CN101799469A - 检测残留的盐酸克伦特罗的酶联免疫试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测残留的盐酸克伦特罗的酶联免疫试剂盒及其检测方法。所述试剂盒包括：预包被葡萄球菌蛋白A和包被CBL抗体的微孔板(1)、CBL标准品(2)、浓缩洗涤液(3)、浓缩酶标CBL(4)、酶标稀释液(5)、底物液(6)和终止液(7)。本发明的试剂盒采用直接竞争法，即标准品或待测样品中的CBL和酶标CBL竞争微孔板上的CBL抗体。该方法可以用于直接检测动物源性食品、尿液和血清样品中的盐酸克伦特罗，其操作更简便、快捷，且操作时间仅需50分钟，灵敏度可达0.02μg/kg。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于检测残留的盐酸克伦特罗的酶联免疫试剂盒及其检测方法，属于酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)技术领域。更具体地，本发明涉及用于检测动物源食品、血液及尿液中残留的盐酸克伦特罗(CBL)的含量的酶联免疫试剂盒以及使用该试剂盒的检测方法。
背景技术
盐酸克伦特罗(clenbuterol，CBL)是一种β-2肾上腺受体激动剂，临床上作为支气管解痉药物，对支气管平滑肌β-2受体具有兴奋作用。有研究显示盐酸克伦特罗能增强脂肪分解和减慢蛋白质分解代谢，在畜牧生产中大剂量使用可以明显提高饲料转化率和瘦肉率，因此又被称为瘦肉精。
但是，如果盐酸克伦特罗的用量过大，则会对动物和人的肝脏、肾脏等器官造成相当大的毒害作用，出现心跳加速、头晕、心悸、呼吸困难、肌肉震颤和头疼等中毒症状。盐酸克伦特罗还可通过胎酶标板屏障进入胎儿体内产生蓄积，从而对子代产生严重的危害。欧盟于1996年禁止在畜牧生产中使用该药，我国农业部也于1997年作出相同规定。但由于经济利益的驱使，目前在畜牧生产中使用盐酸克伦特罗的现象仍然存在，每年都有大规模中毒事件发生。
当前，造成瘦肉精屡禁不止的原因之一就是国内外检测盐酸克伦特罗的方法、手段还不完善。存在的问题主要有：检测方法灵敏度不高，准确度不够；特异性差，操作复杂，不能普及到基层。目前盐酸克伦特罗的检测方法主要有：色谱技术和免疫分析技术。色谱技术由于费时，花费多，在实际应用中受到一定限制，通常作为确定性的定量检验方法；酶联免疫分析方法(ELISA)是常用的现场抽样快速筛选检验方法，目前我国进出口检验检疫，兽医卫生部门及屠宰场多采用德国R-Biopharm公司生产的盐酸克伦特罗ELISA检测试剂盒(货号：R1701)，但由于进口试剂价格昂贵，在一定程度上限制了它的使用范围。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种能够快速且准确地检测出残留的盐酸克伦特罗的酶联免疫试剂盒。本发明所要解决的另一技术问题是提供一种操作简单、耗时短且检测灵敏度高的检测残留的盐酸克伦特罗的方法。
为解决所述技术问题，本发明的发明人通过深入研究和大量实验，提供以下技术方案来解决所述技术问题：
1.一种检测残留的盐酸克伦特罗的酶联免疫试剂盒，包括微孔板(1)、盐酸克伦特罗标准品(2)、浓缩洗涤液(3)、浓缩酶标盐酸克伦特罗(4)、酶标稀释液(5)、底物液(6)和终止液(7)，
其中，所述微孔板(1)是预先包被葡萄球菌蛋白A，然后包被兔抗盐酸克伦特罗抗体的微孔板，所述预先包被葡萄球菌蛋白A是用0.05mol/L的pH值为9.6的Na2CO3-NaHCO3缓冲液将葡萄球菌蛋白A稀释至1μg/ml，按每孔100μl的量添加到微孔板板(1)中，4℃放置过夜，弃去包被液，用稀释后的浓缩洗涤液洗板3次。
2.根据上述第1项所述的检测残留的盐酸克伦特罗的酶联免疫试剂盒，其中，所述微孔板包被兔抗盐酸克伦特罗抗体是用0.05mol/L的pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)将兔抗盐酸克伦特罗抗体以1∶50,000比例稀释，按每孔100μl的量添加到微孔板中，4℃放置过夜，弃去包被液，用稀释后的浓缩洗涤液洗板3次，然后真空抽干，将微孔板密封后置-20℃下保存。
