CN103592434B - 检测β-兴奋剂类的一步法酶联免疫检测方法及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了属于免疫检测技术领域的检测β-兴奋剂类的一步法酶联免疫检测方法及其试剂盒。该试剂盒包括：β-兴奋剂特异性抗体、包被有β-兴奋剂特异性抗体的酶标板、β-兴奋剂辣根过氧化物酶标记物、克伦特罗标准品、酶标物稀释液、显色剂、清洗液、终止液和浓缩样品稀释液。本试剂盒具有灵敏度高、特异性强、高精确度、高准确度、对仪器设备要求低、试剂保存期长、自动化程度高、无放射性同位素污染等优点，可在动物源性食品及饲料产品检测中发挥重要作用。
Description
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及检测β-兴奋剂类的一步法酶联免疫检测方法及其试剂盒。
背景技术
β兴奋剂是一种人和兽医作为治疗哮喘的药物。在牲畜中超剂量使用可以将牲畜的脂肪组织转化为肌肉组织，由于能够显著改善脂肪率和生产效率，β兴奋剂往往被滥用于畜牧养殖生产中。近年来已经有沙丁胺醇、妥布特罗、溴布特罗、克伦特罗、西布特罗、马布特罗、特布他林中毒的病例报道。
在β兴奋剂中，沙丁胺醇、妥布特罗、溴布特罗、克伦特罗、西布特罗、马布特罗、特布他林毒性较大，检测这些物质一般将沙丁胺醇与载体合成抗原或半抗原，免疫动物，获得多克隆抗体，可与其他β兴奋剂有交叉反应，进而也可以检测其他β兴奋剂，但是，目前，尚没有一种可以同时检测沙丁胺醇、妥布特罗、溴布特罗、克伦特罗、西布特罗、马布特罗、特布他林这7种β兴奋剂的异性抗体。
传统的试剂盒检测用显色剂一般将它调配成A、B两种液体，当需要显色时就分别加入A和B液，当混合液与实验中复合物反应就会产生显色效果。A液一般由PBS缓冲液、柠檬酸、ED-TA乙二氨四乙酸、ProcLin-300、过氧化氢组成，B液一般由PBS缓冲液、柠檬酸、ED-TA乙二氨四乙酸、ProcLin-300、硫代硫酸钠组成；使用时需要将两种液体按比例混合后才能使用，且两种液体都需要避光保存，使用起来比较麻烦。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测β-兴奋剂类的一步法酶联免疫检测试剂盒。
本发明的目的还在于提供一种检测β-兴奋剂类的一步法酶联免疫检测的方法。
一种检测β-兴奋剂类的一步法酶联免疫检测试剂盒，该试剂盒包括：β-兴奋剂特异性抗体、包被有β-兴奋剂特异性抗体的酶标板、β-兴奋剂辣根过氧化物酶标记物、克伦特罗标准品、酶标物稀释液、显色剂、清洗液、终止液和浓缩样品稀释液。
所述显色剂为过氧化氢或过氧化脲，邻苯二胺或四甲基联苯胺与稳定剂K按体积比5∶5∶1混合而成的溶液，稳定剂K、含酶稳定剂AH和酶保护剂均购自美国InternationalDiagosticaSystem公司。
所述的酶标物稀释液为含酶稳定剂AH和酶保护剂KEN的磷酸盐缓冲液。
所述的终止液为2mol/L的盐酸溶液。
所述的浓缩样品稀释液为含1％BSA的5倍浓缩磷酸盐缓冲液。
所述β-兴奋剂特异性抗体是以特异免疫原免疫动物制得，所述特异免疫原是将克伦特罗、沙丁胺醇、特布他林、马布特罗、溴布特罗、妥布特罗和西布特罗通过戊二醛法交联到载体蛋白上制成。
所述载体蛋白为多聚赖氨酸、牛血清白蛋白、鸡丙种球蛋白、人血丙种球蛋白或卵清蛋白。
所述动物为兔、鼠或羊。
9、一种检测β-兴奋剂类的一步法酶联免疫检测方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
(1)将试剂于盒外充分恢复至室温，恢复时间为1-5小时；
(2)预先进行编号，标记B0、标准品和样品的位置，进行双孔检测；
(3)从包被有β-兴奋剂特异性抗体的酶标板上取下所需数量的微孔，将
多余的微孔重新密封并放回2～8℃保存；
(4)将酶标物、浓缩样品稀释液、清洗液根据稀释倍数用蒸馏水配制成工作液；
(5)在B0孔中加入50μL0.0ng/mL标准品溶液，在各标准孔中加入50μL的标准品溶液，在各样品孔中加入50μL样品溶液；
(6)在所有孔中加入100μL的酶标物，晃动反应1-10s，室温下孵育30min；
(7)倒掉微孔中的液体，在所有微孔中加满清洗液，用微量移液器在每个微孔中加入100μL显色剂，晃动酶标板使之混匀；
(8)室温下显色10min，每孔中加入100μL终止液，混匀；
(9)在450nm下检测吸光度，分析计算检测结果。
本发明的有益效果：本试剂盒主要采用直接竞争酶联免疫法可同时定性或定量检测7种β兴奋剂的含量。β-兴奋剂特异性抗体采用特制的免疫原免疫大白兔得到，该免疫原通过7种β-兴奋剂与载体蛋白采用戊二醛偶联方法得到。该试剂盒室温下即可进行检测，无需保温37℃。显色液为混合显色液，无需分次单独添加，减少了操作程序。此外，本试剂盒的显色过程无需避光，直接在室内显色10min即可。全部检测过程仅需40min。酶标物一冻干粉形式提供，稳定性更好。另外主要试剂以工作液形式提供，可以减少检测的操作步骤，为使用者节省时间并降低因操作步骤冗繁造成的误差。本试剂盒具有灵敏度高、特异性强、高精确度、高准确度、对仪器设备要求低、试剂保存期长、自动化程度高、无放射性同位素污染等优点，可在动物源性食品及饲料产品检测中发挥重要作用。
