CN202486140U

CN202486140U - 检测四环素类抗生素的试剂盒

Info

Publication number: CN202486140U
Application number: CN 201120445128
Authority: CN
Inventors: 何方洋; 万宇平; 冯月君; 赵正苗; 陈炜玲; 余厚美; 刘福林; 张荃
Original assignee: Beijing Kwinbon Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing Kwinbon Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2011-11-11
Filing date: 2011-11-11
Publication date: 2012-10-10
Anticipated expiration: 2021-11-11

Abstract

本实用新型提供了一种检测四环素类抗生素的试剂盒，包括冻干有四环素类药物单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂条和试纸条，试纸条由底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜组成，所述反应膜上具有包被有四环素半抗原-载体蛋白偶联物构成的检测线印迹“|”和包被羊抗鼠抗抗体构成的质控线印迹“|”。本实用新型试剂盒具有便携性好，灵敏度高，检测时间短等特点，可以在四环素类抗生素残留检测中发挥重要作用。

Description

检测四环素类抗生素的试剂盒

技术领域

本实用新型涉及一种检测牛奶中四环素类抗生素的试剂盒。

背景技术

四环素类药物具有广谱高效的杀菌抗生功效，可以与大多数药物或饲料添加剂混用，已被广泛应用于畜禽生产中。但四环素类药物过量使用不可避免的造成了严重的药物残留，成为严重危害人类健康的食品安全隐患之一。为此世界各国对四环素类药物残留的检测十分关注。欧盟第675/92号令中初步规定在肌肉及牛奶中的四环素类化合物的总量不得超过100μg/kg，在肾脏，肝脏及鸡蛋中分别不得超过600μg/kg、300μg/kg及200μg/kg。日本肯定列表制度规定奶和鸡蛋中四环素类化合物的总量分别不得超过100ng/mL和400ng/mg。

关于四环素类药物残留的检测方法有微生物法、薄层色谱法、高效液相测定法、高效液相色谱-串联质谱法、毛细管电泳、电化学分析、化学发光、酶联免疫法、胶体金免疫法等，仪器检测方法对待测样品的前处理要求高，操作烦琐，需要精密仪器设备。免疫学方法具有快速、灵敏、特异性高等特点，是四环素类药物残留检测的有效方法之一。

实用新型内容

本实用新型的目的是提供一种灵敏度高、成本低、操作简单、检测时间短的检测四环素类抗生素的试剂盒。

本实用新型的试剂盒，其包括冻干的四环素类药物单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂条和试纸条，试纸条由底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜组成，所述反应膜上具有包被有四环素半抗原-载体蛋白偶联物构成的检测线印迹“︱”和包被羊抗鼠抗抗体构成的质控线印迹“︱”。样品吸收垫位于底板始端，吸水垫位于底板末端，检测线和质控线平行，质控线位于距离吸水垫始端与反应膜相连处5-8mm处，检测线位于距离质控线5-6mm处。试纸条样品吸收垫上检测端粘贴有保护膜，保护膜上有MAX标记线，微孔试剂条的反应孔上具有微孔塞。

为了便于运输和使用，试剂盒还有固定用具及固定于其中用于盛装微孔试剂条和试纸条的试剂桶，所述试剂桶上具有密封盖。

本实用新型试剂盒中试纸条底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；吸水垫为吸水纸；反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；保护膜为PE材质保护膜；试剂盒盒体为硬纸盒；试剂桶为塑料试剂桶；固定用具为硬质支撑材料。

本实用新型试剂盒具有如下有益效果：

1.灵敏度高。四环素类抗生素检测试剂盒以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无价健形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金对单克隆抗体特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。其中的四环素类药物单克隆抗体-胶体金标记物冻干在微孔试剂条中，在检测过程中，能够使金标抗体与待检样品液充分接触，充分反应，从而减少误差，增加整个体系的反应灵敏度。因此，本实用新型试剂盒具有较高的特异性和灵敏度。本试剂盒对四环素、强力霉素、金霉素、土霉素检测灵敏度分别为40μg/L、40μg/L、40μg/L、80μg/L。

2.操作简便快速。使用试剂盒检测时无需任何其它试剂，只要将待检样品溶液滴加于微孔试剂中，混匀后，孵育5min，将试纸标有MAX线标记端向下，插入孵育后的微孔试剂后计时，5min内观察结果。

3.显示检测结果形象、直观准确。检测是试纸条以显示红线色“︱”及“‖”印迹作为阳性和阴性标记，即在硝酸纤维素膜上显示一条红线“︱”印迹表示在被检测样本液中四环素类抗生素的含量高于等于试剂盒对四环素类抗生素药物的最低检测限，两条红线“‖”印迹表示在被检测样本中四环素类抗生素含量低于试剂盒对四环素类抗生素药物的最低检测限，结果判定形象、直观、准确、简单明了，不容易出现结果误判。

4.成本低，投资少。使用本实用新型试剂盒，不需另配仪器设备及其他试剂，使现场检测一步到位，成本低廉，投资少，见效快。

5.易于大范围推广应用。试剂盒操作简单，能较好满足乳品检测的需求，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。

附图说明

图1 为本实用新型试纸条结构示意图；

图2 为本实用新型试纸条俯视图；

图3 为本实用新型微孔试剂图；

图4a、4b、4c、4d 为本实用新型试纸条检测结果判定图；

图5 为本实用新型试剂桶结构示意图；

图6为本实用新型固定用具的俯视图；

图7为本实用新型盒体与固定用具的侧视图。

具体实施方式

一、四环素类抗生素检测试剂盒的组装制备

1）试纸条

样品吸收垫1、反应膜2、吸水垫3和保护膜7依次按顺序黏贴在所述底板6上，样品吸收垫位于底板始端，吸水垫位于底板末端，样品吸收垫的末端与反应膜始端相连，反应膜的末端与吸水垫相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐，试纸样品吸收垫上检测端粘贴有保护膜，保护膜上印有MAX标记线，检测线4包被有四环素半抗原-载体蛋白偶联物，质控线5包被有羊抗鼠抗抗体。

底板为PVC底板，样品吸收垫为吸滤纸，反应膜为硝酸纤维素膜，吸水垫为吸水纸，保护膜为PE材质保护膜。

2）微孔试剂条

微孔试剂条8具有微孔塞9，孔中冻干有四环素类药物单克隆抗体-胶体金标记物。

3）将1）试纸条和2）微孔试剂条装入具有密封盖的塑料试剂桶10，将塑料试剂桶放置于试剂盒盒体12内的固定用具11中。

二、试剂盒的使用

待检牛奶样品溶液滴加200μl到微孔试剂中，混匀后，孵育5min，将试纸标有MAX线标记端向下，插入孵育后的微孔试剂后计，5min内观察结果。

三、检测结果分析

四环素类抗生素在样本中的含量高于等于试剂盒对其的最低检测限时，四环素类药物单克隆-胶体金标记物与四环素类抗生素结合，金标抗体上的抗原结合位点被封闭，从而在检测区内因为竞争反应，不会与四环素半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带。阴性样本在检测过程中由于缺少抗原抗体竞争反应，将会在检测线和质控线上出现红色条带。如图4所示。

阳性：当质控线（C）显示一条红色条带，而检测线（T）不显色，试纸条以显示红线色“︱”，判为阳性，如图4a图所示。

阴性：当质控线（C）显示一条红色条带，检测线（T）同时也显示出一条红色条带，试纸条以显示红线色为“‖”，判为阴性，如图4b所示。

无效：当质控线（C）不显示出红色条带，则无论检测线（T）显示出红色条带与否，该试纸条判为无效，如图4c、4d所示。

四、检测试剂盒中用到的材料制备方法

1、四环素半抗原-载体蛋白偶联物的合成与鉴定

四环素类药物是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。

（1）四环素半抗原的制备

取1.1 g四环素，0.37 g 4-哌啶甲酸，2 ml 37%甲醛，在50 ml乙醇中混合，在60%微波强度下反应3-5分钟；除去溶剂后，反相柱层析分离，得到黄色固体。

（2）免疫原的制备

将四环素半抗原与牛血清白蛋白（BSA）偶联得到免疫原，具体步骤方法如下：

1）取10mg四环素半抗原用1ml 二甲基甲酰胺（DMF）溶解，冷却至10℃，加入10μl氯甲酸异丁酯，10℃搅拌反应30min，得到溶液A；

2）取40mg BSA用3ml 50mmol/L Na₂CO₃溶解，与溶液A混合，10℃反应4h，然后4℃过夜，得到反应液B；

3）将反应液B用0.01mol/L PBS 4℃透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质，得到免疫原，分装，于-20℃保存备用。

（3）包被原的制备

将四环素半抗原与卵清白蛋白（OVA）偶联得到包被原，具体步骤方法如下：

1）取18mg四环素半抗原溶解于2ml DMF中；

2）取25mg碳化二亚胺（EDC）用0.2ml水充分溶解后加入上述步骤1）的溶液中，室温下搅拌24 h，即可得到反应液A；

3）称取OVA 36mg，使之充分溶解在8ml PBS（pH 7.2）中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24 h，得到反应液B；

4）将反应液B用0.01mol/L PBS 4℃透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质，得到包被原。分装，于-20℃保存备用。

（4）四环素半抗原-载体偶联物的鉴定

将载体蛋白、四环素半抗原、四环素半抗原-载体蛋白偶联物用pH7.4的PBS配成0.5mg/mL的溶液，以0.01mol/L pH7.4 PBS调零，用紫外分光光度计在波长200-800 nm范围内扫描，得到载体蛋白、四环素半抗原、四环素半抗原-载体蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线，表明四环类药物与载体蛋白偶联成功。

2、四环素类药物单克隆抗体的制备

a. 动物免疫

将步骤1得到的免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。

b. 细胞融合和克隆化

取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按8:1（数量配比）比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选得到稳定分泌四环素类药物单克隆抗体的四环素类药物单克隆杂交瘤细胞株。

c. 细胞冻存和复苏

将杂交瘤细胞用冻存液制成1×10⁹个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

d. 单克隆抗体的制备与纯化

增量培养法：将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。

所述细胞培养基为向RPMI-1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20%（质量百分含量），使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2%（质量百分含量）；所述细胞培养基的pH为7.4。

3、羊抗鼠抗抗体的制备

以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。

4、四环素类药物单克隆抗体-胶体金标记物的制备

（1）胶体金的制备

用双蒸去离子水将1%氯金酸（购于sigma公司，产品目录号T09041）稀释成0.01%（质量百分含量），置磁力加热棒搅拌器上搅拌煮沸，每100ml 0.01%氯金酸加入2.5 ml 1%柠檬酸三钠（购于广州化学试剂厂，产品目录号BG11-AR-01KG），继续搅拌加热反应至液体呈红色时停止加热，冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。

（2）四环素类药物单克隆抗体-胶体金标记物的制备

在磁力搅拌下，用0.1mol/L碳酸钾调胶体金的pH值至8.2，按每毫升胶体金溶液中加入50~100μg抗体的标准向胶体金溶液中加入上述四环素类药物单克隆抗体，继续搅拌混匀10min，加入5%牛血清白蛋白（BSA）使其在胶体金溶液中的终浓度为1%（体积百分含量），静置10min。12000rpm，4℃离心60min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，得到的四环素类药物单克隆抗体-胶体金标记物溶液的浓度为50μg/mL，置4℃备用。

复溶缓冲液：含牛血清白蛋白（BSA）0.1%~0.3%（体积百分含量）、吐温-80 0.05%~0.2%（质量百分含量）、pH7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。

5、将四环素类药物单克隆抗体-胶体金标记物冻干到微孔试剂上

向微孔试剂微孔板中加入100μl四环素类药物单克隆抗体-胶体金标记物，放入冷冻干燥机中，冷阱温度为-70℃条件下，预冻4h后，再冻干14h，即可取出，得到冻干有四环素类药物单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂，将微孔试剂加上微孔塞。四环素类药物单克隆抗体-胶体金标记物冻干量0.20~0.25μg/mL。

6、样品吸收垫的准备

将样品吸收垫置于含牛血清白蛋白（牛血清白蛋白在缓冲液中的终浓度为0.5%（体积百分含量））、pH为7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃烘2h备用。

7、反应膜的制备

包被过程：用磷酸缓冲液将四环素半抗原-卵清白蛋白偶联物稀释到10mg/mL，用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线，包被量为1.0μg/cm²；用0.01mol/L、pH 7.4 PBS 缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释到200μg/mL，用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线，包被量为1.0μg/cm²。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥2h，备用。

Claims

1.一种检测四环素类抗生素的试剂盒，其特征在于包括冻干有四环素类药物单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂条和试纸条，试纸条由底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜组成，所述反应膜上具有包被有四环素半抗原-载体蛋白偶联物构成的检测线印迹“︱”和包被羊抗鼠抗抗体构成的质控线印迹“︱”。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述检测线和质控线平行，均呈与试纸条的长相垂直的条带状。

3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述样品吸收垫位于底板始端，所述吸水垫位于底板末端，所述质控线位于距离吸水垫始端与反应膜相连处5-8mm，所述检测线位于距离质控线5-6mm。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试纸条样品吸收垫上的检测端粘贴有保护膜，保护膜上有MAX标记线。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述微孔试剂条的反应孔上具有微孔塞。

6.如权利要求1所述的试剂盒，所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料，样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸，吸水垫为吸水纸，反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜，保护膜为PE材质保护膜。

7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还有固定用具及固定其中用于盛装微孔试剂条和试纸条的试剂桶。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒盒体为硬纸盒，试剂桶为塑料试剂桶，固定用具是硬质支撑材料。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于所述试剂桶上具有密封盖。