KR20160108695A - 이종 검사선을 구비한 임신진단용 면역크로마토그래피 스트립 및 이를 구비한 임신 진단 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 이종 검사선을 구비한 임신진단용 면역크로마토그래피 스트립, 상기 면역크로마토그래피 스트립을 구비한 임신진단키트 및 이를 사용하여 검체 내 인간융모성성선자극호르몬을 정성 또는 정량 분석하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 임신진단용 면역크로마토그래피 스트립은 이종 검사선을 구비함으로써, 고농도 인간융모성성선자극호르몬 정량 측정시 후크 현상으로 인한 위음성의 문제점을 극복하고, 육안으로 정성적인 분석인 임신진단 뿐만 아니라 신뢰성 높은 정량적 분석까지 신속하고 편리하게 수행할 수 있다. 나아가 검사선과 이종 검사선과의 상호 보완을 통하여 분석 물질의 농도 측정 범위가 개선된 효과가 있다.

Description

이종 검사선을 구비한 임신진단용 면역크로마토그래피 스트립 및 이를 구비한 임신 진단 키트{An immunochromatographic strip having different type test line for pregnancy test, and a pregnancy diagnosis kit using the same}

본 발명은 이종 검사선을 구비한 임신진단용 면역크로마토그래피 스트립, 이를 구비한 임신 진단 키트 및 이를 사용하여 검체 내 인간융모성성선자극 호르몬을 측정하여 임신진단(정성분석) 또는 인간융모성성선자극 호르몬의 농도를 정량 분석하는 방법에 관한 것이다.

래피드 테스트(rapid test)법으로 알려진 면역크로마토그래피 분석법은 항원-항체 반응을 이용하여, 미량의 표적물질(analyte)을 단시간에 정성 및 정량적으로 분석할 수 있는 방법으로서, 각종 질병의 진단 또는 검사를 비롯하여, 의학, 농업, 축산업, 식품, 군사, 환경 등 다양한 분야에서 사용되고 있다. 가정 및 병원등에서 널리 이용되는 임신진단키트는 이러한 면역크로마토그래피 분석법을 사용하고 있다. 이러한 면역 크로마토그래피 분석에는 검출하고자 하는 표적물질과 반응하여 변화를 나타낼 수 있는 반응물질을 포함하는 분석스트립(assay strip) 또는 상기 분석스트립을 플라스틱 케이스에 장착한 디바이스 형태의 분석장치가 일반적으로 사용되고 있다. 도 1은 통상적인 면역 크로마토그래피 분석에 사용되는 분석스트립의 단면도이다. 도 1에 나타난 바와 같이, 통상적인 분석스트립은 액상 검체를 수용하는 샘플(검체)패드; 육안 또는 센서를 이용하여 감지할 수 있는 시그널을 발생시키는 표지(예를 들어 골드입자, 라텍스 등)를 항원, 항체 등의 리간드에 접합시킨 접합체(conjugate)를 함유하는 접합체패드; 검체 중의 표적물질 및/또는 상기 접합체와 특이적으로 결합하는 결합제(항체 또는 항원)를 고정시킨 검사선과 검체의 전개를 확인할 수 있는 대조선이 형성된 검출패드 (주로 다공성 멤브레인패드); 및 액상 검체를 최종적으로 수용하는 흡습 패드로 구성되며, 이러한 기능성 패드들은 상기 나열한 순서대로 일부 중첩된 형태로 연결되어 고체 지지체 상에 부착되어 연속적으로 배열된다. 상기 분석스트립이 플라스틱 케이스 내부에 장착되어 사용되는 경우, 케이스의 상부에는 샘플 패드의 위치에 검체를 적하하기 위한 검체 투입구가, 검출패드의 결합제가 고정된 위치에는 검사 결과를 확인하기 위한 결과 확인창이 형성된다. 이와 같이, 분석스트립을 이용한 면역크로마토그래피 분석법에 있어서, 샘플 패드에 액상 검체를 적하하면, 액상 검체는 모세관 현상에 의하여 접합체 패드 및 검출패드를 통하여 이동하며, 최종적으로 흡습 패드에 수용된다. 일반적인 임신진단키트에 사용되는 면역크로마토그래피 스트립의 경우 임신시 소변 및 혈청에서 그 양이 증가하는 인간융모성성선자극호르몬(human chorionic gonadotropin, hCG)을 검출하고자 하는 표적물질로 사용한다. 인간융모성성선자극호르몬에 결합하는 항체를 맴브레인 패드에 라인형으로 고정시키고(검사선), 또 하나의 항체는 골드입자등과 같은 표지물질에 결합시키고 접합체 패드에 고정시킨 후, 검체를 전개시킨다. 전개되는 검체는 접합체 패드를 거치면서, 검체내의 융모성성선자극호르몬-항-융모성선자극호르몬 항체-골드입자의 복합체를 형성하여 전개되고, 상기 복합체는 검사선에 고정된 항-융모성선자극호르몬에 대한 항체에 포획되어 '검사선 고정된 항체-항-융모성선자극호르몬 골드입자'의 결합체가 형성된다 ("샌드위치 (sandwich) 반응"이라 한다, 따라서 기존의 검사선은 "샌드위치 면역 검사선"이라 한다). 검체 내에 임신으로 판정할 수 있는 농도로 융모성성선자극호르몬이 존재할 경우 상기 검사선 라인은 골드입자에 의하여 붉은 색으로 나타나게 되며 임신으로 판정한다. 또한 대조선은 검체 내의 융모성성선자극호르몬의 농도와 상관없이 항상 골드 입자 항체를 포획하여 골드입자에 의하여 붉은 색이 나타나므로 검사의 정상적인 종료를 확인할 수 있다. 결과가 나타난 분석스트립을 육안으로 또는 센서를 이용하여 감지할 수 있다.

