CN201935920U - 检测β-内酰胺类抗生素的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本实用新型提供了一种检测β-内酰胺类抗生素的试剂盒，试剂盒包括试剂盒盒体，具有12个孔的固定用具及放置其中的12个具塞试剂桶，试剂桶中包括微孔试剂条和试纸条，试纸条由底板、附着在底板上依次紧密相连的样本吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜组成，头孢类药物单克隆抗体-胶体金标记物冻干在微孔试剂中。在反应膜具有包被有头孢类药物-载体蛋白偶联物构成的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体构成质控线。本实用新型试剂盒具有便携性好，灵敏度高，检测时间短等特点，可以在β-内酰胺类抗生素残留检测中发挥重要作用。

Description

检测β-内酰胺类抗生素的试剂盒

技术领域

本实用新型涉及一种检测β-内酰胺类抗生素的试剂盒，特别是检测牛奶中β-内酰胺类抗生素的试剂盒。

背景技术

随着人们生活水平的提高，动物源食品中的药物残留日益受到国际社会的重视。β-内酰胺类抗生素作为发现最早、用量最多的一类抗生素，在牛乳及动物组织中残留检出报道最多。β-内酰胺类抗生素是指化学结构中含有β-内酰胺环的一类抗生素，主要包括青霉素类和头孢菌素类，其作用特点是能够抑制细菌黏肽转肽酶的活性，从而阻止细菌细胞壁的合成，呈现杀菌活性。在动物生产中，β-内酰胺类抗生素广泛用于控制奶牛的乳房炎，治疗动物尿道、胃肠道和呼吸道感染等。但由于其使用方法不当或不遵守休药期规定等原因，均可造成它在畜产品中的残留，给人类健康带来严重危害，如产生过敏反应、破坏胃肠道菌群平衡和增强细菌耐药性等。其中青霉素在食品中的残留会对青霉素过敏的人产生健康危害，更为重要的是，抗生素被过量食入健康人肠道，会破坏健康人的正常菌群环境，导致人体免疫力的降低，从而危害消费者的身体健康，同时也影响牛奶及乳制品的出口贸易。我国的原料乳中β-内酰胺类抗生素残留严重，对其开展监控检测是我国乳品业发展中极为关注的问题。为使牛奶中抗生素问题得到有效监控，符合最大残留限量标准，奶牛场、乳制品厂、政府监督部门、出入境检测、大型食品流通领域等都在努力寻求准确可行的检测方法，许多大型化学试剂和仪器公司也致力于开发β-内酰胺类抗生素残留检测的方法和仪器。

目前，牛奶及生鲜奶中β-内酰胺类抗生素残留的检测方法依据不同的检测原理，大体可分为三大类：微生物受阻检测、理化检测法、免疫学分析法。微生物受阻检测方法，主要有抑菌圈试验、浑浊度试验、变色型检测金标试剂盒方法，微生物检测方法检测成本价低，但是灵敏度低、耗时长、耐药菌的存在容易导致误检；理化检测方法，是目前检测β-内酰胺类抗生素主要方法，有液相色谱法、色谱/质谱联用技术、气相色谱法等，理化检测方法精确度高，但其存在检测成本高，检测设备复杂，对检测人员的要求较高，检测耗时长等缺点，目前常用的免疫学分析法，主要为酶联免疫检测法和放射免疫分析法需要的检测费用还是较高，不适合企业低成本的检测需要。因此，在实践中有必要建立一种敏感度高、操作简单、成本低、检测药物种类多、适合 大规模推广的检测方法。

实用新型内容

本实用新型的目的提供一种灵敏度高、检测β-内酰胺类抗生素药物种类多，成本低、操作简单、检测时间短的检测β-内酰胺类抗生素的试剂盒。

本实用新型的试剂盒包括试剂盒盒体、具有12个孔的固定用具及放置其中的12个具塞试剂桶，试剂桶包括微孔试剂条和8个试纸条，微孔试剂条有8个反应孔，反应孔上具有微孔塞，试纸条由底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜等组成，与常规试纸条不同的是，其中的头孢类单克隆抗体-胶体金标记物金不在是包被在结合物释放垫上，组装入试纸条，而是冻干在微孔试剂条板孔中。