3.根据上述第1项所述的检测残留的盐酸克伦特罗的酶联免疫试剂盒，其中，所述盐酸克伦特罗标准品(2)的浓度分别为0μg/kg、0.02μg/kg、0.06μg/kg、0.18μg/kg、0.54μg/kg和1.6μg/kg。
4.根据上述第1项所述的检测残留的盐酸克伦特罗的酶联免疫试剂盒，其中，所述浓缩洗涤液(3)是5～10倍浓缩洗涤液，即在使用时将该浓缩洗涤液稀释5～10倍；
所述酶标稀释液(5)是由小牛血清和所述洗涤液按体积比1∶9组成；
所述浓缩酶标盐酸克伦特罗(4)是10～100倍的浓缩酶标盐酸克伦特罗，采用重氮化-偶联的方法将辣根过氧化物酶(HRP)标记到盐酸克伦特罗(CBL)上，用酶联免疫吸附试验测定酶标CBL原液的工作浓度，将酶标CBL原液用含10％小牛血清(体积比)的PBS稀释至工作浓度(浓度在0.1μg/mL～1μg/mL范围内)的10～100倍，该酶标CBL溶液即为10～100倍浓缩酶标CBL；
所述底物液(6)包含5.37g/L的一水柠檬酸(C6H8O7·H2O)、19.38g/L的Na2HPO4·12H2O、50mg/L的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)、25mg/L的过氧化氢脲和5％(体积比)的N，N-二甲基甲酰胺；
所述终止液(7)是0.5mol/L的盐酸。
5.根据上述第4项所述的检测残留的盐酸克伦特罗的酶联免疫试剂盒，其中，所述浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，其包含80g/L的NaCl、2g/L的KCl、29g/L的Na2HPO4.12H2O、2g/L的KH2PO4和5ml/L的吐温-20；以及所述浓缩酶标盐酸克伦特罗是20倍的浓缩酶标盐酸克伦特罗。
6.一种用上述第1项所述试剂盒检测残留的盐酸克伦特罗的酶联免疫方法，其是基于抗原抗体反应进行竞争性抑制测定的方法，该方法包括以下步骤：
(I)预处理待测样品，即将待测试的样品处理为液体样品，或者用有机溶剂提取待测样品、蒸干并且将其复溶于PBS；
(II)取包被葡萄球菌蛋白A和盐酸克伦特罗抗体的包被板，加入50μL盐酸克伦特罗标准品和处理后的样品到对应微孔中；
(III)加入100μL用酶标稀释液(5)将所述浓缩酶标盐酸克伦特罗稀释至工作浓度的酶标盐酸克伦特罗，振荡混匀后于37℃下避光静置孵育30分钟，用稀释后的浓缩洗涤液洗涤3次，在吸水纸上拍干；
(IV)加入100μL底物液，于室温下避光静置10分钟，加入100μL反应终止液到微孔中，混合好后立即在450nm或双波长450nm/630nm测量吸光度值；
(V)以标准品测试的吸光度比值与标准品的浓度对数值绘制标准曲线，对照标准曲线计算样品中盐酸克伦特罗的含量。
7.根据上述第6项所述的方法，其中，在步骤(II)中，盐酸克伦特罗标准品和处理好的样品同时添加到对应微孔中。
8.根据上述第6或7项所述的方法，其中，所述处理后的样品是经过以下处理的样品：
1)取尿液样品，离心(离心力为12000g)2分钟后取上清，用0.15mol/L的pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)稀释1倍；
2)取血清样品，离心(离心力为12000g)2分钟后取上清，用0.15mol/L的pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)稀释1倍；
3)取3.0克已均质后的猪肉样品于离心管中，加入6mL乙酸乙酯，漩涡混合1分钟，然后离心(转速3000rpm)10分钟，取2mL上层液(乙酸乙酯)，在50℃下氮气吹干，再加入正己烷1mL，待残余物完全溶解后，再加入1mL的含0.05％的吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBST)，漩涡混合30秒钟。离心(3000rpm)10分钟，吸去包含中间乳化层部分的上层液(正己烷)，吸取下层液(水层)作为处理后的样品。