임신진단시약에 사용하는 면역크로마토그래피 분석법은, 주로 긴 멤브레인에 특정 물질들을 각각 라인 형태로 가로로 여러 줄을 그려놓고, 세로로 잘라서 스트립(strip) 형태로 제조하기 때문에 생산 공정이 단순하고 대량 생산이 가능한 이점이 있다. 또한 엘리사(ELISA) 등과 비교해볼 때, 세척 과정이나 2차 반응이 별도로 필요 없고, 반응시간도 10분 정도로 간편성이 탁월하다. 그러나, 표적물질이 일정 농도 이상으로 증가하면 오히려 신호의 세기는 후크(hook) 현상으로 감소하는 현상을 보인다. 이러한 현상으로 인해, 종래 면역크로마토그래피 분석법은 주로 정성적인 분석을 하는데 사용되고, 정량적인 분석을 하기에는 많은 한계가 있는 문제점이 있다. 임신진단의 표적물질로 사용되는 인간융모성성선자극호르몬의 농도는 일반적으로 혈청 및 소변에서 9-12주 사이에 가장 높은 것으로 알려져 있으며 임산부의 소변 내 농도는 10주 정도에 10ug/ml 정도이며 개인에 따라 60ug/mL 정도의 높은 농도까지 검출된 것을 확인할 수 있었다. (Cole Reproductive Biology and Endocrinology 2010,8:102). 현재 사용되는 임신진단시약은 임신 초기 (3~5주, 마지막 생리일 기준)에 임신여부를 확인하는 것을 목적으로 하여, 낮은 농도의 융모성성선자극호르몬을 검출하는 정성분석용으로만 사용하고 있다. 그러나, 11,760명에 대한 시험결과 약 0.2%인 22명이 위음성으로 확인되었고, 이들에 대한 혈중 융모성성선자극호르몬 농도는 최대 268,022.5IU/mL로 측정 (J. Emergency Medicine 2013, 44:155)되었다는 것은 현재의 임신진단시약이 후크 현상으로 인한 위음성이 실제로 발생하고 있다는 점을 시사한다.

본 발명자들은 표적물질인 융모성성선자극호르몬이 고농도로 존재할 경우 후크 현상으로 인한 위음성을 극복하기 위해 이종 검사선을 추가한 임신진단용 면역크로마토그래피 스트립을 개발하였고, 검사선과 이종 검사선의 신호 세기를 비교함으로써 고농도의 융모성성선자극호르몬이 존재할 경우에도 임신여부의 진단이 가능하도록 하였다. 본 발명을 통하여 검체 내 융모성성선자극호르몬을 통한 임신 유무의 정성적인 분석뿐만 아니라, 육안으로 신뢰도 높은 정량적인 분석도 가능한 임신진단키트를 제공하는 것이다.

본 발명은 임신진단키트에 사용하는 접합체패드 및 검출패드를 구비한 면역크로마토그래피 스트립에 있어서, 접합체패드는 제1접합체로 검체내 표적물질인 융모성성선자극호르몬과 반응하는 제1일정량의 제1항- 융모성성선자극호르몬 항체 및 신호검출 표지물질로서 골드입자를 일정 비율로 결합하여 구비하고, 상기 제1접합체는 검체 전개 시 검출패드로 이동할 수 있고, 상기 검출패드는 "검사선(샌드위치 면역 검사선, Sandwich immunoassay test line)" 및 "이종 검사선(경쟁적 면역 검사선, Competitive immunoassay test line)"과 "대조선(control line)"이 각각 격리되어 구비되어 있고, 상기 검사선은 검체 내 융모성성선자극호르몬과 반응하는 제2항-융모성성선자극호르몬 항체가 고정되어 있고, 상기 이종 검사선은 융모성성선자극호르몬 또는 제1항-융모성성선자극호르몬 항체와 반응하는 융모성성선자극호르몬의 유사체가 제2일정량으로 고정되어 있어서, 검체 내 융모성성선자극호르몬과 결합되지 않은 상기 제1접합체 (베어(bare)접합체)와 반응할 수 있다. 상기 대조선은 상기 검사선 및 상기 이종 검사선과 유사한 방법을 이용하여 형성할 수 있다. 다만, 상기 대조선은 인간융모성성선자극호르몬과는 결합하지 않으면서, 검체와 함께 이동상에 의해 검출패드를 따라 이동하는 제2접합체를 접합체패드에 추가적으로 사용하였을 때 융모성성선자극호르몬과 상관없이 제2접합체를 포획할 수 있는 리간드를 고정시켜 형성할 수 있다.

