CN202735351U - 一种盐酸克伦特罗酶联免疫检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本实用新型公开了一种检测饲料、动物尿液以及动物组织等样品中盐酸克伦特罗残留量的酶联免疫快速检测试剂盒。本试剂盒包括酶标板、标准溶液、浓缩洗涤液、盐酸克伦特罗标记HRP溶液、底物A液、底物B液、终止液、封板膜、说明书及质检报告。本试剂盒采用直接竞争ELISA方法，在酶标板的微孔上预包被抗盐酸克伦特罗单克隆抗体，样品或标准溶液中的盐酸克伦特罗和HRP标记的盐酸克伦特罗竞争结合酶标板中抗盐酸克伦特罗单克隆抗体，洗涤后用H₂O₂-TMB底物系统显色，样品吸光度值与其所含盐酸克伦特罗量成负相关，与标准曲线比较即可得出样品中盐酸克伦特罗含量。本实用新型操作方便、灵敏度高、成本低，可实现样本的高通量检测。

Description

一种盐酸克伦特罗酶联免疫检测试剂盒

技术领域

本实用新型涉及一种试剂盒，尤其涉及一种盐酸克伦特罗酶联免疫检测试剂盒。

背景技术

盐酸克伦特罗是一种人工合成的β-肾上腺素兴奋剂，简称克伦特罗，盐酸克伦特罗分子式为C₁₂H₁₈C₁₂N₂O·HCl，分子量为313.7，熔点为174～175.5℃，无色微结晶粉末，易溶于水，甲醇，乙醇，微溶于氯仿，不溶于苯。

克伦特罗能促进动物生长，减少脂肪率，使胴体瘦肉率增加10％以上。所以，克伦特罗作为生长促进剂被广泛应用于畜禽生长中。实际上，克伦特罗作为饲料添加剂的用量是治疗剂量的5～10倍。消费者因食用克伦特罗残留食品而中毒的事件，国内外已发生多起。各国已禁止将克伦特罗作为生长促进剂使用，我国农业部第235号《动物性食品中兽药最高残留限量》公告中规定克伦特罗及其盐、酯在所有食品动物中均禁止使用，但屡禁不止。因此，除了控制源头，加强法规的宣传，禁止在饲料中掺入克伦特罗外，加强对上市动物食品的检测势在必行。

目前，国内外克伦特罗的检测方法主要有气相色谱法、气-质联用分析法，高效液相色谱法、液-质联用分析法、毛细管电泳法等。利用色谱技术原理的几大检测方法具有准确度高、重复性好、假阳性率低等优点，但整个操作过程繁琐、所需仪器昂贵、操作人员需要专业培训，因此不利于基层推广使用。

实用新型内容

本实用新型的目的在于针对上述问题，提供一种用于盐酸克伦特罗残留量检测的酶联免疫试剂盒，其简化检测步骤，节约检测成本，缩短检测时间，并适合于大范围推广使用。

为达此目的，本实用新型采用以下技术方案：

一种盐酸克伦特罗酶联免疫检测试剂盒，试剂盒包括盒体及盒体内设置的1块酶标板、11瓶试剂、3张封板膜、所述酶标板的微孔中预包被了抗盐酸克伦特罗单克隆抗体，所述的11瓶试剂分别为6瓶盐酸克伦特罗标准溶液、1瓶10×浓缩洗涤液、1瓶盐酸克伦特罗标记HRP溶液、1瓶底物A液、1瓶底物B液、1瓶终止液。

所述的酶标板为96孔酶标板，其由聚苯乙烯制成，置于铝箔袋中，且酶标板由支撑架与可拆卸设置在支撑架上的12条酶标条构成，每条酶标条上有8个微孔。

进一步的，6瓶盐酸克伦特罗标准溶液浓度分别为0μg/L、0.1μg/L、0.3μg/L、0.9μg/L、2.7μg/L、8.1μg/L，每瓶1.0mL；1瓶10×浓缩洗涤液，30mL；1瓶盐酸克伦特罗标记HRP溶液，7mL；1瓶底物A液，7mL；1瓶底物B液，7mL；1瓶终止液，7mL。

