CN203178285U - 赛庚啶残留快速检测试纸条 - Google Patents

Abstract

本实用新型提供了一种赛庚啶残留快速检测试纸条。试纸条底层为支撑层，中间层吸附层固定在支撑层上，吸附层从测试端依次为纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中在纤维素膜层上有用偶联赛庚啶的载体蛋白溶液印制的直线式检测印迹，用羊抗鼠IgG溶液印制的直线式对照印迹，检测印迹和对照印迹平行组合排列为“‖”。试纸条具有以下优点：特异性强、敏感性高、操作简便、快速，结果显示形象、直观、准确，并且成本低，应用范围广，易于推广应用。

Description

赛庚啶残留快速检测试纸条

技术领域

本实用新型涉及一种检测兽药的器具，特别是涉及一种赛庚啶残留快速检测试纸条。

背景技术

赛庚啶（Cyproheptadine，分子式：C₂₁H₂₁N），又称二苯环庚啶，是一种抗组胺药，具有抗5-HT、阻断H₁受体及抗胆碱作用，主要用于治疗荨麻疹、湿疹、接触性皮炎、皮肤瘙痒、过敏性鼻炎等过敏性疾病，也可用于改善患者的食欲。

赛庚啶是一种人用处方药，但目前在国内某些饲料产品中发现添加，分析原因可能是通过促进动物食欲以达到增重的目的。食用含有赛庚啶残留的动物源性产品，对人体健康具有一定的危害性，对儿童的作用更为明显，高浓度可直接引发昏迷、呼吸急促、全身无力等中毒症状，严重者则直接导致儿童死亡。因此，根据欧盟指令2001/82的要求，赛庚啶禁止作为兽药在动物中使用；我国农业部也于2010年12月27日发布1519号公告，禁止在饲料和动物饮水中使用赛庚啶。

目前对赛庚啶的研究主要集中在医药领域，仅有饲料中赛庚啶的检测标准方法，而动物尿液和动物组织中残留的相应检测方法研究报道较少，且多为色谱分析方法。色谱技术是非常有效、准确、敏感的方法，但是待检样品需经一系列的预处理，繁琐费时，从样品预处理到得出检验结果至少需2~3天时间，检测费用很高；另一方面这种检测方法还必须有昂贵的仪器设备，只有特定的专业人员才能应用，而且每次检测的样品有限，不适应大批样品的筛查，严重阻碍了该检测方法的推广应用，更不适合于现场检验。因此在实际生产中亟需一种快速检测赛庚啶的方法。目前各级食品检验部门，尤其是外贸出口单位，加强了赛庚啶的检测力度，以确保人民群众的动物性食品安全。因此研制灵敏、快速、准确的赛庚啶检测方法有着十分重要的意义。

实用新型内容

本实用新型的目的是提供一种特异、敏感、快速、简便的赛庚啶残留快速检测试纸条。

本实用新型的技术方案：

一种赛庚啶残留快速检测试纸条，底层为支撑层，中间层吸附层固定在支撑层上，其特征在于，吸附层从测试端依次为纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中在纤维素膜层上有用偶联赛庚啶的载体蛋白溶液印制的直线式检测印迹，用羊抗鼠IgG溶液印制的直线式对照印迹，检测印迹和对照印迹平行组合排列为“‖”，检测印迹位于靠近金标抗体纤维层的末端的一侧，对照印迹位于远离金标抗体纤维层的末端的一侧，金标抗体纤维层的四分之一至五分之一区域覆盖于纤维层之下。

支撑层是用不吸水的硬质塑胶条或硬纸条制成。

测试端纤维层用玻璃棉、尼龙膜、聚偏二氯乙烯膜或聚酯膜制成。

金标抗体纤维层用吸附赛庚啶金标抗体的玻璃棉制成，赛庚啶金标抗体为胶体金标记的赛庚啶单克隆抗体。

纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成。

吸水材料层用吸水纸制成。

本实用新型的赛庚啶残留快速检测试纸条具有以下优点：

（1）特异性强、灵敏度高。该试纸条以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无价健形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金对单克隆抗体特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。因此，本实用新型试纸条具有较高的特异性和灵敏度，对赛庚啶的检测灵敏度为10μg/L。

（2）操作简便、快速。使用快速检测试纸条时无需任何其他试剂，只要将样品前处理后用滴管滴入试纸条加样孔内，滴加2~3滴，加样后计时，5~10min内观察结果。

（3）结果显示形象、直观、准确。检测试纸以显示红色“|”及“‖”印迹作为阳性和阴性标记，即在纤维素膜上显示一条红色“|”印迹表示被检测样本液中赛庚啶的含量高于或等于试纸条对赛庚啶的最低检测限，显示两条红色“|”印迹表示被检测样本中不含赛庚啶或其含量低于试纸条对赛庚啶的最低检测限，结果判定形象、直观、准确、简单明了，不易出现误判。

