CN104991078B - 一种hcg胶体金免疫侧向层析试纸条及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于临床医学诊断领域，特别涉及一种HCG胶体金免疫侧向层析试纸条及其检测方法，HCG胶体金免疫侧向层析试纸条，由硝酸纤维素膜、Fusion5膜和吸水纸；所述硝酸纤维素膜上设有检测线T线和质控线C线，所述检测线T线上喷有T线溶液，检测线C线上喷有C线溶液。通过标准品不同浓度值与对应的T/C平均值制作标准曲线，用三次样条插值拟合该标准曲线，可得到线性较好，完全上升的曲线，可克服HOOK效应，实现对高浓度HCG的检测。本发明的检测范围达到了10‑200000mIU/ml，而且待测样本无需稀释，检测过程简单，方便，检测成本低。

Description

一种HCG胶体金免疫侧向层析试纸条及其检测方法
技术领域
本发明属于临床医学诊断领域，特别涉及一种HCG胶体金免疫侧向层析试纸条及其检测方法。
背景技术
人绒毛膜促性腺激素(HCG)由胎盘的滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，它是由α和β二聚体的糖蛋白组成，囊胚期着床后即可以产生，由合体滋养细胞合成。HCG在受精后第6日开始分泌，受精后第7日，就能在孕妇血清中和尿中测出，并以指数形式增加，平均1.5-2天浓度翻倍，增加速率因人而异。至妊娠7-10周其浓度达到高峰，约20,000-100,000mIU/ml，在妊娠13-15周浓度有所降低，直至妊娠结束。HCG上升较缓慢，或怀孕到3-6周HCG增加不能翻倍，则可考虑异位妊娠或先兆流产的可能。
因此，在临床上，HCG定量不仅仅诊断妊娠，还能得知受检者是否存在妊娠疾病。正常妊娠者二天间隔定量测定HCG有快速上升是胚胎良好发育的重要指标。定量检测尿中HCG也是葡萄胎、绒毛膜癌等疾病的辅助诊断重要指标。因此，HCG的定量测定在临床诊断上是极其重要的。
HCG现有的定量检测技术主要有酶联免疫吸附试验(ELISA)、化学发光法和放射免疫实验等，这些技术对实验室和检测人员的要求较高，费时，费力，成本高，不利于HCG快速定量检测技术的开展。
目前，常用的免疫胶体金试纸条可在数分钟内检测尿中HCG诊断妊娠，尿HCG<25mIU/ml时妊娠阴性，反之呈阳性。但多数仅仅用于定性检测，而不能测定异位妊娠。因此，需要更多的快速定量HCG的体外诊断试剂。
专利(CN102890157A)提供的快速定量HCG的试纸条，硝酸纤维素膜上分别包被有鼠抗HCG-α抗体构成的检测线T线和羊抗鼠IgG抗体构成的质控线C线，通过对待测样本进行稀释后定量检测范围为10-15000mIU/ml。该方法的最高仅可检测到15000mIU/ml，并且还需要对待测样本进行稀释，操作步骤复杂，耗时耗力。
专利(CN101825640A)公开了一种胶体金免疫层析定性定量两用检测HCG试纸。该试纸的NC膜上，定点分布有含HCG单克隆抗体或羊抗鼠IgG抗体的定性线、质控线和定量线。其定性检测灵敏度可达25mIU/ml，定量检测的线性范围可达到100-15000mIU/ml。该方法需划三条线，工艺繁琐，并且最高也仅检测到15000mIU/ml，难以满足临床妊娠诊断。
专利(CN103954753)公开了一种免疫层析试纸条的定量检测方法，该方法需要在硝酸纤维素膜上划n条检测线及1条内参线，需第n－1条检测线的检测信号达到阈值，利用第n条检测线和部分第n－1条检测线的检测信号分别进行标准曲线的绘制，不同浓度范围用不同的标准曲线计算待测溶液的浓度。该方法能克服HOOK效应，使检测范围足够宽，但是，该方法在NC膜上至少要划3条线，成本较高，工艺较繁琐，并且对于不同浓度范围接点的取值会较难界定。
专利(公开号CN202383145U)提供了一种HCG胶体金定量检测试纸条，但是该专利中，硝酸纤维素膜(NC膜)上设有平行的两条检测线和一条质控线，检测线包被的是抗HCG单克隆抗体，质控线上包被的是羊抗鼠IgG。但是，在NC膜上划三条线，不仅增加了生物原料成本，而且对划膜仪来说，泵是较贵的零部件，因此，增加了购买一个泵及对该泵维护的成本。