所述的盒体内设置有用于装载试剂瓶的泡沫垫，所述泡沫垫上开有下凹瓶位，试剂瓶设置于下凹瓶位内，所述的泡沫垫包括3层塑料泡沫层，且泡沫垫上还开有预留孔。

所述的盒体为硬纸盒体，所述的封板膜为塑料硬膜，其大小与酶标板横切面的大小一致。

本实用新型的有益效果为：本实用新型成本低、结构简单，能快速、简便、灵敏、准确地用于饲料、动物尿液及动物组织等样品中盐酸克伦特罗残留量的检测。

附图说明

下面根据附图和实施例对本实用新型作进一步详细说明。

图1为本实用新型盒体的结构示意图。

图2为本实用新型泡沫垫的俯视图。

图3为本实用新型酶标板的结构示意图。

图4为本实用新型试剂瓶的结构示意图。

图中：

1、盒体；2、下凹瓶位；3、泡沫垫；4、支撑架；5、微孔；6、酶标条；7、预留孔；8、PE塑料瓶；9、玻璃瓶；10、棕色玻璃瓶。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本实用新型的技术方案。

于本实施例中，本实用新型所述的一种盐酸克伦特罗酶联免疫检测试剂盒，试剂盒包括盒体1及盒体1内的1块酶标板、11瓶试剂、3张封板膜、所述酶标板的微孔中预包被了抗盐酸克伦特罗单克隆抗体，所述的11瓶试剂分别为6瓶盐酸克伦特罗标准溶液、1瓶10×浓缩洗涤液、1瓶盐酸克伦特罗标记HRP溶液、1瓶底物A液、1瓶底物B液、1瓶终止液。

进一步的，6瓶盐酸克伦特罗标准溶液浓度分别为0μg/L、0.1μg/L、0.3μg/L、0.9μg/L、2.7μg/L、8.1μg/L，每瓶1.0mL；1瓶10×浓缩洗涤液，30mL；1瓶盐酸克伦特罗标记HRP溶液，7mL；1瓶底物A液，7mL；1瓶底物B液，7mL；1瓶终止液，7mL。

如图1所示，泡沫垫3置于试剂盒盒体1的底部，试剂盒的所有试剂瓶分别插入泡沫垫3相应的下凹瓶位2中，这样，试剂瓶摆放有序，同时，泡沫垫3还能起到抗震作用。

如图2所示，泡沫垫3上开有三种不同尺寸的下凹瓶位2，下凹瓶位2数量共十一个，泡沫垫上还设置有预留孔7。在预留孔7中设置有可拆卸的泡沫，当预留孔7不要使用时，预留孔7中的泡沫保留着，这样也不影响试剂盒美观。

如图3所示，酶标板为96孔酶标板，其由聚苯乙烯制成，置于铝箔袋中，且酶标板由支撑架4与可拆卸设置在支撑架4上的12条酶标条6构成，每条酶标条6上有8个微孔5。本实用新型涉及到的微孔5中预包被了抗盐酸克伦特罗单克隆抗体。

如图4所示，半透明的PE塑料瓶8配以半透明的瓶盖用于盛装浓缩洗涤液，棕色的玻璃瓶9配以黑色瓶盖用于盛装底物A液、底物B液以及盐酸克伦特罗标记HRP溶液，透明的玻璃瓶9配以白色瓶盖用于盛装终止液，棕色玻璃瓶10配以黑色瓶盖用于盛装盐酸克伦特罗标准溶液。

采用本实用新型所述的盐酸克伦特罗酶联免疫检测试剂盒进行检测的步骤为：

一、样品的提取

(1)试剂的配制

①0.01mol/L的PBS(pH为5.5～6.0)

称取8g氯化钠，2.9g十二水合磷酸氢二钠，0.2g氯化钾，0.2g磷酸二氢钾，加超纯水溶解，调pH至5.5～6.0，定容至1000mL。

②0.1mol/L的HCl和0.05mol/L的HCl

量取1mL浓盐酸(36％～38％)，加超纯水定容至120mL，即为0.1mol/L的HCl；将0.1mol/L的HCl用超纯水稀释1倍，即为0.05mol/L的HCl。