附图说明
图1为检测β-兴奋剂的标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1β-兴奋剂特异性抗体的制备
克伦特罗、沙丁胺醇、特布他林、马布特罗、溴布特罗、妥布特罗和西布特罗各取0.1mol，溶于50mlPBS(0.01mol/L)溶液中，充分溶解后逐滴加入250μL25％的戊二醛，反应30min。另称取多聚赖氨酸(或者牛血清白蛋白，或者鸡丙种球蛋白，或者卵清蛋白)，溶于13mLPBS(0.01mol/L)中逐滴加入上述反应液，室温下搅拌反应3h。
取50cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水中冲洗3min，保存在4℃的去离子水中备用。
将人工抗原混合液移入透析袋中，用2x2L的0.01MpH7.4的PBS缓冲液和2x2L的去离子水透析3天。最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，得到偶联有7种β-兴奋剂的特异免疫原。
免疫动物选用新西兰大白兔，免疫前耳缘静脉取血5-10mL，作为阴性血清对照。初次免疫将0.5mg的特异免疫原与等量弗氏完全佐剂混合，完全乳化后，采用背部多点皮下注射新西兰大白兔，三周后取相同剂量免疫原与弗式不完全佐剂混合后同法进行加强免疫，以后每两周加强免疫一次，共免疫6次后，血清效价达到很高时，最后一次加强免疫，4d后颈动脉采全血。
采全血后，3000rpm离心20min，取上层抗血清，与等量甘油混合后保存于-20℃冰箱内。
将5mL抗血清与等体积的生理盐水混合后，边搅拌边逐滴加入10mL的饱和硫酸铵。4℃冰箱静置过夜。第二天，4000rpm离心20min，弃上清。沉淀少量生理盐水重新溶解后，放入透析袋中于4℃进行透析，以出去残留的硫酸铵。透析完后冷冻干燥，得到纯化的的β兴奋剂特异抗体，与等量甘油混合后-20℃冰箱保存备用。
实施例2β-兴奋剂抗血清效价的测定
采用直接ELISA法进行测定。酶标反应板包被β兴奋剂特异抗体、洗涤、封闭，并以同样的稀释度的阴性血清为对照，第1行1至12孔依次加入倍比稀释的β兴奋剂过氧化物酶结合物，均为100uL/孔，22-23℃温育10分钟；再加入辣根过氧化物酶(ARP)底物100uL/孔，经过10分钟孵育，终止反应后测定OD450值。抗体的OD450值与相同稀释度的阴性血清OD450值之比大于2的最大稀释度定为β兴奋剂特异抗体的效价。经测定β兴奋剂特异抗体的效价为1000。
实施例3棋盘滴定法确定抗体包被浓度和酶标抗原工作浓度
通过棋盘滴定法对IC50值、最大吸光度值和样品添加回收率的比较，确定抗体的包被浓度和酶标抗原的工作浓度。
表1最大吸光度值(OD值)比较
注：带“-”的表示OD值超出仪器读数范围(＞4.0)。
表2IC50(ng/mL)比较
表30.5ng/mL样品添加回收率(％)比较
由表1-3中可见，随着包被β兴奋剂特异抗体浓度的降低，最大吸光值降低，IC50值在一定范围内也随之降低。经测定包被抗体按4.0×103倍稀释，其IC50浓度、回收率和吸光度值均较好。因此，选择4.0×103倍稀释的包被抗体进行包被。β兴奋剂酶标物在2.5×104倍稀释时，最大吸光度值、IC50一直浓度和样品测定结果均处于最佳状态。
实施例4酶标板的制备
用包被缓冲液将β兴奋剂特异性抗体进行4000倍稀释，每孔加入100ul，37℃包被2h，本实例所用包被液为含1％卵清蛋白的磷酸盐缓冲液。倾去包被液，用清洗液洗涤4次，每次1min，拍干。在每个孔中加入150μl封闭液，37℃封闭2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。
实施例5检测β兴奋剂的酶联免疫试剂盒的组建
(1)包被有β兴奋剂特异性抗体的酶标板1块(12条×8孔，可拆分)；
(2)β兴奋剂酶标物冻干粉；
(3)β兴奋剂标准品溶液：6×1mL/管(0ng/mL，0.1ng/mL，0.3ng/mL，0.9ng/mL，2.7ng/mL，8.1ng/mL)；
(4)显色剂：过氧化氢或过氧化脲、邻苯二胺或四甲基联苯胺与稳定剂K按5∶5∶1(体积比)混合而成；
(5)酶标物稀释液：为含酶稳定剂AH和酶保护剂KEN的磷酸盐缓冲液；
(6)样品稀释液：为含0.1％BSA的磷酸盐缓冲液；
(7)清洗液：为含0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液；
(8)终止液：为2mol/L的盐酸溶液；
实施例6检测方法
β-兴奋剂类的一步法酶联免疫检测方法，按照如下步骤进行：