본 발명은, 검사선 및 검체의 전개를 확인할 수 있는 대조선만이 형성된 검출패드를 구비한 종래의 분석스트립을 사용한 임신진단키트와 달리 표적물질인 융모성성선자극호르몬 또는 유사체가 고정된 이종 검사선 (경쟁적 면역 검사선, Competitive immunoassay test line)을 추가함으로써, 정성적 분석뿐만 아니라 신뢰성 높은 정량적 분석까지 수행할 수 있는 특징이 있다. 또한 "Hook" effect에 의한 잘못된 측정을 방지할 수 있다.

나아가 본 발명은, 특수한 분석 기구를 사용할 필요 없이, 육안을 통하여 신뢰성 높은 반정량적 분석을 수행할 수 있는 특징이 있다.

본 발명에 있어서, 상기 접합체 패드 내에 존재하는 제1접합체인 제1항- 융모성성선자극호르몬 항체-골드입자 접합체는 액상 검체(가임기 여성의 소변 등)와 검출패드로 이동 전개시 검체내 융모성성선자극호르몬과 결합하여 융모성성선자극호르몬-제1항-융모성성선자극호르몬 항체-골드입자 복합체를 형성하게 된다. 상기 복합체는 전개되는 중 검사선에 고정된 제2항- 융모성성선자극호르몬 항체에 포획되고 (샌드위치 면역반응, Sandwich immune reaction), 상기 검체 내 융모성성선자극호르몬과 결합되지 않은 제1항- 융모성성선자극호르몬 항체-골드입자 접합체는 전개되는 중 이종 검사선에 포획된다(경쟁 면역반응, Compatitive immune reaction). 상기 접합체 패드 내에 존재하는 제1항 융모성성선자극호르몬 항체-골드입자 접합체의 양은 특정량 즉 상기 제1일정량으로 정하여 사용하므로, 검체 내 융모성성선자극호르몬의 농도가 증가할수록, 접합체 패드 내에 존재하는 제1항-융모성성선자극호르몬 항체-골드입자 접합체와 검체내 융모성성선자극호르몬이 결합하면서 형성된 복합체의 갯수는 증가하게 되며, 반대로 융모성성선자극호르몬과 결합되지 않은 베어 접합체의 갯수는 감소하게 되는, 반비례적 관계를 보일 수 있다. 검사선의 신호의 세기는 검체내의 융모성성선자극호르몬의 농도가 증가함에 따라 증가하지만, 일정 농도 이상으로 증가하면 오히려 후크(hook) 현상으로 오히려 신호의 세기가 감소하는 현상을 보인다. 베어 접합체가 포획되는 이종 검사선으로부터의 신호 세기는 융모성성선자극호르몬의 농도의 M값까지는 일정하게 유지되다가, 이를 초과시 점차 감소하며, 상기 M값은 상기 제2일정량으로 고정된 융모성성선자극호르몬 또는 유사체가 상기 베어 접합체에 모두 반응하여 포화되는 경우에 있어서의 검체 내 융모성성선자극호르몬의 최대농도이며 M농도 이하로 베어 접합체의 수가 줄어들면 검체내 융모성성선자극호르몬의 농도가 증가할수록 감소하는 양상을 보이게 된다. 이러한 본 발명의 융모성성선자극호르몬의 농도 증가에 따른 검사선 및 이종 검사선의 신호 세기 양상을 도 3에 나타내었다.

결과적으로 상기 검사선 및 상기 이종 검사선 상의 표지물질로부터의 신호를 통해 융모성성선자극호르몬에 대한 정성 및 정량 분석이 가능하다. 보다 구체적으로, 상기 검사선과 이종 검사선에서의 신호를, 기지농도의 융모성성선자극호르몬에 대해 미리 완성해둔 표준 신호 데이터와 비교하여, 검체내의 융모성성선자극호르몬의 농도를 분석할 수 있다. 이는 신호의 세기를 육안으로 확인하여 반정량적으로 분석할 수 있고, 또는 농도계(densitometer)와 같은 리더(reader)를 사용하여 보다 엄밀하게 정량적으로 분석할 수 있다.

추가적으로 상기 접합체패드는 대조선의 리간드와 특이적으로 결합하여 내부대조군(internal control)으로 이용할 수 있는 물질과 골드입자가 결합된 제2접합체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제2접합체는 검출패드의 대조선의 리간드에 의해 포획되어, 검체의 전개를 확인하게 할 수 있다.