③1mol/L的NaOH

称取4g氢氧化钠，加超纯水溶解后定容至100mL。

④0.5mol/L的磷酸二氢钾缓冲液(pH为3.0)：

称取6.8g磷酸二氢钾，加入80mL超纯水溶解后，用磷酸调pH至3.0，加超纯水定容至100mL。

⑤4％NaCl溶液

称取4g氯化钠，加超纯水溶解后定容至100mL。

⑥4％NaCl-0.1mol/L的HCl混合液

量取70mL的4％NaCl溶液、20mL摩尔浓度为0.1mol/L的HCl溶液和10mL超纯水混匀。

(2)样品的处理

①动物尿液样品的处理(稀释倍数为1倍)

尿液不用处理，直接取50μL进行检测，如果尿液混浊，实验前过滤或进行10000rpm离心，时间为5分钟，取50μL上清进行检测。

②肌肉、肝脏等动物组织样品的处理

a、简易法(稀释倍数为4倍)

称取2g±0.02g均质样品于50mL离心管中，加入6mL的4％NaCl-0.1mol/L的HCl混合液，最大转速振荡3分钟，室温静置20分钟；

3000g离心，时间10分钟；

取1mL上清液，加入约20μL摩尔浓度为1mol/L的NaOH，调pH至5.5～6.0，取50μL进行检测。

b、标准法(稀释倍数为1倍)

称取5g±0.05g均质样品于50mL离心管中，加入25mL摩尔浓度为0.05mol/L的HCl，振荡混匀20分钟；

取6g均质物(相当于1g样品)于10mL离心管中，在10～15℃下、4000rpm离心15分钟；

取上清到另一试管中，加入300μL摩尔浓度为1mol/L的NaOH，混合10分钟；

加入4mL摩尔浓度为0.5mol/L且pH为3.0的磷酸二氢钾缓冲液，混合后于4℃条件下放置至少1.5h或过夜；

在10～15℃、4000rpm离心15分钟，吸取全部上清，室温放置，待回温后用RIDA C18柱纯化；

附：RIDA C18柱纯化

用3mL无水甲醇洗涤C18固相萃取柱；

用2mL摩尔浓度为0.05mol/L且pH为3.0的磷酸二氢钾缓冲液淋洗(注意：控制流速在每秒时间1滴)；

将处理好的样品液全部过柱(注意：控制流速在每分钟15滴)，再用2mL摩尔浓度为0.05mol/L且pH为3.0磷酸二氢钾缓冲液淋洗萃取柱，用洗耳球将柱吹干；

用2mL无水甲醇洗脱，收集洗脱液，于50～60℃下用氮气缓缓吹干。

用1mL摩尔浓度为0.01mol/L且pH为5.5-6.0的PBS溶解残留物，取50μL进行检测。

③饲料样品的处理(稀释倍数为50倍)

称取2g±0.02g粉碎饲料样品于50mL离心管中，加入2mL摩尔浓度为1mol/L的HCl，16mL超纯水，混匀，最大转速振荡15分钟；

5000rpm离心10分钟，取9mL上清于15mL离心管中，加入1mL摩尔浓度为1mol/L的NaOH，检测pH是否在5.5～6.0之间，若不在此区间，用1mol/L的NaOH或者1mol/L的HCl调节pH至5.5～6.0之间，取200μL以上溶液加入至800μL摩尔浓度为0.01mol/L且pH为5.5-6.0的PBS中混匀后，取50μL进行ELISA检测。

二、试剂盒操作步骤

(1)试剂准备：将10×浓缩洗涤液和蒸馏水或去离子水按1∶9充分混匀，即为1×洗涤液。

(2)编号：将盐酸克伦特罗标准溶液和待测样品对应微孔5按序编号，建议每个标准溶液和待测样品均做重复孔。

(3)加样：加入标准溶液或样品50μL，然后每孔分别加入盐酸克伦特罗标记的HRP溶液50μL。

(4)温育：轻轻振荡混匀，用封板膜封板后置于室温(20～25℃)反应30分钟。

(5)洗涤：小心揭开封板膜，每孔加入1×洗涤液250μL洗涤酶标板，连续洗板3次，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头戳破)。