样本中待检抗原的含量很高时，过量抗原和金标抗体结合，与检测线位置上的抗体不再形成"夹心复合物"。此时，如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为HOOK效应(HOOK EFFECT，钩状效应)，因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。HOOK效应严重时，反应甚至可不显色，而出现假阴性的临床结果。
综上所述，在临床妊娠诊断中，需要一种成本低，操作简单、快速，特异性好，并可检测妊娠期不同时间HCG浓度值的试纸条。
发明内容
本发明的目的是提供一种HCG胶体金免疫侧向层析试纸条，该试纸条用HCG抗原作为质控线，既可以对试纸条起到质控的作用，又可以起到校正的作用，能够克服HOOK效应，生产成本低，操作简单。
本发明还提供了一种HCG胶体金免疫侧向层析试纸条的检测方法，先绘制标准曲线，然后根据标准曲线直接可得出待测样品中的HCG的浓度值，检测方法非常简单，实用，检测范围达到了10-200000mIU/ml。
为了实现以上技术效果，本发明是通过如下步骤实现：
一种HCG胶体金免疫侧向层析试纸条，其特征在于：该试纸条采用搭接的方式，在塑料底板上粘贴有硝酸纤维素膜，该硝酸纤维素膜的两端分别粘贴Fusion5膜和吸水纸；
所述硝酸纤维素膜上设有检测线T线和质控线C线，所述检测线T线上喷有T线溶液，检测线C线上喷有C线溶液；所述T线和C线上的喷膜量为0.5-1μl/cm。
优选的，所述T线溶液中含有浓度为1-2mg/mL的HCG单克隆单体，所述C线溶液中含有浓度为1-2mg/mL的HCG抗原。
上述HCG胶体金免疫侧向层析试纸条的检测方法，其步骤包括：
(1)、标准曲线的绘制：将不同浓度的HCG标准品分别与等量体积的金标液混合成混合液，取混合液70-100ul滴加到HCG胶体金免疫侧向层析试纸条的Fusion5膜上，层析8-12分钟，通过与试纸条配套的免疫层析定量分析仪读取T线和C线的反射率值，计算T/C值，然后以标准品的各浓度值为横坐标，各浓度T/C的平均值为纵坐标,用三次样条插值拟合制备标准曲线；
(2)、待测样品的检测：将待测样品和与等量体积的金标液混合成混合液，取混合液70-100μl滴加到HCG胶体金免疫侧向层析试纸条的Fusion5膜上，层析8-12分钟，通过T/C值即可检测出待测样品中的HCG浓度值。
所述步骤(1)中，HCG标准品的浓度值分别为10、25、100、500、1000、2500、5000、10000、25000、50000、100000和200000mIU/mL。
所述金标液的制备方法为，
(A)、胶体金标记：将待标记的HCG单克隆抗体与空白胶体金溶液离心去除上清液；沉淀物中加入含有浓度为0.2％-0.5％的BSA水溶液封闭，离心去除上清液，沉淀物离心清洗，然后磷酸缓冲液浓缩至原体积的1/10-1/5，4℃保存备用，即为金贮。
优选的，HCG单克隆抗体与空白胶体金溶液的加入配比为0.005-0.02mg HCG单抗/毫升胶体金溶液。
优选的，所述空白胶体金的平均粒径15-60nm。
优选的，所述磷酸缓冲液的pH值为7.2-7.6，浓度为0.01-0.02mol/L，该磷酸缓冲液中还含有0.5-2％的BSA和1-10％的蔗糖。
(B)调配：用pH值为7.2-7.6的磷酸缓冲液与步骤(A)中的金贮稀释倍数为5:1-20:1，即为金标液。
本发明的有益效果是：
1、本发明制备的HCG胶体金免疫侧向层析试纸条可克服HOOK效应，该试纸条以HCG抗原作为质控线，此处发生的反应是质控线上的HCG抗原和与检测线反应后剩余的金标抗体，随样本中HCG浓度的增加，质控线可反应的金标抗体减少，因此质控线读数随之降低。通过不同的HCG标准品浓度值为横坐标，对应的T/C值为纵坐标，用三次样条插值拟合该标准曲线，可得到线性较好，完全上升的曲线，克服了HOOK效应，可实现对高浓度HCG的检测，并避免了因HOOK效应而导致的假阴性现象，提高了临床诊断的准确度。