(1)将试剂于盒外充分恢复至室温，恢复时间为1-5小时；
(2)预先进行编号，标记B0、标准品和样品的位置，进行双孔检测；
(3)从包被有β-兴奋剂特异性抗体的酶标板上取下所需数量的微孔，将多余的微孔重新密封并放回2～8℃保存；
(4)将酶标物、浓缩样品稀释液、清洗液根据稀释倍数用蒸馏水配制成工作液；
(5)在B0孔中加入50μL0.0ng/mL标准品溶液，在各标准孔中加入50μL的标准品溶液，在各样品孔中加入50μL样品溶液；
(6)在所有孔中加入100μL的酶标物，晃动反应1-10s，室温下孵育30min；
(7)倒掉微孔中的液体，在所有微孔中加满清洗液，用微量移液器在每个微孔中加入100μL显色剂，晃动酶标板使之混匀；
(8)室温下显色10min，每孔中加入100μL终止液，混匀；
(9)在450nm下检测吸光度，分析计算检测结果。
实施例7试剂盒灵敏度实验
评价竞争性酶联免疫吸附实验反应灵敏度的方法，常用的有IC50和检测限(下限)。分别测定20次标准曲线的IC50，确定该值的浮动范围。一定条件下，试剂盒方法检测限符合正态分布的规律，取尿液、饲料、奶汁和奶粉以及肌肉20个空白样本通过试剂盒测定的光密度在标准曲线上对应的β兴奋剂含量的平均值(x)和标准差(s)表示，检测限＝x+3s。
表4IC50结果统计表
由表4可见，统计IC50二十次测定结果，IC50平均值为0.542ng/ml，浮动范围在IC50变动范围为0.435～0.614μg/L之间。经试验确定猪尿的检测限为0.6μg/L，猪肉的检测限为0.4μg/kg，猪肝的检测限为0.5μg/kg，饲料的检测限为6.8μg/kg。
实施例8试剂盒重复性和再现性实验
重复性即实验室内的变异程度。以猪尿样品为例，将空白样品以定量限0.5μg/kg、两倍定量限1μg/kg进行添加，每个浓度各五个平行，并抽取3批试剂盒，每批试剂盒测定同一份样品3次。结果：
尿液中各交叉物添加浓度在1μg/L～2μg/L之间，回收率范围如下：
克伦特罗：98％～127％之间，批间变异系数小于15％；
沙丁胺醇：89％～125％之间，批间变异系数小于5％；
特布他林：47.5％～72％之间，批间变异系数小于15％；
马布特罗：85％～119％之间，批间变异系数小于18％；
溴布特罗：126％～152％之间，批间变异系数小于10％；
妥布特罗：108％～171％之间，批间变异系数小于10％；
西布特罗：97.5％～120％之间，批间变异系数小于5％；
再现性即实验室间的变异程度。对同一鱼肉样品，分别在不同地点的实验室对随机抽取的同一批次的三个试剂盒进行添加实验，计算得到的加标平均回收率分别为98％、88％和85％，板间、批内和批间变异系数均小于15％，说明此试剂盒再现性良好。
实施例9试剂盒特异性实验
试剂盒的特异性可用药物的交叉反应率来表示。交叉反应率即引起50％抑制的标准物浓度与类似物引起50％抑制的浓度值之比。本实验分别测定了该试剂盒与沙丁胺醇、妥布特罗、溴布特罗、克伦特罗、西布特罗、马布特罗、特布他林、班布特罗、西玛特罗、氯丙那林、喷布特罗、福莫特罗、非诺特罗、齐帕特罗、沙丁胺醇等原型药及其代谢物的交叉反应率，结果如表5所示。
表5交叉反应
实施例10试剂盒稳定性实验
采用冷热性加速实验确定试剂盒的稳定性。将三批试剂盒置于37℃恒温箱中1天、3天、6天，随机取6盒试剂盒检测相关技术指标。从三批试剂盒中抽出6个试剂盒，每盒均做4℃6个时间段(第0、1、2、3、6、7月)的保存试验。每个时间点分别取出1个试剂盒，每个试剂盒做5条曲线、5个样品重复，测定其IC50抑制浓度(灵敏度)、检测限、标准品板内变异系数和回收率等相关技术指标。
冷热稳定性实验结果显示：该试剂盒在37℃经6天的保存试验，OD值有所下降，但零标准吸光度值仍在1.0以上。IC50均在0.10～0.28ng/ml之间，阳性回收率在70％～102.7％；标准品板内变异系数在15％以下。试剂盒保存条件为2～8℃，经过近7个月的测定，发现试剂盒从生产之起到第六个月，各项指标均符合《农业部文件》农医发「2005」17号附件2试剂盒备案参考评判标准的规定。到第7个月时检测结果发现0标准吸光度值在1.4左右，阳性样品回收率有下降趋势但幅度不是很大。
Claims (7)
1.一种检测β-兴奋剂类的一步法酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：β-兴奋剂特异性抗体、包被有β-兴奋剂特异性抗体的酶标板、β-兴奋剂辣根过氧化物酶标记物、克伦特罗标准品、酶标物稀释液、显色剂、清洗液、终止液和浓缩样品稀释液；
所述β-兴奋剂特异性抗体是以特异免疫原免疫动物制得，所述特异免疫原是将克伦特罗、沙丁胺醇、特布他林、马布特罗、溴布特罗、妥布特罗和西布特罗通过戊二醛法交联到载体蛋白上制成。