(6)显色：将底物A液和底物B液按1∶1混合，振荡混匀，每孔加入100μL，室温(20～25℃)避光显色15～20分钟。

(7)测定：每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，5分钟内测定450nm处吸光度值。

三、结果判定

(1)计算B/B₀

所获得的标准溶液或待测样品的吸光度值除以0号标准溶液的吸光度值(B₀)再乘以100％，即百分吸光度值。

百分吸光度值(％)＝(B/B₀)×100％

式中：B-标准溶液或待测样品溶液的吸光度值

B₀-0号标准溶液的吸光度值

(2)绘制标准曲线，计算样品中盐酸克伦特罗浓度

以盐酸克伦特罗标准溶液浓度为X轴，对应的百分吸光度值为Y轴，在半对数坐标纸上绘制标准曲线。相对应每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。也可以用回归方程法，计算出样品中盐酸克伦特罗的浓度。

盐酸克伦特罗实际含量(ppb)＝C×D

式中：

C：稀释后样品提取液中盐酸克伦特罗含量(μg/L)

D：样品稀释倍数

为获得样品中盐酸克伦特罗的实际含量(ppb)，从标准曲线上读出的浓度值应当乘以相应的稀释倍数。

四、试剂盒使用注意事项

(1)试剂盒保存于2～8℃，不能冷冻，未用的酶标板放回原铝箔袋密封后2～8℃存放，并尽快使用，底物溶液要避光保存。

(2)使用之前，将样品及所需试剂的温度平衡至20～25℃，否则可能导致后面检测吸光度值偏低。试剂使用完后应立即放回2～8℃冰箱。

(3)不要使用过期的试剂盒，不同批号试剂不能混用。

(4)洗板拍干后应立即进行下一步操作，如果洗板后出现板孔干燥，会导致标准曲线线性不好。

(5)反应终止液为2mol/L的硫酸，应避免与皮肤及衣物接触。

(6)底物溶液如果变蓝表示已经变质，不能使用。

(7)0号标准溶液的吸光值＜0.6时，表示试剂盒已经变质，不能使用。

以上实施例只是阐述了本实用新型的基本原理和特性，本实用新型不受上述实施例限制，在不脱离本实用新型精神和范围的前提下，本实用新型还有各种变化和改变，这些变化和改变都落入要求保护的本实用新型范围内。本实用新型要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (6)

1.一种盐酸克伦特罗酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：试剂盒包括盒体及盒体内设置的1块酶标板、11瓶试剂、1张说明书、一份质检报告、3张封板膜、所述酶标板的微孔中预包被了抗盐酸克伦特罗单克隆抗体，所述的11瓶试剂分别为6瓶盐酸克伦特罗标准溶液、1瓶10×浓缩洗涤液、1瓶盐酸克伦特罗标记HRP溶液、1瓶底物A液、1瓶底物B液、1瓶终止液。

2.根据权利要求1所述的盐酸克伦特罗酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述的酶标板为96孔酶标板，其由聚苯乙烯制成，置于铝箔袋中，且酶标板由支撑架与可拆卸设置在支撑架上的12条酶标条构成，每条酶标条上有8个微孔。

3.根据权利要求1所述的盐酸克伦特罗酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：6瓶盐酸克伦特罗标准溶液浓度分别为0μg/L、0.1μg/L、0.3μg/L、0.9μg/L、2.7μg/L、8.1μg/L，每瓶1.0mL；1瓶10×浓缩洗涤液，30mL；1瓶盐酸克伦特罗标记HRP溶液，7mL；1瓶底物A液，7mL；1瓶底物B液，7mL；1瓶终止液，7mL。

4.根据权利要求1所述的盐酸克伦特罗酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述盒体内设置有用于装载试剂瓶的泡沫垫，所述泡沫垫上开有下凹瓶位，试剂瓶设置于下凹瓶位内。

5.根据权利要求4所述的盐酸克伦特罗酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述的泡沫垫包括3层塑料泡沫层，且泡沫垫上还开有预留孔。

6.根据权利要求1或4所述的盐酸克伦特罗酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述的盒体为硬纸盒体，所述的封板膜为塑料硬膜，其大小与酶标板横切面的大小一致。

Images