本发明采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法来检测盐酸克伦特罗(CBL)。用于检测残留的CBL的酶联免疫试剂盒首先用葡萄球菌蛋白A(Staphylococal Protein A，一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质)预包被微孔板。葡萄球菌蛋白A的预包被可以使CBL抗体呈现正确的构象，更有效地捕获小分子，提高检测灵敏度，本发明试剂盒的灵敏度可达0.02ug/kg。此外，本发明检测残留CBL的方法是采用直接竞争法，预包被和包被在生产时已经完成，使用时仅有1次抗原-抗体反应，操作更简单，同时减轻了工作量，缩短了检测时间。
附图说明
图1是本发明的实施例与对比例的CBL-ELISA标准曲线图。
图2是本发明的CBL-ELISA检测方法与HPLC方法的符合实验图。
具体实施方式
以下采用更具体的实施方式或实施例来描述本发明，但是本发明的保护范围并不打算限制于此处所述的具体实施方式或实施例。
本发明方法采用酶联免疫吸附试验(ELISA)来检测CBL。该方法的技术主要在于三个方面：1)采用葡萄球菌蛋白A预包被酶标板，特异性多克隆抗体利用其Fc段与葡萄球菌蛋白A作用吸附到酶标板上，保证了特异性抗体抗原结合位点暴露在外；2)特异性多克隆抗体的制备，利用抗原免疫家兔，获得含有抗体的血清；3)酶标记盐酸克伦特罗。该测定方法的原理为：基于抗原抗体反应进行竞争性抑制测定，微孔板包被有盐酸克伦特罗抗体，加入标准样品或待测样品、竞争性酶标记物后，盐酸克伦特罗与竞争性酶标记物竞争盐酸克伦特罗抗体，没有与抗体连接的盐酸克伦特罗标记酶在洗涤步骤中被除去；然后，将底物加入到孔中孵育，结合的标记酶将无色的底物转化为蓝色的产物，加入反应终止液后使颜色由蓝转变为黄色。在450nm或双波长450nm/630nm处测量吸光度值，吸光度比值与克仑特罗浓度的自然对数成反比，对照标准曲线计算样品中盐酸克伦特罗的含量。
根据本发明的一种优选实施方式，本发明方法的操作步骤为：
取包被有兔抗盐酸克伦特罗抗体的48或96孔包被板，加入50μL盐酸克伦特罗标准样品和处理好的样品到对应微孔中，加入100μL用酶标稀释液(5)以1∶20比例将20倍浓缩酶标盐酸克伦特罗(4)稀释所获得的酶标盐酸克伦特罗(其浓度为0.005μg/ml～0.05μg/ml)，振荡混匀后于37℃下避光静置孵育30分钟，用洗涤液洗涤3次，在吸水纸上拍干，加入100μL底物液，于室温下避光静置10分钟，加入100μL反应终止液到微孔中，混合好后尽快在450nm或双波长450nm/630nm测量吸光度值，对照标准曲线计算样品中盐酸克伦特罗的含量。
根据本发明的一种优选实施方式，本发明方法首先将待测样品进行预处理，即将待测试的样品处理为液体样品，或者用有机溶剂提取待测样品、蒸干并且将其复溶于PBS。例如将待测样品处理为澄清的尿液、血液或其他体液样品，或者经过有机溶剂提取、蒸干，复溶于PBS而制得的样品。
本发明的试剂盒或检测方法可以检测各种动物源性食品或者动物排泄物，例如肉类、蛋类、乳类制品；动物排泄物、动物饲料；以及其它动物源性食品或物质。优选地，以下列举几种样品的预处理方法：
1)尿液样品：取尿液样品，离心(离心力为12000g)2分钟取上清，用0.15mol/L的pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)稀释1倍后直接上样。
2)血清样品：取血清样品，离心(离心力为12000g)2分钟取上清，用0.15mol/L的pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)稀释1倍后直接上样。