상기 검출패드는, 이동상과 검체가 전개되는 매질로서, 이동상과 검체가 검출패드를 이루는 다공성 멤브레인의 모세관 현상에 의해 이동할 수 있다. 나아가 상기 검출패드는 상기 검사선 및 상기 이종 검사선이 격리되어 구비되어 있고, 검체의 전개를 확인할 수 있는 대조선이 추가로 구비될 수 있다. 상기 검출패드의 일 말단은 상기 접합체패드와, 다른 일 말단은 검체 이송을 위한 구동력을 제공하는 흡습패드와 연결될 수 있다. 상기 접합체패드와 상기 흡습패드는 검출패드에 일부 중첩되어 위치할 수 있다. 상기 검출패드는 다공성 멤브레인으로 이루어질 수 있으며, 상기 다공성 멤브레인으로는 니트로셀룰로스 멤브레인(nitrocellulose membrane), 유리섬유(glass fiber) 멤브레인, 폴리에테르술폰(polyethersulfone; PES) 멤브레인, 셀룰로스(cellulose) 멤브레인, 나일론(nylon) 멤브레인 및 이들의 조합을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 5 내지 15 μm의 기공을 가지는 니트로셀룰로스 멤브레인이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용하는 용어 "대조선(Control line)"은 검체 또는 검체 중 융모성성선자극호르몬의 농도와 관계없이 일정한 신호를 내는 부분을 의미한다. 상기 대조선은 상기 검사선 및 상기 이종 검사선과 유사한 방법을 이용하여 형성할 수 있다. 다만, 상기 대조선은 융모성성선자극호르몬과는 결합하지 않으면서, 검체와 함께 이동상에 의해 검출패드를 따라 이동하는, 제2접합체로서 골드입자와 결합된 별도의 물질과 특이적 또는 비특이적으로 결합하여 포획할 수 있는 물질을 고정시켜 형성할 수 있다. 상기 대조선에 고정시키는 물질을 리간드라 할 수 있다. 결과적으로, 검체 중의 융모성성선자극호르몬의 존재 유무와 무관하게 일정한 신호를 방출할 수 있는 리간드를 고정시켜 형성되는 것이다. 상기 대조선으로서 항-래빗 IgG, 항-치킨 IgY, 스트렙트아비딘(streptavidin), 소혈청알부민 등이 사용될 수 있다.

상기 대조선은 고정되는 리간드의 농도를 달리하여 두 개 이상으로도 형성될 수 있다. 상기 대조선에 고정된 리간드의 농도가 높을수록, 대조선은 강한 신호를 일정하게 방출할 수 있다.

대조선에 특정농도의 리간드를 고정시키는 경우, 여기서 발생하는 신호의 세기는 언제나 일정하므로, 해당 신호 세기와 대응되는 검사선 또는 이종 검사선에서의 신호 세기가, 검체 내의 항융모성성선자극호르몬의 농도가 어느 정도일 때 발생되는지 결정할 수 있다. 이러한 대조선을 농도를 달리하여 수개 형성함으로써, 서로 다른 신호 세기를 갖는 대조선이 수개 형성될 수 있다. 이들을 검사선 또는 이종 검사선에서의 신호 세기와 비교하여 정량분석할 수 있다. 즉, 상기 대조선을 내부적 표준 신호 데이터로 활용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 검사선 및 이종 검사선의 신호 세기를 통한 정량분석의 경우, 검체 내 의 농도 측정 범위(dynamic range)는 25mIU/ml(WHO 국제표준물질 비교 시 약 2.7 ng/ml, 1ug?9.3IU)로부터 800IU/mL(약 0.09mg/ml) 사이일 수 있다. 이러한 농도 측정범위는 최대 측정범위에 있어서 조절이 될 수 있다. 종래 면역크로마토그래피 스트립은 검체내 표적물질이 일정 농도를 초과하게 되면 후크현상의 발생으로, 검사선에서의 신호 세기가 오히려 감소하는 현상을 보임은 앞서 설명하였다. 그러나 본 발명의 이종 검사선을 구비한 면역크로마토그래피 스트립은 검체내 융모성성선자극호르몬의 농도가 증가함에 따라 점차 감소하는 이종 검사선을 추가로 포함하고 있고, 상기 이종 검사선은 후크 현상에 영향을 받지 않기 때문에, 검사선 및 이종 검사선의 조합을 통하여 종래 검사선만으로는 한계가 있던 농도 측정 범위를, 후크 현상이 발생하는 범위까지 넓힌 특징이 있다.