2、本发明的检测范围达到了10-200000mIU/ml，而且待测样本无需稀释，检测过程简单，方便，检测成本低。
3、本发明既可以定性又可以定量检测尿液、血清和血浆中的HCG含量，与500mIU/ml人促黄体生成素(hLH)，1000mIU/ml人卵泡雌激素(hFSH)和1000μIU/ml(hTSH)无交叉反应；250mg/dL血红蛋白、500mg/dL甘油三脂和10mg/dL胆红素对本检测无干扰，检测精准度高。
附图说明
图1是本发明HCG胶体金免疫侧向层析试纸条的结构示意图。
图2是本发明根据HCG标准品浓度值和对应的T/C平均值绘制的标准曲线。
图1中：1为检测线C线，2为Fusion5膜，3为硝酸纤维素膜，4为吸水纸，5为检测线T线。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步说明：
实验所用到的设备：免疫层析定量分析仪(KASA-奥设-427)。
实施例1
HCG胶体金免疫侧向层析试纸条的制备。
(1)、T线溶液的制备：用10mmol/L的磷酸缓冲液稀释HCG单克隆抗体至1-2mg/mL；
(2)、C线溶液的制备：用10mmol/L的磷酸缓冲液稀释HCG抗原至1-2mg/mL；
在带有背胶的塑料底板上采用搭接的方式，首先粘贴硝酸纤维素膜3，然后在硝酸纤维素膜3的两端分别粘贴Fusion5膜2和吸水纸4。在硝酸纤维素膜3且靠近Fusion5膜处划T线，靠近吸水纸4端划C线，T线和C线的间距为4.5mm。
在T线处喷上T线溶液，在C线处喷上C线溶液。T线抗体的终浓度为1-2mg/ml，C线抗原的终浓度为1-2mg/ml，C、T线的喷膜量为0.5-1μl/cm。
在大卡恒温烘箱中37℃烘干12-24小时，用切条机切成3.85mm宽度的试纸条，将试纸条装入塑料壳中，冷却后，装入铝箔袋，加入一袋干燥剂，封口即可。具体如图1所示。
实施例2
HCG胶体金免疫侧向层析试纸条的检测方法。
(1)制备金标液：
将待标记的HCG单克隆抗体与空白胶体金溶液(空白胶体金平均粒径15-60nm)，标记量为0.005-0.02mg HCG单抗/毫升胶体金溶液，离心去除上清液(10000rpm，20min)；沉淀物用0.2％-0.5％的BSA水溶液封闭，离心去除上清液(10000rpm，20min)；用pH值为7.2-7.6的浓度为0.01-0.02mol/L的磷酸缓冲液(含浓度为0.05％-0.5％的表面活性剂)的清洗液离心洗涤；用pH为7.2-7.6的0.01-0.02mol/L的磷酸缓冲液(0.5-2％的BSA和1-10％的蔗糖)浓缩至原体积的1/10-1/5，4℃保存备用，即为金贮。
(2)调配：
用pH值为7.2-7.6的磷酸缓冲液与步骤(1)中的金贮稀释倍数为5:1-20:1，即为金标液。
(3)、标准曲线的绘制
用pH为7.2-7.6的磷酸缓冲液(含1-2％BSA)稀释HCG标准品，共13个不同的浓度，分别为0、10、25、100、500、1000、2500、5000、10000、25000、50000、100000和200000mIU/ml,每个浓度设3个重复，与等量体积的金标液混合成混合液，再取混合液70-100μl滴在制备好的实施例1中的HCG胶体金免疫侧向层析试纸条中的试纸上，层析8-12分钟后，通过与HCG胶体金免疫侧向层析试纸条相配套的免疫层析定量分析仪，读取T/C线信号值，具体如表1所示。
表1标准品测试值
注：NA：No available
(4)、制备ID卡：
然后以标准品的HCG浓度值为横坐标，各浓度的T/C平均值为纵坐标，绘制标准曲线，具体如图2所示，烧录ID卡，并导入配套仪器中。
(5)、待测样品的检测
将待测样品和与等量体积的金标液混合成混合液，取混合液70-100μl滴加到HCG胶体金免疫侧向层析试纸条的Fusion5膜上，层析8-12分钟，在该仪器的可视界面上可直接读取待测样品中的HCG浓度值。
实施例3
精密度检测
用实施例2中的测试方法，测试已知浓度值为25、1000、10000和100000mIU/ml的标准品，每组浓度值测试10次，具体检测结果如下表2所示。
表2精密度测试结果表