3)猪肉样品：取3.0克已均质后的样品于离心管中，加入6mL乙酸乙酯，漩涡混合1分钟。然后，离心(转速为3000rpm)10分钟，取2mL上层液(乙酸乙酯)，在50℃下氮气吹干。再加入正己烷1mL，待残余物完全溶解后，再加入1mL的含0.05％的吐温-20的磷酸盐缓冲液，漩涡混合30秒钟。然后离心(转速3000rpm)10分钟，吸去包含中间乳化层部分的上层液(正己烷)，吸取下层液(水层)上样。
本发明用于检测残留的盐酸克伦特罗的酶联免疫试剂盒首先采用葡萄球菌蛋白A预包被酶标板，保证了抗体在酶标板上正确定向，使抗体的结合能力得到最好的展示，试剂盒的灵敏度高，超过了R-Biopharm试剂盒(货号：R1701)试剂盒的水平。而且，本发明所述的试剂盒操作简单，采用直接竞争法，仅有一步抗原-抗体反应，比常用的间接竞争ELISA试剂盒少一个抗原-抗体反应步骤，整个检测过程仅需50分钟，使用更方便、同时又保证了极高的灵敏度(0.02ug/kg)。
实施例
实施例1 制备CBL-ELISA试剂盒
CBL是小分子半抗原，仅有反应原性，却没有免疫原性，需要与大分子物质结合后才能用于免疫动物制备抗体。CBL中苯环上的氨基为活性基团，可以采用重氮化-偶联法与蛋白质的氨基结合。
CBL-HSA抗原的制备：
将5～10mg的CBL溶于0.1mol/L预冷的HCl中，缓慢滴加1mol/L亚硝酸钠溶液，用KI淀粉试纸检验至试纸变为深紫色时停止，得到重氮化CBL。称取50～100mg的人体血清蛋白(HSA)溶于pH值为9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液中，将重氮化CBL缓慢滴到HSA溶液中，用1mol/L的NaOH调节pH值至9.0～9.5，滴加结束后，继续反应4小时，在4℃冰箱中用0.15mol/L的pH值为7.4的PBS透析两天，得到CBL-HSA结合物。
抗盐酸克伦特罗抗体的制备：
选取3月龄健康新西兰大白兔，用0.15mol/L的pH值为7.4的PBS将CBL-HAS稀释成浓度为1mg/mL，与等体积弗氏佐剂混合，用涡旋振荡器乳化10分钟得到油包水的抗原乳化剂。兔子首次免疫用弗氏完全佐剂乳化抗原，每只兔子注射含0.5mg的CBL-HSA的抗原乳化剂，注射方式为颈背部皮下多点注射；以后每隔4周加强免疫1次，抗原用弗氏不完全佐剂乳化，共免疫5次。心脏采血分离血清，分装后在-70℃下保存。
酶标CBL的制备：
将5～10mg的CBL溶于0.1mol/L预冷的HCl中，缓慢滴加1mol/L亚硝酸钠溶液，用KI淀粉试纸检验至试纸变为深紫色时停止，得到重氮化CBL。称取30～60mg的HRP溶于pH值为9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液中。将重氮化CBL缓慢滴到HRP溶液中，用1mol/L的NaOH调节pH值至9.0～9.5，滴加结束后，继续反应4小时，在4℃下冰箱中用0.15mol/L的pH值为7.4的PBS透析两天，得到CBL-HRP结合物，即酶标CBL。
包被板的制备：
用0.05mol/L的pH值为9.6的Na2CO3-NaHCO3缓冲液将葡萄球菌蛋白A稀释至1μg/ml，按每孔100μl的量加到96或48孔酶标板中，4℃下放置过夜，弃去包被液，用洗涤液洗板3次。然后包被兔抗盐酸克伦特罗抗体，用0.15mol/L的pH值为7.4磷酸盐缓冲液(PBS)将兔抗盐酸克伦特罗抗体以1∶50,000比例稀释，按每孔100μl的量加到96或48孔酶标板中，4℃放置过夜，弃去包被液，用洗涤液洗板3次。真空抽干，将该包被板密封后置-20℃下冷冻保存。
试剂的配制：
(1)6种盐酸克伦特罗标准品，其盐酸克伦特罗浓度分别为0μg/kg、0.02μg/kg、0.06μg/kg、0.18μg/kg、0.54μg/kg和1.6μg/kg，它们是采用0.15mol/L的pH值为7.4的PBS稀释液进行相应比例稀释来制备的；
(2)浓缩洗涤液可以为5～10倍浓缩洗涤液，当为10倍浓缩洗涤液时，该浓缩洗涤液，其包含80g/L的NaCl、2g/L的KCl、29g/L的Na2HPO4.12H2O、2g/L的KH2PO4和5ml/L的吐温-20；