（4）成本低、投资少。使用本实用新型试纸条，不需另配仪器设备及其它试剂，随时随地进行检测，费用低廉，可节省大量贵重仪器及设备费用。

（5）应用范围广，便于推广应用。试纸条操作简单，能较好满足不同层次人员的需要，如专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、畜产品价格、集约化养殖到个体养殖等，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。

附图说明

图1 赛庚啶残留快速检测试纸条结构示意图

图2a、2b、2c赛庚啶残留快速检测试纸条结果判定图

具体实施方式

一、赛庚啶残留快速检测试纸条的结构（图1）

图中1为测试端纤维层，用玻璃棉制成，2为吸附有赛庚啶金标抗体的纤维层，用玻璃棉制成，3为纤维素膜层，采用硝酸纤维素膜，4为吸水材料层，用吸水滤纸制成，7为支撑层，用塑胶条制成，将编号1、2、3、4各层从左至右依次粘贴固定在支撑层6上，金标抗体纤维层的四分之一区域覆盖于测试端纤维层之下，金标抗体纤维层2的末端与纤维素膜层3的始端相连，纤维素膜层3的末端与吸水材料层4的始端相连，测试端纤维层1的始端与支撑层7的始端对齐，吸水材料层4的末端与支撑层7的末端对齐。在纤维素膜层3上，5为用偶联赛庚啶的载体蛋白溶液印上检测印迹“|”，6为用羊抗鼠IgG溶液印上对照印迹“|”，两印记平行排列形成组合印迹带“‖”。

二、赛庚啶残留快速检测试纸条的制备

制备赛庚啶残留快速检测试纸条，首先需制备偶联赛庚啶的载体蛋白和金标抗体，从而制备检测印迹和金标抗体纤维层；其次需制备羊抗鼠Ig抗体，用于制备对照印迹。以下是相关材料的制备方法：

1、赛庚啶半抗原的制备

（1）称取0.55g去甲基赛庚啶和1mL吡啶溶于10mL二甲基亚砜（DMSO）中；

（2）称取0.39g溴乙酸叔丁酯溶于5mL DMSO后40℃下缓慢滴加入步骤（1）所述溶液中，继续反应4小时后蒸除溶剂，通过柱层析分离获得赛庚啶半抗原中间体；

（3）在步骤（2）制备得到的赛庚啶半抗原中间体中加入20mL DMSO和5mL甲酸，室温反应20小时后蒸除溶剂，乙醇-水体系中重结晶得到目标半抗原，经氢谱实验鉴定，结构正确。

2、赛庚啶半抗原与载体蛋白的偶联

将赛庚啶半抗原与牛血清白蛋白（BSA）采用活泼酯法进行偶联制备免疫抗原。

（1）称取20mg的赛庚啶半抗原溶于1mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中；

（2）取30mg碳化二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）用0.2mL水充分溶解后加入到半抗原溶液中，室温下搅拌反应24小时；

（3）称取50mg BSA溶于3.8mL CB（pH 9.6）溶液中，将步骤（2）反应后的溶液逐滴缓慢加入到BSA-CB溶液中，并于室温下搅拌反应24小时；

（4）将经步骤（3）反应后的溶液装于透析袋，在4℃用0.01mol/L的PBS溶液透析72小时，期间每天换透析液3次，即得到目的产物，分装后-20℃保存。

将赛庚啶半抗原与卵清蛋白（OVA）采用同样的方法进行偶联制备包被抗原。

3、抗赛庚啶单克隆抗体的制备

（1）动物免疫：将免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。

（2）细胞融合和克隆化：取产生特异性抗体的Balb/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP20融合，采用间接竞争酶联免疫分析方法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，得到并建立产单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

（3）细胞冻存和复苏：取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

（4）单克隆抗体的制备与纯化：采用体内诱生法，将Balb/c小鼠（8周龄）腹腔注入灭菌石蜡油，7~14天后腹腔注射杂交瘤细胞，7~10天后采集腹水。经辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，纯度经SDS-PAGE电泳鉴定，小瓶分装，-20℃保存。

4、赛庚啶金标抗体和金标抗体玻璃棉的制备

（1）胶体金的制备

用双蒸去离子水将1%氯金酸稀释成0.01%（质量分数），取100ml置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入1.5ml 1%柠檬酸三钠，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的酒红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4℃保存。制备良好的胶体金用肉眼观察是清亮透明的，没有混浊，液体表面无漂浮物，在日光下观察胶体金的颜色为酒红色。

（2）赛庚啶金标抗体的制备

在磁力搅拌下，用0.2mol/L碳酸钾调节胶体金的pH至7.2（不同抗体的pH标记范围在7~8之间，可以变化），按每毫升胶体金溶液中加入抗体20~50μg的标准向胶体金溶液中加入赛庚啶单克隆抗体，搅拌混匀，室温静置10min后，加入10%BSA使其在胶体金溶液中的终浓度为1%，静置10min。12000r/min，4℃离心40min，弃上清液，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4℃环境中备用。