본 발명의 임신진단키트에 사용되는 면역크로마토그래피 스트립에 대하여 보다 구체적으로 설명한다. 상기 면역크로마토그래피 스트립은, 융모성성선자극호르몬의 측정으로 임신여부를 확인하고자 하는 검체가 도입되는 샘플패드; 일 말단이 상기 샘플패드와 연결되는 상기 접합체 패드; 일 말단이 상기 접합체 패드의 다른 일 말단과 연결되는 상기 검출 패드; 일 말단이 상기 검출 패드의 다른 일 말단과 연결되고, 상기 샘플패드로부터 검체 이송을 위한 구동력을 제공하는 흡습패드; 및 상기 면역크로마토그래피 스트립 하부에 위치하는 고체 지지대를 포함할 수 있다. 본 발명의 면역크로마토그래피 스트립에 대한 구성도를 도 2에 나타내었다.

상기 고체 지지대는 니트로셀룰로스, 나일론, 피브이디에프(PVDF), 유리 및 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택된 재료로 형성된 것일 수 있다. 상기 고체 지지대 상에 스트립을 부착하여 제조함으로, 스트립의 내구성을 높일 수 있고, 취급 및 보관을 용이하게 할 수 있다. 또한, 추가적인 외부 케이스 장착을 용이하게 할 수 있다. 상기 고체 지지대로 사용될 수 있는 플라스틱 재질로는 폴리프로필렌(polypropylene) 필름, 폴리에스테르(polyester) 필름, 폴리카보네이트(polycarbonate) 필름, 아크릴(acrylic) 필름 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 면역크로마토그래피 스트립을 추가적으로 케이스 내에 고정되는 것인 키트로서, 하부 케이스에는 가이드 및 스트립 지지부가 구비되어 있고, 상부 케이스에는 검체 투입구; 및 검사선 및 이종 검사선에 상응하는 위치에 결과 확인창이 구비된 것인 진단 키트를 제공한다.

상기 임신진단용 면역크로마토그래피 스트립은 추가적으로 케이스 내에 고정될 수 있다. 하부 케이스의 내부에는 상기 면역크로마토그래피 스트립을 적절한 위치에 배치시키고 고정 또는 압착시키기 위한 다수의 가이드 및/또는 스트립 지지부가 구비될 수 있다. 선택적으로 하부 케이스에 구비된 가이드 및 스트립 지지부에 대응되는 위치에 가이드 및 스트립 지지부가 상부 케이스에도 구비된 것일 수 있다. 즉, 상기 가이드 및/또는 스트립 지지부는 필요에 따라 하부 케이스에 형성되거나, 또는 상부 케이스 및 하부 케이스 모두에 형성될 수 있다. 또한, 상부 케이스에는 검체 투입구 및 검사선, 이종 검사선, 대조선에 상응하는 위치에 표지물질(골드입자)로부터의 신호를 검출하기 위한 결과 확인창을 구비할 수 있다. 상기 검체 투입구는 검출패드의 일 말단에 즉, 검사선을 기준으로 흡습패드의 반대편 말단이면서, 동시에 검체가 멤브레인을 따라 전개될 수 있도록 검사선과 충분히 이격된 지점에 홀 또는 슬릿 등의 형태로 형성될 수 있다. 상기 결과 확인창은 검출패드 상에 검사선 및 이종 검사선이 위치한 지점 및/또는 경우에 따라서 추가적으로 대조선이 형성되어 있는 경우 대조선까지 포함하여 외부로부터 육안으로 또는 센서를 통해 식별 가능하기에 충분한 크기로 형성될 수 있다. 상기 검사선, 이종 검사선 및 불변 대조선을 확인할 수 있는 한 그 크기 및 모양은 제한없이 형성될 수 있다.

상기 상부 및 하부 케이스는 통상의 플라스틱 소재를 이용하여 제조될 수 있으며, 예를 들어 폴리카보네이트, 아크릴로니트릴부타디엔스티렌(acrylonitrile butadiene styrene; ABS) 등의 소재가 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 상부 및 하부 케이스는 별도로 제작하여 결합 홈, 결합 돌기 등을 구비하여 통상의 수단으로 결합될 수 있고, 경우에 따라서는 일체형으로 제조될 수 있다.