(3)浓缩酶标盐酸克伦特罗可以为10～100倍浓缩酶标盐酸克伦特罗，本实施例采用20被浓缩酶标盐酸克伦特罗：测定酶标CBL原液的工作浓度，将酶标CBL原液用含10％小牛血清的PBS稀释至工作浓度的20倍，则此酶标CBL溶液即为20倍浓缩酶标CBL。
(4)酶标稀释液由10％小牛血清和90％的洗涤液组成；
(5)底物液包含5.37g/L的一水柠檬酸(C6H8O7.H2O)、19.38g/L的Na2HPO4.12H2O、50mg/L的TMB、25mg/L的过氧化氢脲和5％(体积比)的N，N-二甲基甲酰胺；
(6)终止液是0.2～0.8mol/L的盐酸，本实施例采用0.5mol/L的盐酸作为终止液。
根据本发明的一种实施方式，基于上述制备的试剂，本发明的用于检测残留的克伦特罗的酶联免疫试剂盒包括如下材料，并且足够进行96个测量：
(1)酶标板：96孔，每条8孔，共12条；
(2)克伦特罗标准品：1ml×6瓶；其浓度分别为0μg/kg、0.02μg/kg、0.06μg/kg、0.18μg/kg、0.54μg/kg和1.6μg/kg；
(3)10倍浓缩洗涤液：50mL×1瓶；
(4)20倍浓缩酶标记物：1mL×1瓶；
(5)酶标记物稀释液：20mL×1瓶；
(6)底物液：12mL×1瓶；
(7)反应终止液：13mL×1瓶。
使用本发明的试剂盒应当注意：试剂盒应充分回温(室温放置1小时)，否则会导致OD值偏低；试剂使用前充分摇匀；加液时间不能过长，否则会影响标准曲线线性；当底物液呈现淡蓝色时，表明已变质，请勿使用。
标准曲线绘制：
用上述制备的试剂盒检测浓度为0μg/kg、0.02μg/kg、0.06μg/kg、0.18μg/kg、0.54μg/kg和1.6μg/kg的6种盐酸克伦特罗标准品，在450nm处测量吸光度值，用吸光度比值(即标准品或待测样品的吸光度值与浓度为0μg/kg的标准品的吸光度值之比)作纵坐标，CBL浓度的自然对数作横坐标绘制标准曲线。另外，用未预包被葡萄球菌蛋白A的试剂盒作为对比例也绘制标准曲线，实施例和对比例的标准曲线参见附图1。
实施例2 添加盐酸克伦特罗(CBL)药品
将1mg/mL的CBL母液稀释成适当浓度，添加到用HPLC(高效液体色谱)方法鉴定为无CBL残留的尿液或猪肉样品中，使这些样品中的CBL浓度为0.2μg/kg、0.4μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、2μg/kg、3μg/kg和4μg/kg，每种浓度的样品有5个，用于添加回收实验。
实施例3 CBL-ELISA试剂盒检测猪尿液样品
用本发明的CBL-ELISA试剂盒检测添加有0.20μg/kg、0.40μg/kg和1μg/kg等3种不同浓度CBL的猪尿液样品，具体检测步骤如下：
先将样品进行处理：取猪尿液样品，离心(离心力为12000g)2分钟取上清，用0.15mol/L的pH值为7.4的PBS稀释1倍后直接上样。
取包被有CBL抗体的微孔板条，加入50μl的CBL标准品或处理后的样品到相应的微孔中，标准品和待测样品必须使用新吸头，每孔加入100μl酶标CBL工作液，吸头尖不能接触微孔中的液面，在实验台面上水平振荡酶标板混匀微孔中的液体，37℃放置30分钟，洗涤液洗3次，加100μl底物，37℃避光显色10分钟。加入100μl终止液到微孔中。混合好后尽快在450nm或双波长450nm/630nm测量吸光度值，对照实施例标准曲线(附图1)计算测试样品中盐酸克伦特罗的含量。猪尿液样品中3种不同浓度CBL的添加回收实验结果见表1。
表1.猪尿液样品添加回收实验结果
| 添加浓度(μg/kg) | 重复1 | 重复2 | 重复3 | 重复4 | 重复5 | 平均值 | 平均回收率(％) | 变异系数(％) |
| 0.20 | 0.25 | 0.19 | 0.15 | 0.17 | 0.16 | 0.18 | 90±4 | 21.60 |
| 添加浓度(μg/kg) | 重复1 | 重复2 | 重复3 | 重复4 | 重复5 | 平均值 | 平均回收率(％) | 变异系数(％) |