2.根据权利要求1所述一种检测β-兴奋剂类的一步法酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述显色剂为过氧化氢或过氧化脲，邻苯二胺或四甲基联苯胺与稳定剂K按体积比5∶5∶1混合而成的溶液。
3.根据权利要求1所述一种检测β-兴奋剂类的一步法酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的酶标物稀释液为含酶稳定剂AH和酶保护剂KEN的磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求1所述一种检测β-兴奋剂类的一步法酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的终止液为2mol/L的盐酸溶液。
5.根据权利要求1所述一种检测β-兴奋剂类的一步法酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的浓缩样品稀释液为含1％BSA的5倍浓缩磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求1所述一种检测β-兴奋剂类的一步法酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述载体蛋白为多聚赖氨酸、牛血清白蛋白、鸡丙种球蛋白人血丙种球蛋白、或卵清蛋白。
7.根据权利要求1所述一种检测β-兴奋剂类的一步法酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述动物为兔、鼠或羊。
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| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Xu Huali Inventor after: Li Liang Inventor after: Zhang Mingzhou Inventor after: Wang Minzi Inventor after: Wei Jianliang Inventor after: Cheng Ye Inventor after: Xu Huali, Li Liang, Zhang Mingzhou, Wang Minzi, Wei Jianliang, Cheng ye, Ying Yongfei Inventor before: Xu Huali Inventor before: Li Liang Inventor before: Zhang Mingzhou Inventor before: Wang Minzi Inventor before: Wei Jianliang Inventor before: Cheng Ye |
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| COR | Change of bibliographic data | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: One-step method enzyme-linked immunosorbent assay method and kit for detection of beta-excitants Effective date of registration: 20170316 Granted publication date: 20151125 Pledgee: The Agricultural Bank of the West Branch of Hangzhou Chinese Limited by Share Ltd Pledgor: HANGZHOU DNA SCI-TECH CO., LTD. Registration number: 2017330000021 |
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| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20200904 Granted publication date: 20151125 Pledgee: The Agricultural Bank of the West Branch of Hangzhou Chinese Limited by Share Ltd. Pledgor: Zhejiang Dean Biotechnology Co.,Ltd. Registration number: 2017330000021 |
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| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |