：共6瓶，氯霉素浓度分别为0μg/kg、0.03μg/kg、0.09μg/kg、0.27μg/kg、0.81μg/kg和2.43μg/kg，用于稀释的稀释液为0.15mol/L的pH值为7.4的PBS。

(2)10倍浓缩洗涤液包含80g/L的NaCl、2g/L的KCl、29g/L的Na₂HPO₄.12H₂O、2g/L的KH₂PO₄和5ml/L的吐温-20。

(3)浓缩酶标氯霉素是20倍浓缩酶标氯霉素，测定酶标CAP的工作浓度，将原倍酶标CAP用含10体积％小牛血清的PBS稀释至工作浓度的20倍，即为20倍浓缩酶标CAP。

(4)酶标稀释液由小牛血清和所述洗涤液按体积比1∶9组成；

(5)底物包含5.37g/L的一水柠檬酸(C₆H₈O₇·H₂O)、19.38g/L的Na₂HPO₄·12H₂O、50mg/L的TMB、25mg/L的过氧化氢脲和5％(体积比)的N，N-二甲基甲酰胺(V/V)；

(6)终止液可以是0.2～0.8mol/L的盐酸，本实施例采用0.5mol/L的盐酸作为终止液。

本发明的酶联试剂盒的一个实例如下，每个试剂盒中的试剂足够进行96个测量，盒中的材料如下：

(1)酶标板：96孔，每条8孔，共12条；

(2)氯霉素标准品：1.5ml×6瓶，其浓度分别为0μg/kg、0.03μg/kg、0.09μg/kg、0.27μg/kg、0.81μg/kg和2.43μg/kg；

(3)10倍浓缩洗涤液：30mL×1瓶；

(4)酶标记物：8mL×1瓶；

(5)10倍浓缩样品稀释液：30mL×1瓶；

(6)底物液：12mL×1瓶；

(7)终止液：13mL×1瓶。

使用本发明的试剂盒进行测试时应当注意：试剂盒应充分回温(室温放置1小时)，否则会导致OD值偏低；加液时间不能过长，否则会影响标准曲线线性；底物液呈现淡蓝色，表明已变质，请勿使用。

标准曲线绘制

用制备好的试剂盒检测0μg/kg、0.03μg/kg、0.09μg/kg、0.27μg/kg、0.81μg/kg和2.43μg/kg等6个浓度的标准品，在450nm处测量吸光度值，用吸光度比值作纵坐标，CAP浓度的自然对数作横坐标绘制标准曲线。用CAP-HRP作酶标CAP的试剂盒作为对比例也绘制标准曲线。实施例和对比例的标准曲线见图1。由图1可知，对比例在测定0.03μg/kg的CAP标准品时抑制率很低，其线性范围在0.09μg/kg-2.43μg/kg之间，实施例在0.03μg/kg-2.43μg/kg之间线性好，R²为0.9945。由此可见，实施例的最低检测限以及检测精度明显高于对比例。

实施例2：添加氯霉素药品

将1mg/mL的CAP母液稀释成适当浓度，添加到HPLC/MS方法鉴定无CAP残留的尿液或蜂蜜中，使其终浓度为0.1μg/kg、0.2μg/kg、0.3μg/kg、1μg/kg、2μg/kg和3μg/kg，每个浓度5个重复，用于添加回收实验。

实施例3：CAP-ELISA试剂盒检测猪尿液样品

取猪尿液1mL，添加CAP标准品至0.3μg/kg，涡旋混匀，样品置离心机中，用12000g的离心力，离心2分钟取上清，用0.15mol/L的pH值为7.4的PBS稀释1倍后直接上样。

取包被有CAP抗体的板条，加入100μL的CAP标准品或处理好的样品到相应的微孔中，标准品和样品必须使用新吸头，每孔加入50μL酶标CAP工作液，吸头尖不能接触微孔中的液面，在实验台面上水平振荡酶标板混匀微孔中的液体，37℃下放置30分钟，洗涤液洗3次，加100μL底物，37℃避光显色10分钟。加入100μL终止液到微孔中。混合好后尽快在450nm或双波长450nm/630nm测量吸光度值，对照实施例标准曲线(图1)计算样品中CAP的含量。猪尿样品中3种不同浓度CAP的添加回收实验结果见表1。

表1.CAP-ELISA试剂盒检测猪尿液样品

添加浓度(μg/kg)	重复1	重复2	重复3	重复4	重复5	平均值	平均回收率(％)	变异系数(％)
									0.10	0.15	0.09	0.08	0.12	0.09	0.11	110±3	27.18
0.20	0.17	0.21	0.18	0.19	0.18	0.19	95±2	8.15
									1.00	0.95	1.07	0.99	0.90	0.98	0.98	98±6	6.36

其中，平均回收率是由“(实际测定值/理论添加值)×100％”计算得到的数值，其可以表现出本发明方法的准确度；变异系数是表示五次重复实验的重复性。

实施例4：CAP-ELISA试剂盒检测蜂蜜样品

取2g的蜂蜜于离心管中，加入4mL蒸馏水与4mL乙酸乙酯，漩涡混合30秒。离心(3000rpm)10分钟，取1mL上层液(乙酸乙酯)于50℃下，氮气吹干。加入0.5mL样品稀释液，混合备用。

取包被有CAP抗体的板条，加入100μL的CAP标准品或处理好的样品到相应的微孔中，标准品和样品必须使用新吸头，每孔加入50μL酶标CAP工作液，吸头尖不能接触微孔中的液面，在实验台面上水平振荡酶标板混匀微孔中的液体，37℃放置30分钟，洗涤液洗3次，加100μL底物，37℃避光显色10分钟。加入100μL终止液到微孔中。混合好后尽快在450nm或双波长450nm/630nm测量吸光度值，对照实施例标准曲线(图1)计算样品中CAP的含量。蜂蜜样品中3种不同浓度CAP的添加回收实验结果见表2。

表2.CAP-ELISA试剂盒检测猪尿液样品

添加浓(μg/kg)	重复1	重复2	重复3	重复4	重复5	平均值	平均回收率(％)	变异系数(％)
									0.10	0.07	0.08	0.12	0.09	0.11	0.09	90±2	22.06
0.20	0.25	0.18	0.17	0.19	0.18	0.19	95±3	16.54
									1.00	0.96	0.98	0.92	0.93	0.95	0.95	95±2	2.52

实施例5：CAP-ELISA试剂盒与HPLC/MS方法的符合实验

CAP-ELISA试剂盒检测方法按实施例4方法进行，HPLC/MS方法按国标GB/T18932.19-2003方法进行检测：称取5g蜂蜜，置于50mL离心管中，加入5mL水，涡旋混合1分钟，使样品完全溶解。加入15mL乙酸乙酯，在振荡器上振荡10分钟，在3000rpm下离心10分钟，准确吸取上层乙酸乙酯12mL，55℃减压蒸干，加入5mL水溶解残渣，待净化。将粗体液倒入Oasis HLB柱，溶液以≤3mL/分钟的流速通过Oasis HLB柱，待溶液完全流出后，用5mL乙腈水溶液(乙腈∶水＝1∶7)洗柱，弃去全部淋洗液，然后用乙酸乙酯洗脱，于50℃用氮吹仪吹干，用乙腈+水(体积比20∶80)补充体积至0.8mL，供液相色谱-串联质谱仪测定。CAP-ELISA试剂盒与HPLC/MS方法的符合实验的结果见图2。由图2可知，CAP-ELISA试剂盒与HPLC/MS方法的相关系数R²＝0.9974，这表明CAP-ELISA试剂盒方法与仪器方法相关性好，结果可靠。

对比例1：CAP-ELISA试剂盒(CAP-HRP)的制备

方法与实施例1基本相同，把酶标CAP由CAP-OVA-HRP换成CAP-HRP。以下我们将使用CAP-HRP作酶标CAP的CAP-ELISA试剂盒简称为对比试剂盒。实施例1和对比例的标准曲线见图1。

对比例2：对比试剂盒检测猪尿样品

用对比试剂盒检测添加有0.10μg/kg、0.20μg/kg和1μg/kg等3种不同浓度CAP的猪尿液样品，检测方法与实施例3相同。猪尿液样品中3种不同浓度CAP的添加回收实验结果见表3。由表1和表3可知，实施例的回收率均在90％以上，对比例回收率在50％-96％之间。这表明，在猪尿液样品的检测中实施例比对比例有更好的回收率和重复性，即本发明的酶联免疫试剂盒具有更高的检测精度。

表3.对比试剂盒检测猪尿样品

添加浓度(μg/kg)	重复1	重复2	重复3	重复4	重复5	平均值	平均回收率(％)	变异系数(％)
									0.10	0.05	0.07	0.06	0.05	0.04	0.05	50±1	21.11
0.20	0.15	0.21	0.18	0.21	0.19	0.19	95±2	13.24
									1.00	0.91	0.96	0.92	1.08	0.95	0.96	96±7	7.06

对比例3：对比试剂盒检测蜂蜜样品

用对比试剂盒检测添加有0.10μg/kg、0.20μg/kg和1μg/kg等3种不同浓度CAP的蜂蜜样品，检测方法与实施例4相同。蜂蜜样品中3种不同浓度CAP的添加回收实验结果见表4。由表2和表4可知，实施例的回收率均在90％以上，对比例回收率在60％-93％之间。这表明，在蜂蜜样品的检测中实施例比对比例有更好的回收率，实施例的测定结果更可靠。

表4.对比试剂盒检测蜂蜜样品

添加浓度(μg/kg)	重复1	重复2	重复3	重复4	重复5	平均值	平均回收率(％)	变异系数(％)
									0.10	0.05	0.08	0.04	0.07	0.06	0.06	60±2	26.35
0.20	0.15	0.19	0.16	0.18	0.15	0.17	85±2	10.94
									1.00	0.91	0.96	0.90	0.95	0.94	0.93	93±3	2.78

Claims (7)