| 0.40 | 0.50 | 0.35 | 0.36 | 0.33 | 0.38 | 0.38 | 95±7 | 17.53 |
| 1.00 | 1.05 | 0.90 | 0.99 | 0.91 | 0.97 | 0.96 | 96±6 | 6.38 |
其中，平均回收率是由“(实际测定值/理论添加值)×100％”计算得到的数值，其可以表现出本发明方法的准确度；变异系数是表示五次重复实验的重复性。
实施例4 CBL-ELISA试剂盒检测猪肉样品
用CBL-ELISA试剂盒检测添加有0.20μg/kg、0.40μg/kg和1μg/kg等3种不同浓度CBL的猪肉样品，具体检测步骤如下：
先将样品进行处理：取3.0克已均质后的样本于离心管中，加入6mL乙酸乙酯，漩涡混合1分钟。离心(转速为3000rpm)10分钟，取2mL上层液(乙酸乙酯)，在50℃下氮气吹干。再加入正己烷1mL，待残余物完全溶解后，再加入1mL的含0.05％的吐温-20的磷酸盐缓冲液，漩涡混合30秒钟。离心(转速为3000rpm)10分钟，吸去包含中间乳化层部分的上层液(正己烷)，吸取下层液(水层)备用。
取包被有CBL抗体的微孔板条，加入50μl的CBL标准品或上述处理后的样品到相应的微孔中，取标准品和待测样品必须使用新吸头，每孔加入100μl酶标CBL工作液，吸头尖不能接触微孔中的液面，在实验台面上水平振荡酶标板混匀微孔中的液体，37℃放置30分钟，洗涤液洗3次，加100μl底物，37℃避光显色10分钟。加入100μl终止液到微孔中。混合好后尽快在450nm或双波长450nm/630nm测量吸光度值，对照实施例标准曲线(图1)计算样品中盐酸克伦特罗的含量。猪肉样品中3种不同浓度CBL的添加回收实验结果见表2。
表2.猪肉样品添加回收实验结果
| 添加浓度(μg/kg) | 重复1 | 重复2 | 重复3 | 重复4 | 重复5 | 平均值 | 平均回收率(％) | 变异系数(％) |
| 0.20 | 0.12 | 0.19 | 0.25 | 0.18 | 0.16 | 0.18 | 90±5 | 27.22 |
| 0.40 | 0.45 | 0.39 | 0.35 | 0.30 | 0.36 | 0.37 | 92.5±6 | 18.57 |
| 1.00 | 0.91 | 1.06 | 0.90 | 0.93 | 0.95 | 0.95 | 95±6 | 5.33 |
实施例5 CBL-ELISA试剂盒与HPLC方法的符合实验
CBL-ELISA试剂盒检测方法按照实施例4的方法进行，HPLC方法按国标GB/T5009.192-2003方法进行检测：称取猪肉试样10.00g(精确到0.01g)，用20ml的0.1mol/L高氯酸溶液匀浆，置于磨口玻璃离心管中；然后置于超声波清洗器中超声20分钟，取出置于80℃水浴中加热30分钟。取出冷却后在转速为4500rpm下离心15分钟。倒出上清液，沉淀用5mL的0.1mol/L高氯酸溶液洗涤，再离心，合并两次的上清液。用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9.5±0.1，若有沉淀产生，再离心10分钟，将上清液转移至磨口离心管中，加8g氯化钠，混匀，加25mL的异丙醇+乙酸乙酯(两者体积比为40∶60)，置于振荡器上振荡提取20分钟。提取完毕，放置5分钟(若有乳化层稍微离心一下)。用吸管小心将上层有机相移至旋转蒸发瓶中，用20mL异丙醇+乙酸乙酯(两者体积比为40∶60)再重复萃取一次，合并有机相，于60℃下在旋转蒸发仪上浓缩至近干。用1mL的0.1mol/L磷酸二氢钠缓冲液(pH值为6.0)充分溶解残留物，经针筒式微孔过滤膜过滤，洗涤3次后完全转移至5mL玻璃离心管中，并用0.1mol/L磷酸二氢钠缓冲液(pH值为6.0)定容至刻度。取样用仪器进行分析。CBL-ELISA试剂盒与HPLC方法的符合实验的结果参附图2。由附图2可以看出，采用本发明的CBL-ELISA试剂盒的检测方法与HPLC方法的相关系数为R2＝0.9923，这表明CBL-ELISA试剂盒方法与仪器方法相关性好，测试结果可靠。