将金标抗体冻干在微孔试剂条中，这样做的好处是在检测过程中，能够使金标抗体与待检样品液充分接触，充分反应，从而减少误差，增加整个体系的反应灵敏度。

所述反应膜上分别包被有头孢类药物-载体蛋白偶联物构成的检测线印迹“|”和包被羊抗鼠抗抗体构成的质控线印迹。在反应膜上检测线印迹和质控线印迹组合排列为“||”。

所述的检测线位于距离样品吸收垫一侧5-8mm，优选6mm，所述质控线位于距离检测线4-7mm，优选5mm。

所述试纸条两端贴有保护膜，覆盖在吸水端上的为手柄端，覆盖在样品吸收垫上的为检测端，检测端保护膜上有MAX标记线。

本实用新型试剂盒中试纸条底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；样品吸收垫可为吸滤纸或虑油纸；吸水垫为吸水纸；反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；保护膜为PE材质保护膜；试剂盒盒体为硬纸盒；试剂桶为塑料试剂桶；固定用具为硬质支撑材料。

本实用新型试剂盒具有如下有益效果：

1.灵敏度高。β-内酰胺类抗生素检测试剂盒以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无价健形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金对单克隆抗体特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。因此，本实用新型试剂盒具有较高的特异性和灵敏度。本试剂盒对青霉素G、氨苄青霉素、阿莫西林、苯唑青霉素、邻青霉素、双青霉素、萘夫西林、头孢喹诺、头孢乙腈、头孢洛宁、头孢唑林、头孢哌酮、先锋霉素VIII、头孢噻呋检测灵敏度分别为2μg/L、3μg/L、3μg/L、3μg/L、3μg/L、6μg/L、20μg/L、15μg/L、100μg/L、18μg/L、50μg/L、40μg/L、50μg/L、90μg/L。

2.操作简便快速。使用试剂盒检测时无需任何其它试剂，只要将待检样品溶液滴加于微孔试剂中，混匀后，孵育5min，将试纸标有MAX线标记端向下，插入孵育后的微孔试剂后计时，5min内观察结果。

3.显示检测结果形象、直观准确。检测是试纸条以显示红线色“|”及“||”印迹作为阳性和阴性标记，即在硝酸纤维素膜上显示一条红线“|”印迹表示在被检测样本液中β-内酰胺类抗生素的含量高于等于试剂盒对β-内酰胺类抗生素药物的最低检测限，两条红线“||”印迹表示在被检测样本中β-内酰胺类抗生素含量低于试剂盒对β-内酰胺类抗生素药物的最低检测限，结果判定形象、直观、准确、简单明了，不容易出现结果误判。

4.成本低，投资少。使用本实用新型试剂盒，不需另配仪器设备及其他试剂，使现场检测一步到位，成本低廉，投资少，见效快。

5.易于大范围推广应用。试剂盒操作简单，能较好满足不同层次人员的需要，如专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、乳业企业等，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。

附图说明

图1为本实用新型试纸条结构示意图；

图2为本实用新型试纸条俯视图；

图3为本实用新型微孔试剂图

图4为本实用新型试纸条检测结果判定图。

图5为本实用新型试剂桶结构示意图；

图6为本实用新型固定用具的俯视图；

图7为本实用新型盒体与固定用具的侧视图。

具体实施方式

一、β-内酰胺类抗生素检测试剂盒的组装制备

1)、试纸条：

样品吸收垫1、反应膜2、吸水垫3和保护膜依次按顺序黏贴在所述底板6上，样品吸收垫的末端与反应膜始端相连，反应膜的末端与吸水垫相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐，试纸两端黏贴有保护膜，保护膜7-1覆盖在吸水垫上手柄端，保护膜7-2覆盖在样品吸收垫的检测端，在检测端保护膜上印有MAX标记线，检测线4包被有头孢类药物-载体蛋白偶联物，质控线5包被有羊抗鼠抗抗体。