复溶缓冲液：每1L复溶缓冲液按照如下方法配制：将5mL吐温-80、1g酪蛋白和995mL磷酸盐缓冲液混合；其中，磷酸盐缓冲液的浓度为0.02mol/L，pH值为7.2。

（3）金标抗体玻璃棉的制备

将玻璃棉浸泡于含0.5% BSA、pH为7.2、0.5mol/L的磷酸盐缓冲液中，均匀浸湿1h，37℃烘3h备用。用Isoflow喷膜仪将制备好的金标抗体均匀喷涂在玻璃棉上，每1cm玻璃棉喷涂0.01ml金标抗体后，置于37℃环境中（湿度＜20%）60min取出，置于干燥环境（湿度＜20%）中保存备用。

5、羊抗鼠IgG的制备

以山羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫，得到羊抗鼠IgG，用于赛庚啶残留快速检测试纸条对照印迹的制备。

6、测试端纤维层的制备

将玻璃棉置于含0.5%牛血清白蛋白（体积百分含量）、pH7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液中浸泡2h，37℃烘2h备用。

7、纤维素膜的制备

包被过程：用磷酸缓冲液将赛庚啶与卵清蛋白的偶联物稀释到10mg/ml，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测印迹（T），包被量为1.0μg/cm²；用0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠IgG稀释到200μg/ml，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的对照印迹（C），包被量为1.0μg/cm²。将包被好的纤维素膜置于37℃条件下干燥2h，备用。

8、试纸条的组装

将测试端纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层、吸水材料层从左至右依次粘贴固定在支撑层上，金标抗体纤维层的四分之一区域覆盖于测试端纤维层之下，金标抗体纤维层的末端与纤维素膜层的始端相连，纤维素膜层的末端与吸水材料层的始端相连，测试端纤维层的始端与支撑层的始端对齐，吸水材料层的末端与支撑层的末端对齐，然后用机器切成3mm宽的小条，装在特制的塑料制卡中，形成试纸卡。

三、赛庚啶残留快速检测试纸条的应用

1、检测样品液的制备

取清亮尿样直接测定（如尿样浑浊必须通过过滤或3000g以上，室温（20~25℃/68~77℉）离心10min直至清亮），暂不使用的样本应冷冻保存。

2、检测操作方法

用吸管吸取待检样品溶液垂直滴加2~3滴于加样孔中，液体流动时开始计时，反应5~10min，判定结果。超过15min样品检测判读无效。

3、检测结果判断

赛庚啶在样本中的含量高于或等于试纸条对其的最低检测限时，赛庚啶单克隆抗体-胶体金标记物与赛庚啶结合，进而封闭金标抗体上的抗原结合位点，阻止金标抗体与纤维素膜上偶联赛庚啶的载体蛋白的检测印迹结合，不能显示检测印迹，而羊抗鼠IgG则可与金标抗体结合，形成对照印迹。阴性样本在检测过程中由于缺少抗原抗体竞争反应，检测印迹显色，同样羊抗鼠IgG也与金标抗体结合，形成对照印迹。如图2所示。

阴性：对照印迹（C）显示一条红色条带，检测印迹（T）同时也显示一条红色条带，判为阴性，如图2a所示。

阳性：对照印迹（C）显示一条红色条带，而检测印迹（T）不显色，判为阳性，如图2b所示。

无效：对照印迹（C）不显示出红色条带，则无论检测印迹（T）显示出红色条带与否，该试纸条均判为无效，如图2c所示。

Claims (8)

1.一种赛庚啶残留快速检测试纸条，底层为支撑层，中间层吸附层固定在支撑层上，其特征在于，吸附层从测试端依次为纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中在纤维素膜层上有用偶联赛庚啶的载体蛋白溶液印制的直线式检测印迹，用羊抗鼠IgG溶液印制的直线式对照印迹，检测印迹和对照印迹平行组合排列为“‖”。

2.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，金标抗体纤维层的二分之一至三分之一区域覆盖于纤维层之下。

3.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，检测印迹位于靠近金标抗体纤维层的末端的一侧，对照印迹位于远离金标抗体纤维层的末端的一侧。

4.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，支撑层是用不吸水的硬质塑胶条或硬纸条制成。

5.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，测试端纤维层用玻璃棉、尼龙膜、聚偏二氯乙烯膜或聚酯膜制成。

6.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，金标抗体纤维层用吸附赛庚啶金标抗体的玻璃棉制成，赛庚啶金标抗体为胶体金标记的赛庚啶单克隆抗体。

7.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成。

8.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，吸水材料层用吸水纸制成。