对比例1 未预包被葡萄球菌蛋白A的CBL-ELISA试剂盒的制备
方法与实施例1基本相同，仅去掉用葡萄球菌蛋白A预包被酶标板这一步骤。以下我们将未预包被葡萄球菌蛋白A的CBL-ELISA试剂盒简称为对比试剂盒。其中，实施例1和对比例的标准曲线参见图1。
对比例2 对比试剂盒检测猪尿样品
用对比试剂盒检测添加有0.20μg/kg、0.40μg/kg和1μg/kg等3种不同浓度CBL的猪尿液样品，检测方法与实施例3相同。猪尿液样品中3种不同浓度CBL的添加回收实验结果见表3。由表1和表3对比可知，实施例的回收率均在90％以上，对比例回收率在65％-87％之间。这表明，在猪尿液样品的检测中实施例比对比例有更好的回收率和重复性，即本发明的酶联免疫试剂盒具有更高的检测精度。
表3.对比试剂盒检测猪尿液样品
| 添加浓度(μg/kg) | 重复1 | 重复2 | 重复3 | 重复4 | 重复5 | 平均值 | 平均回收率(％) | 变异系数(％) |
| 0.20 | 0.15 | 0.19 | 0.12 | 0.11 | 0.10 | 0.13 | 65±4 | 26.35 |
| 0.40 | 0.45 | 0.35 | 0.30 | 0.33 | 0.29 | 0.34 | 85±6 | 14.93 |
| 1.00 | 0.81 | 0.86 | 0.90 | 0.93 | 0.85 | 0.87 | 87±5 | 6.78 |
对比例3 对比试剂盒检测猪肉样品
用对比试剂盒检测添加有0.20μg/kg、0.40μg/kg和1μg/kg等3种不同浓度CBL的猪肉样品，检测方法与实施例4相同。猪肉样品中3种不同浓度CBL的添加回收实验结果见表4。由表2和表4对比可知，实施例的回收率均在90％以上，对比例回收率在60％-89％之间，实施例变异系数均在30％以内，对比例在检测0.2μg/kg添加量时变异系数为32.56％，不符合检测要求。这表明，在猪肉样品的检测中实施例比对比例有更好的回收率，且测定结果比对比例稳定。
表4.对比试剂盒检测猪肉样品
| 添加浓度(μg/kg) | 重复1 | 重复2 | 重复3 | 重复4 | 重复5 | 平均值 | 平均回收率(％) | 变异系数(％) |
| 0.20 | 0.10 | 0.15 | 0.18 | 0.08 | 0.11 | 0.12 | 60±4 | 32.56 |
| 0.40 | 0.25 | 0.35 | 0.29 | 0.30 | 0.36 | 0.31 | 77.5±5 | 14.61 |
| 1.00 | 0.81 | 0.86 | 0.90 | 0.93 | 0.95 | 0.89 | 89±6 | 6.31 |
Claims (8)
1.一种检测残留的盐酸克伦特罗的酶联免疫试剂盒，包括微孔板(1)、盐酸克伦特罗标准品(2)、浓缩洗涤液(3)、浓缩酶标盐酸克伦特罗(4)、酶标稀释液(5)、底物液(6)和终止液(7)，
其中，所述微孔板(1)是预先包被葡萄球菌蛋白A，然后包被兔抗盐酸克伦特罗抗体的微孔板，所述预先包被葡萄球菌蛋白A是用0.05mol/L的pH值为9.6的Na2CO3-NaHCO3缓冲液将葡萄球菌蛋白A稀释至1μg/ml，按每孔100μl的量添加到微孔板板(1)中，4℃放置过夜，弃去包被液，用稀释后的浓缩洗涤液洗板3次。
2.根据权利要求1所述的检测残留的盐酸克伦特罗的酶联免疫试剂盒，其中，所述微孔板包被兔抗盐酸克伦特罗抗体是用0.05mol/L的pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)将兔抗盐酸克伦特罗抗体以1∶50,000比例稀释，按每孔100μl的量添加到微孔板中，4℃放置过夜，弃去包被液，用洗涤液洗板3次，然后真空抽干，将微孔板密封后置-20℃下保存。
3.根据权利要求1所述的检测残留的盐酸克伦特罗的酶联免疫试剂盒，其中，所述盐酸克伦特罗标准品(2)的浓度分别为0μg/kg、0.02μg/kg、0.06μg/kg、0.18μg/kg、0.54μg/kg和1.6μg/kg。
4.根据权利要求1所述的检测残留的盐酸克伦特罗的酶联免疫试剂盒，其中，所述浓缩洗涤液(3)是5～10倍浓缩洗涤液；
所述酶标稀释液(5)是由小牛血清和所述洗涤液按体积比1∶9组成；
所述浓缩酶标盐酸克伦特罗(4)是10～100倍的浓缩酶标盐酸克伦特罗，采用重氮化-偶联的方法将辣根过氧化物酶(HRP)标记到盐酸克伦特罗(CBL)上，用酶联免疫吸附试验测定酶标CBL原液的工作浓度，将酶标CBL原液用含10％小牛血清(体积比)的PBS稀释至工作浓度(浓度在0.1μg/mL～1μg/mL范围内)的10～100倍，该酶标CBL溶液即为10～100倍浓缩酶标CBL；
所述底物液(6)包含5.37g/L的一水柠檬酸(C6H8O7·H2O)、19.38g/L的Na2HPO4·12H2O、50mg/L的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)、25mg/L的过氧化氢脲和5％(体积比)的N，N-二甲基甲酰胺；
所述终止液(7)是0.5mol/L的盐酸。
5.根据权利要求4所述的检测残留的盐酸克伦特罗的酶联免疫试剂盒，其中，所述浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，其包含80g/L的NaCl、2g/L的KCl、29g/L的Na2HPO4·12H2O、2g/L的KH2PO4和5ml/L的吐温-20；以及所述浓缩酶标盐酸克伦特罗是20倍的浓缩酶标盐酸克伦特罗。
6.一种用权利要求1所述的试剂盒检测残留的盐酸克伦特罗的酶联免疫方法，其是基于抗原抗体反应进行竞争性抑制测定的方法，该方法包括以下步骤：
(I)预处理待测样品，即将待测试的样品处理为体液样品，或者用有机溶剂提取待测样品、蒸干并且将其复溶于PBS制得溶液样品；
(II)取包被葡萄球菌蛋白A和盐酸克伦特罗抗体的包被板，加入50μL盐酸克伦特罗标准品和处理后的样品到对应微孔中；
(III)加入100μL用酶标稀释液(5)将所述浓缩酶标盐酸克伦特罗(4)稀释至工作浓度的酶标盐酸克伦特罗，振荡混匀后于37℃下避光静置孵育30分钟，用洗涤液洗涤3次，在吸水纸上拍干；
(IV)加入100μL底物液，于室温下避光静置10分钟，加入100μL反应终止液到微孔中，混合好后立即在450nm或双波长450nm/630nm测量吸光度值；
(V)以标准品测试的吸光度比值与标准品的浓度对数值绘制标准曲线，对照标准曲线计算样品中盐酸克伦特罗的含量。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，在步骤(II)中，盐酸克伦特罗标准品和处理好的样品同时添加到对应微孔中。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，所述处理后的样品是经过以下处理的样品：
1)取尿液样品，离心(离心力为12000g)2分钟后取上清，用0.15mol/L的pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)稀释1倍；
2)取血清样品，离心(离心力为12000g)2分钟后取上清，用0.15mol/L的pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)稀释1倍；
3)取3.0克已均质后的猪肉样品于离心管中，加入6mL乙酸乙酯，漩涡混合1分钟，然后离心(3000rpm)10分钟，取2mL上层液(乙酸乙酯)，在50℃下氮气吹干，再加入正己烷1mL，待残余物完全溶解后，再加入1mL的含0.05％的吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBST)，漩涡混合30秒钟，离心(3000rpm)10分钟，吸去包含中间乳化层部分的上层液(正己烷)，吸取下层液(水层)作为处理后的样品。
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