나아가 상기 임신진단키트는 융모성성선자극호르몬이 포함된 검체에 대한 검사선과 이종 검사선의 색상 기준표를 포함하는 표준 신호 데이터가 추가로 함께 제공될 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 표준 신호 데이터란, 다양한 농도의 융모성성선자극호르몬이 포함된 검체에 대하여, 본 발명의 이종 검사선을 구비한 면역크로마토그래피 스트립을 사용해 각각에 대한 검사선과 이종 검사선에서의 나타나는 골드입자의 신호 세기를 정리한 데이터를 의미한다. 이러한 표준 신호 데이터는 다양한 형태로 정리될 수 있으며, 대표적으로 각각의 융모성성선자극호르몬의 농도에 대응하는 검사선과 이종 검사선의 색상으로 정리될 수 있다. 특히 상기 색상 기준표를 포함하는 표준 신호 데이터의 경우에는, 단순히 육안으로도 신호의 세기를 표준 신호 데이터와 용이하게 비교할 수 있기 때문에, 간편하고 신속하게 반정량적인 분석이 가능할 수 있다. 이와 관련하여, 상기 진단 키트는, 상기 검사선과 상기 이종 검사선으로부터 항 융모성성선자극호르몬과 결합된 골드입자의 신호 유무 및 세기를 육안으로 확인함으로써, 정성 또는 반정량 분석을 수행하도록 할 수 있다. 즉, 앞서 제공될 수 있는 색상 기준표를 포함하는 표준 신호 데이터와, 상기 키트에 검체를 전개시킨 후 상기 검사선과 상기 이종 검사선에 나타나는 골드입자의 신호 유무 및 세기를 육안으로 비교함으로써, 검체 내 융모성성선자극호르몬의 측정을 통하여 임신진단 및 융모성성선자극호르몬 농도를 분석할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 임신진단 면역크로마토그래피 스트립을 사용하여 검체 내 융모성성선자극호르몬을 정성 또는 정량 분석하는 방법으로서, 검체를 상기 샘플 패드 또는 케이스의 검체투입구에 투입하여 전개시키는 제1단계; 검사선과 이종 검사선으로부터 골드입자의 신호 유무 및 세기를 확인하는 제2단계; 및 검사선과 이종 검사선으로부터 확인된 신호 세기를 표준 신호 데이터와 비교하여 의 양을 측정하는 제3단계를 포함하며, 상기 표준 신호 데이터는 여러 기지농도의 이 포함된 검체들에 대하여, 각각 상기 제1단계 및 제2단계를 수행하여 얻어진 것인 분석 방법을 제공한다.

구체적인 분석 방법을 수행함에 있어서, 하기의 순서로 진행할 수 있다. 먼저, 융모성성선자극호르몬이 포함된 검체를 스트립의 샘플패드 또는 케이스의 검체 투입구에 투입한다. 상기와 같이 검체가 면역크로마토그래피 스트립에 로딩(도입)되면 전개가 시작되고, 그 후 대조선을 통해 검체의 전개가 잘 이루어졌는지 확인할 수 있다. 검체의 전개가 잘 이루어 졌다면, 검사선과 이종 검사선으로부터 골드입자의 신호 유무 및 세기를 확인한다. 검사선으로부터 신호가 확인됐다면, 이는 융모성성선자극호르몬이 검체 내에 임신을 진단할 수 있는 농도(25mIU/mL, 대한약전, 의약품각조 제 3부 체외진단용의약품, 임신진단용 스트립) 이상이 포함되어 있음을 나타낸다 (정성분석). 나아가 검사선과 이종 검사선으로부터 확인된 골드입자의 신호 세기를 표준 신호 데이터와 비교하여, 이 검체 내에 어느정도의 농도로 융모성성선자극호르몬이 포함되어 있음을 확인할 수 있다 (정량분석).

본 발명의 구체적인 실시예에서 이종 검사선을 추가로 포함하는 임신진단용 면역크로마토그래피 스트립을 이용한 임신진단키트의 분석을 수행함으로써, 검체 내 표적물질의 농도가 25mIU/mL 내지 800,000mIU/㎖ 범위에서 후크 현상의 발생에도 불구하고 육안으로 신뢰성 높은 정량분석이 가능함을 확인하였다 (표 1, 도 5).

본 발명의 면역 분석을 위한 검체로는 임신진단을 위한 가임기 여성의 소변을 사용한다.

본 발명의 임신진단키트는 이종 검사선을 구비한 면역크로마토그래피 스트립을 사용하여 후크 현상으로 인한 위음성의 문제를 극복함으로써, 육안으로 임신 여부를 보다 정확하게 수행할 수 있다. 나아가 검사선과 이종 검사선과의 상호 보완을 통하여 분석 물질의 농도 측정 범위가 개선된 효과가 있다. 또한 이를 통해 더욱 신뢰할 수 있는 임신진단을 실행하여 예비산모와 태아의 건강을 도모하며 건강한 출산을 장려할 수 있다.

도 1은 통상적인 임신진단키트에 사용되는 면역크로마토그래피 스트립의 단면을 나타낸 개요도이다.
도 2는 본 발명의 임신진단키트에 사용되는 이종 검사선을 구비한 임신진단용 면역크로마토그래피 스트립을 나타낸 개요도이다.
도 3은 본 발명의 임신진단키트의 이종 검사선을 구비한 면역크로마토그래피 스트립에 있어서, 검체를 도입하기 전 및 검체 도입 후의 검사선, 이종 검사선 및 불변 대조선의 양상을 나타낸 개요도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 임신진단용 면역크로마토그래피 스트립의 모식도이다.
도 5는 본 발명의 이종 검사선을 구비한 임신진단용 면역크로마토그래피 스트립을 케이스에 조립하여 제조한 임신진단키트를 사용한 실시예에 따른, 다양한 농도의 검체내 인간융모성성선자극호르몬의 농도에 대한 분석 결과를 비교하여 나타낸 사진도이다.

실시예 1: 면역크로마토그래피 스트립의 제조

A. 검사선 , 이종 검사선 및 대조선이 형성된 검출패드 제작

3개의 분석선을 니트로셀룰로오스막(nitrocellulose membrane)에 분주하였다. 라미네이터기(laminator)를 이용하여 니트로셀룰로오스막을 플라스틱카드에 라미네이션(lamination)하였다. 그 후, 검사선의 제2항-인간융모성성선자극호르몬 항체로서 단일클론 항-인간융모성성선자극호르몬 항체 (moclonal anti-hCG, Medix, Finland)를, 이종 검사선에는 인간융모성성선자극호르몬(hCG)을, 대조선의 리간드로는 산양 항-쥐이뮤노글로불린 항체(anti-mouse antibody from goat, arista, USA)을 이용하여, 이들을 각각을 자동분주기를 이용하여 분주한 후, 25~30℃에서 2일(48시간) 동안 건조시켰다.

B. 접합체 패드(conjugate pad)제작

0.5% PVA (polyvinylalcohol)가 함유된 트리스완충액(10mM, pH 8.5)으로 패드를 충분히 적셔 건조기에서 완전히 건조시켜 접합체 패드를 전처리하였다.

직경이 약 40nm인 콜로이드성 골드입자(colloidal gold particle)와 제1항- 융모성성선자극호르몬 항체로서 복합클론 항-인간융모성성선자극호르몬항체 (polyclonal anti-hCG from goat, arista, USA)가 결합된 제1접합체 용액을 준비하였고, 또한 직경이 약40nm인 콜로이드성 골드입자와 쥐이뮤노글로불린(mouse IgG, Arista, USA)이 결합된 제2접합체 용액을 준비하였다. 상기 제1접합체 용액 및 제2접합체 용액을 전처리된 접합체 패드에 분주하고, 완전히 건조시킨 후, 이를 적절한 크기로 절단하여 준비하였다.

C. 샘플패드 (sample pad) 제작

1% Triton X-100, 0.5% NaN3, 0.1% BSA가 함유된 0.08 M borate 완충액에 샘플패드를 충분히 적셔, 건조기에서 완전히 건조시킨 후, 이를 적절한 크기로 절단하여 준비하였다.

D. 흡습패드 ( absorbance pad) 제작

흡습패드는 건조기에서 수분을 완전히 건조시킨 상태로 아무런 처리없이 그대로 사용하며, 이를 적절한 크기로 절단하여 준비하였다.

E. 면역크로마토그래피 스트립의 제작

위의 각 과정을 통해 준비된 검출패드, 접합체 패드, 샘플패드 및 흡습패드를 도 4에 나타난 구조대로 조립한다.

즉, 샘플패드를 접합체 패드의 일 말단과 중첩되도록 부착하고, 검출패드의 일 말단을 상기 접합체 패드의 다른 일 말단과 중첩되도록 부착하고, 검출패드의 다른 일 말단과 흡습패드의 일 말단을 서로 중첩되도록 부착하였다. 이를 절단기를 이용하여 4 ± 2.0 mm 정도로 절단하여 도 4와 같은 스트립을 제조하였다.

도 4에 있어서, 각각의 도면 부호가 의미하는 바는 아래와 같다.

1: 샘플패드; 16±4×4±2 mm

2: 제1항-인간융모성성선자극호르몬 항체와 골드입자의 접합체 패드;

6±1.0×4±2 mm

3: 니트로셀룰로오스 검출패드; 25±5×4±2 mm

4: 플라스틱 고체 지지체

5: 흡습패드; 18±4×4±2 mm

6: 제2항-인간융모성성선자극호르몬 항체가 고정된 검사선

7: 인간융모성성선자극호르몬이 고정된 이종 검사선

8: 항-쥐이뮤노글로불린이 고정된 대조선

F. 케이스 조립

제조된 임신진단용 면역크로마토그래피 스트립을 플라스틱 하부 케이스의 스트립 고정 위치에 넣은 후 검체투입구와 결과 확인창이 있는 상부 케이스를 끼운 후 압착기로 눌러 조립한다.

실시예 2: 이종 검사선을 구비한 임신진단용 면역크로마토그래피 스트립을 이용한 검체내 인간융모성성선자극호르몬의 정성 및 정량 분석

비임신소변에 인간(hCG) 표준물질을 스파이킹하여 융모성성선자극호르몬 표준검체를 제조하여 정량 및 정성 시험을 실시하였다. 제조된 표준검체 용액을 케이스의 검체 투입구에 100㎕씩 분주 후 5분간 전개시켰다. 검체 용액에는 인간융모성성선자극호르몬 농도가 각각 0mIU/ml, 25mIU/ml, 50mIU/ml, 100mIU/ml, 200mIU/ml, 400mIU/ml, 800mIU/ml, 1600mIU/ml, 3200mIU/ml, 6400mIU/ml, 12,800mIU/ml, 25,600mIU/ml, 51,200mIU/ml, 100,000mIU/ml, 200,000mIU/ml, 400,000mIU/ml, 800,000mIU/mL가 되도록 준비하였다.