底板为PVC底板，样品吸收垫为吸滤纸，反应膜为硝酸纤维素膜，吸水垫为吸水 纸，保护膜为PE材质保护膜。

2)微孔试剂条

微孔试剂条8具有微孔塞9，板孔中冻干有头孢类药物单克隆抗体-胶体金标记物。

3)将1)试纸条和2)微孔试剂条装入塑料试剂桶10，将塑料试剂桶放置于试剂盒盒体12内的固定用具11中。

二、试剂盒的使用

待检牛奶样品溶液滴加200μl到微孔试剂中，混匀后，孵育5min，将试纸标有MAX线标记端向下，插入孵育后的微孔试剂后计，5min内观察结果。

三、检测结果分析

β-内酰胺类抗生素在样本中的含量高于等于试剂盒对其的最低检测限时，头孢类药物单克隆-胶体金标记物与β-内酰胺类抗生素结合，金标抗体上的抗原结合位点被封闭，从而在检测区内因为竞争反应，不会与头孢类药物-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带。阴性样本在检测过程中由于缺少抗原抗体竞争反应，将会在检测线和质控线上出现红色条带。如图4所示。

阳性：当质控线(C)显示一条红色条带，而检测线(T)不显色，试纸条以显示红线色“|”，判为阳性，如图4.a图所示。

阴性：当质控线(C)显示一条红色条带，检测线(T)同时也显示出一条红色条带，且检测线(T)颜色接近或浅于质控线(C)时，试纸条以显示红线色为“||”，判为阴性，如图4.b所示。

无效：当质控线(C)不显示出红色条带，则无论检测线(T)显示出红色条带与否，该试纸条判为无效，如图4.c、4.d所示。

四、检测试剂盒中用到的材料制备方法如下：

1、头孢类药物-载体蛋白偶联物的合成与鉴定

头孢类药物是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。

1)免疫原的制备-头孢类药物与卵清蛋白偶联物合成

取头孢匹林的钠盐40mg，用1.5ml双蒸水溶解，得到(I)液；取EDC40mg和NHS60mg用0.5ml水溶解得到(II)液；在搅拌状态下将(II)加入(I)中，反应1h，得到(III)液；取卵清蛋白60mg用8ml水溶解，得到(IV)液；将(IV)加入(III)中，室温搅拌反应24h分别得到免疫原，用0.02M PBS透析3天，分装、冻存。

2)包被原的制备-头孢类药物与牛血清白蛋白偶联物合成

取头孢匹林的钠盐40mg，用1.5ml双蒸水溶解，得到(I)液；取EDC40mg和 NHS60mg用0.5ml水溶解得到(II)液；在搅拌状态下将(II)加入(I)中，反应1h，得到(III)液；取牛血清白蛋白100mg用8ml水溶解，得到(IV)液；将(IV)加入(III)中，室温搅拌反应24h分别得到免疫原，用0.02M PBS透析3天，分装、冻存。

3)头孢类药物-载体偶联物的鉴定

将载体蛋白、头孢类药物、头孢类药物-载体蛋白偶联物用pH7.4的PBS配成0.5mg/ml的溶液，以0.01mol/L pH7.4PBS调零，用紫外分光光度计在波长200-800nm范围内扫描，得到载体蛋白、头孢类药物、头孢类药物-载体蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线，表明头孢类药物与载体蛋白偶联成功。

2、头孢类药物单克隆抗体的制备

(1)制备单抗

a.动物免疫

将步骤1得到的免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。

b.细胞融合和克隆化

取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按9∶1(数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选得到稳定分泌头孢类药物单克隆抗体的头孢类药物单克隆杂交瘤细胞株。

c.细胞冻存和复苏

将杂交瘤细胞用冻存液制成1×10⁹个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

d.单克隆抗体的制备与纯化

增量培养法：将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。

所述细胞培养基为向RPMI-1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20％(质量百分含量)，使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2％(质量百分含量)；所述细胞培养基的pH为7.4。