1.一种检测残留的氯霉素的酶联免疫试剂盒，包括微孔板(1)、氯霉素标准样品(2)、浓缩洗涤液(3)、浓缩酶标氯霉素(4)、酶标稀释液(5)、底物液(6)和终止液(7)，

其中所述微孔板(1)是包被有兔抗氯霉素IgG的微孔板，即用0.05mol/L的pH值为9.6的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液将兔抗氯霉素IgG稀释至0.1μg/mL，按每孔100μL的量添加到所述微孔板中，在4℃下放置过夜，弃去包被液，用稀释后的洗涤液洗板3次，真空抽干，将该微孔板密封后置-20℃下保存；

所述浓缩酶标氯霉素(4)是10～100倍浓缩酶标氯霉素，其用碳二亚胺法将琥珀酸钠氯霉素(CAP)连接到卵清白蛋白(OVA)上制备CAP-OVA，然后用高碘酸钠法将辣根过氧化物酶(HRP)标记到CAP-OVA上制备成CAP酶标物(CAP-OVA-HRP)，用酶联免疫吸附试验测定CAP-OVA-HRP原液的工作浓度，将CAP-OVA-HRP原液用含10％小牛血清(体积比)的PBS稀释至工作浓度(浓度在0.1μg/mL～1μg/mL之间)的10～100倍，该酶标CAP溶液即为10～100倍浓缩酶标氯霉素。

2.根据权利要求1所述的检测残留的氯霉素的酶联免疫试剂盒，其中所述氯霉素标准品(2)的浓度分别为0μg/kg、0.03μg/kg、0.09μg/kg、0.27μg/kg、0.81μg/kg和2.43μg/kg。

3.根据权利要求1所述的检测残留的氯霉素的酶联免疫试剂盒，其中所述浓缩洗涤液(3)是5～10倍浓缩洗涤液；

所述酶标稀释液(5)由小牛血清和所述洗涤液按体积比1∶9组成；

所述底物液(6)包含5.37g/L的一水柠檬酸(C₆H₈O₇·H₂O)、19.38g/L的Na₂HPO₄·12H₂O、50mg/L的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)、25mg/L的过氧化氢脲和5％(体积比)的N，N-二甲基甲酰胺；

所述终止液(7)是0.5mol/L的盐酸。

4.根据权利要求3所述的检测残留的氯霉素的酶联免疫试剂盒，其中，所述浓缩洗涤液(3)是10倍浓缩洗涤液，其包含80g/L的NaCl、2g/L的KCl、29g/L的Na₂HPO₄·12H₂O、2g/L的KH₂PO₄和5ml/L的吐温-20；所述浓缩酶标氯霉素(4)是20倍浓缩酶标氯霉素。

5.一种用权利要求1所述的试剂盒检测残留的氯霉素的酶联免疫方法，所述方法是基于抗原抗体反应进行竞争性抑制测定，其包括以下步骤：

(I)待测样品的预处理，即将待测试的样品处理为体液样品，或者用有机溶剂提取待测样品、蒸干并且将其复溶于PBS制得溶液样品；

(II)取包被有兔抗氯霉素IgG的微孔板，加入100μL氯霉素标准品和处理后的样品到对应微孔中；

(III)加入50μL用酶标稀释液将所述的浓缩酶标氯霉素稀释至工作浓度的酶标氯霉素，振荡混匀后于37℃下避光静置孵育30分钟，用洗涤液洗涤3次，在吸水纸上拍干；

(IV)加入100μL底物液，于室温下避光静置10分钟，加入100μL反应终止液到微孔中，混合均匀后尽快在450nm或双波长450nm/630nm处测量吸光度值；以及

(V)以标准品测试的结果绘制标准曲线，对照标准曲线计算测试样品中的氯霉素的含量。

6.根据权利要求5所述的检测残留的氯霉素的酶联免疫方法，其中，所述酶标氯霉素的制备过程分两步：先用碳二亚胺法将琥珀酸钠氯霉素(CAP)连接到卵清白蛋白(OVA)上制备CAP-OVA，然后用高碘酸钠法将辣根过氧化物酶(HRP)标记到CAP-OVA上制备成CAP酶标物(CAP-OVA-HRP)。

7.根据权利要求5所述的检测残留的氯霉素的酶联免疫方法，其中，所述处理后的样品是经过以下处理的样品：

1)取尿液样品置离心机中，用12000g的离心力离心2分钟，取上清，用0.15mol/L的pH值为7.4的PBS稀释1倍；

2)取血清样品置离心机中，用12000g的离心力离心2分钟，取上清，用0.15mol/L pH值7.4的PBS稀释1倍；

3)取3.0克已均质后的猪肉样品于离心管中，加入6mL乙酸乙酯，漩涡混合1分钟，然后离心(3000rpm)10分钟，取2mL上层液(乙酸乙酯)，在50℃下氮气吹干，再加入正己烷1mL，待残余物完全溶解后，再加入1mL的含0.05％的吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBST)，漩涡混合30秒钟。离心(3000rpm)10分钟，吸去包含中间乳化层部分的上层液(正己烷)，吸取下层液(水层)作为处理后的样品。

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