标准品浓度(mIU/ml) 25 1000 10000 100000
样品1 25 1010 10097 99760
样品2 24 1033 9162 109880
样品3 23 874 11253 114620
样品4 25 1085 9048 124420
样品5 25 890 8961 106990
样品6 24 901 9000 111607
样品7 28 853 8937 96970
样品8 26 964 9606 105460
样品9 29 851 9313 121260
样品10 27 1020 9104 94760
平均值 26 948 9448 108573
SD 2 85 729 9859
CV 7.16％ 8.95％ 7.72％ 9.08％
从表2中可知，采用本发明的HCG定量检测试纸条检测范围可达到10-200000mIU/ml内，灵敏度在10mIU/ml以下，批内精密度小于10％，批间精密度小于15％。
本发明的HCG定量检测试纸条可同时检测尿液、血清和血浆样本。与500mIU/ml人促黄体生成素(hLH)，1000mIU/ml人卵泡雌激素(hFSH)和1000μIU/ml(hTSH)无交叉反应，250mg/dL血红蛋白、500mg/dL甘油三脂和10mg/dL胆红素对本检测无干扰。

Claims (4)

1.一种HCG胶体金免疫侧向层析试纸条的非诊断目的的检测方法，其特征在于：
该HCG胶体金免疫侧向层析试纸条采用搭接的方式，塑料底板上粘贴有硝酸纤维素膜(3)，该硝酸纤维素膜(3)的两端分别粘贴Fusion5膜(2)和吸水纸(4)；所述硝酸纤维素膜(3)上设有检测线T线(5)和质控线C线(1)，
所述检测线T线(5)上喷有T线溶液，该T线溶液中含有浓度为1-2mg/mL的HCG单克隆抗体；质控线C线(1)上喷有C线溶液，该C线溶液中含有浓度为1-2mg/mL的HCG抗原；所述T线(5)和C线(1)上的喷膜量为0.5-1μl/cm；
其检测步骤包括：
(1)、标准曲线的绘制：将不同浓度的HCG标准品分别与等量体积的金标液混合成混合液，取混合液70-100μl滴加到HCG胶体金免疫侧向层析试纸条的Fusion5膜上，层析8-12分钟，通过与试纸条配套的免疫层析定量分析仪读取T线和C线的反射率值，计算T/C值，然后以HCG标准品的浓度值为横坐标，各浓度T/C平均值为纵坐标，制得标准曲线；HCG标准品的浓度值分别为0、10、25、100、500、1000、2500、5000、10000、25000、50000、100000和200000mIU/mL；
(2)、待测样品的检测：将待测样品与等量体积的金标液混合成混合液，取混合液70-100μl滴加到HCG胶体金免疫侧向层析试纸条的Fusion5膜上，层析8-12分钟，通过T/C值即可检测出待测样品中的HCG浓度值；
金标液中HCG单克隆抗体与空白胶体金溶液的加入配比为0.005-0.02mgHCG单抗/毫升胶体金溶液。
2.根据权利要求1所述的HCG胶体金免疫侧向层析试纸条的非诊断目的的检测方法，其特征在于，所述金标液的制备方法为，
(A)、胶体金标记：将待标记的HCG单克隆抗体与空白胶体金溶液离心去除上清液；沉淀物中加入含有浓度为0.2％-0.5％的BSA水溶液封闭，离心去除上清液，沉淀物离心清洗，然后用磷酸缓冲液浓缩至原体积的1/10-1/5，4℃保存备用，即为金贮；
(B)调配：用pH值为7.2-7.6的磷酸缓冲液稀释步骤(A)中的金贮，稀释倍数为5:1-20:1，即为金标液。
3.根据权利要求2所述的HCG胶体金免疫侧向层析试纸条的非诊断目的的检测方法，其特征在于：步骤(A)中，空白胶体金的平均粒径为15-60nm。
4.根据权利要求2所述的HCG胶体金免疫侧向层析试纸条的非诊断目的的检测方法，其特征在于：步骤(A)中磷酸缓冲液的pH值为7.2-7.6，浓度为0.01-0.02mol/L，该磷酸缓冲液中还含有0.5-2％的BSA和1-10％的蔗糖。
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