3、羊抗鼠抗抗体的制备：以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。

4、头孢类药物单克隆抗体-胶体金标记物的制备

(1)胶体金的制备

用双蒸去离子水将1％氯金酸(购于sigma公司，产品目录号T09041)稀释成0.01％(质量百分含量)，置磁力加热棒搅拌器上搅拌煮沸，每100ml 0.01％氯金酸加入2.5ml 1％柠檬酸三钠(购于广州化学试剂厂，产品目录号BG11-AR-01KG)，继续搅拌加热反应至液体呈红色时停止加热，冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。

(2)头孢类药物单克隆抗体-胶体金标记物的制备

在磁力搅拌下，用0.2mol/L碳酸钾调胶体金的pH值至7.0，按50-100μg抗体/ml胶体金的标准向胶体金溶液中加入上述头孢类药物单克隆抗体，继续搅拌混匀30min，加入10％BSA至BSA在胶体金溶液中的终浓度为1％(体积百分含量)，静置30min。12000rpm、4℃离心30min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/20的复溶缓冲液将沉淀重悬，得到的头孢类药物单克隆抗体-胶体金标记物溶液的浓度为50ug单抗/ml溶液，置4℃备用。

复溶缓冲液：含酪蛋白、吐温-80的0.02mol/L、pH7.2的磷酸盐溶液，其中酪蛋白在复溶缓冲液中的终浓度为0.05-0.1％(体积百分含量)，吐温-80在复溶缓冲液中的终浓度为0.05-0.15％(质量百分含量)。

5、将头孢类药物单克隆抗体-胶体金标记物冻干到微孔试剂上

向微孔试剂微孔板中加入100μl头孢类药物单克隆抗体-胶体金标记物，放入冷冻干燥机中，冷阱温度为-70℃条件下，预冻4h后，再冻干14h，即可取出，得到冻干有头孢类药物单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂；

6、样品吸收垫的准备：将样品吸收垫置于含牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在缓冲液中的终浓度为0.5％(体积百分含量))、pH为7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃烘2h备用；

7、反应膜的制备

包被过程：用磷酸缓冲液将头孢类药物-牛血清白蛋白偶联物稀释到10mg/mL，用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测区，包被量为1.0μg/cm²；用0.01M、pH 7.4PBS缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释到200μg/ml，用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控区，包被量为1.0μg/cm²。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥2h，备用。

Claims (9)

1.一种检测β-内酰胺类抗生素的试剂盒，其特征在于试剂盒包括试剂盒盒体、具有12个孔的固定用具及放置其中的12个具塞试剂桶，试剂桶中包括微孔试剂条和8个试纸条，试纸条由底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜组成。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述反应膜上具有包被有头孢类药物-载体蛋白偶联物构成的检测线印迹“|”和包被羊抗鼠抗抗体构成的质控线印迹“|”。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述检测线和质控线平行。

4.如权利要求1、2或3所述的试剂盒，其特征在于所述的检测线位于距离样品吸收垫一侧5-8mm，所述质控线位于距离检测线4-7mm。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试纸条两端贴有保护膜，覆盖在吸水端上的为手柄端，覆盖在样品吸收垫上的为检测端，检测端保护膜上有MAX标记线。

6.如权利要求1所述的试剂盒，所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料，样品吸收垫可为吸滤纸或虑油纸，吸水垫为吸水纸，反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜，保护膜为PE材质保护膜。

7.如权利要求书1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒盒体为硬纸盒，试剂桶为塑料试剂桶，固定用具是硬质支撑材料。

8.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述微孔试剂条有8个反应孔，反应孔上具有微孔塞。

9.如权利要求8所述的试剂盒，所述微孔试剂中冻干有头孢类药物单克隆抗体-胶体金标记物。 

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