도 5는 인간융모성선자극호르몬의 농도에 따른 임신진단용 면역크로마토그래피 스트립의 전개 결과를 나타낸 사진도이다.

나아가, 검사선, 이종 검사선 및 불변 대조선에서 나타나는 신호의 세기를 육안으로 확인하여, 아래의 표 1에 나타내었다. 이때, 각각의 신호 세기는 색의 강도를 통해 판단하였으며, 가장 높은 색도를 임의적으로 5로 기준 잡고, 가장 낮은 색도를 0으로 기준 잡아 나타내었다.

인간융모성성선자극호르몬농도 {mIU/mL}	0	25	50	100	200	400	800	1600	3200	6400	12800	25600	51200	100000	200000	400000	800000
대조선	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5
이종검사선	5	5	5	5	5	4.5	4	3.5	3	2.5	1.5	1	0.5	0	0	0	0
검사선	-	0.5	1	1.5	2.5	3	3.5	4	4.5	5	4.5	3.5	3	2	1	0.5	0.1

표 1에 나타난 바와 같이, 검체 내의 인간융모성선자극호르몬의 농도가 증가할수록 검사선의 골드입자의 신호 세기는 점차 증가하여, 약 6,400mIU/mL 정도에서 가장 강한 세기를 보이다가, 점차 감소함을 확인할 수 있었다. 이는 앞서 언급한 후크(hook) 현상에 의한 것이다. 따라서, 검사선의 신호 세기 만으로는 표적물질의 농도를 정량적으로 분석할 수 없다.

예를 들어, 검사선의 신호 세기가 2~2.5인 경우는, 검체 내 인간융모성성선 자극호르몬의 농도가 약 200mIU/ml인 부근과 약 100,000mIU/ml인 부근에서 나타남 을 확인할 수 있으므로, 검사선에서 나타나는 신호 세기가 같거나 비슷하여도 융모 성성선자극호르몬의 농도는 상이할 수 있는 것이다.

그러나 이종 검사선의 경우, 검체 내의 농도가 증가할수록 신호 세기는 점차 감소함을 확인할 수 있었다. 구체적으로, 융모성성선자극호르몬의 농도가 0에서부터 200mIU/ml 까지는 신호의 세기가 가장 높은 5로 거의 일정하게 유지됨을 확인할 수 있다. 이와 같이 융모성성선자극호르몬의 농도가 낮은 경우는, 상기 검사선에서 후크 현상이 발생하지 않으므로, 검사선의 신호 세기를 통해 융모성성선자극호르 몬의 농도를 분석할 수 있다. 융모성성선자극호르몬의 농도가 더 증가하는 경우, 검사선에서는 후크 현상의 발생으로 신호의 세기가 불규칙하지만, 이종 검사선은 신호의 세기가 계속하여 감소하므로, 이종 검사선을 통해 융모성성선자극호르몬의 농도를 분석할 수 있다.

예를 들어, 검사선의 신호 세기가 2~2.5인 경우, 검사선은 앞서 설명한 바와 같이 융모성성선자극호르몬의 농도가 약 200mIU/ml인 부근과 약 100,000mIU/ml인 부근으로 두가지가 존재할 수 있으나, 이종 검사선은 각각의 농도에 대하여 신호 세기가 5 또는 0로 나타나므로, 종래 검사선 1개만으로는 측정이 불가능 했던 농도를 정량적으로 측정할 수 있음을 확인할 수 있다.

또한 상기 임신진단용 면역크로마토그래피 스트립의 융모성성선자극호르몬에 대한 농도 측정 범위(dynamic range)가 25mIU/ml부터 800,000mIU/ml이상까지 넓게 나타남을 확인할 수 있다.

-

Claims (3)

1. 접합체 패드 및 검출패드를 구비한 임신진단용 면역크로마토그래피 스트립에 있어서, 검체내 융모성성선자극호르몬을 측정하는 검사선이 두개 이상이 있으며 서로 다른 원리의 면역 측정 방법을 사용하는 방법
2. 제 1항에 있어서 서로 다른 면역 측정 방법으로 샌드위치 면역 측정방법과 경쟁적 면역측정방법을 사용하는 임신진단용 측정키트
3. 제1항에 있어서
   상기 접합체 패드는 검체내 융모성성선자극호르몬과 반응하는 제1접합체로서 제1일정량의 제1항-융모성성선자극호르몬 항체와 결합한 골드입자 접합체를 구비하고, 상기의 제1접합체는 검체 전개 시 검출패드로 이동할 수 있고, 검체와 전개시 일부는 검체내 융모성성선자극호르몬과 반응하여 상기 제1접합체와 결합된 복합체를 형성하며
   상기 검출패드는 검사선, 이종 검사선, 대조선이 격리되어 구비되어 있고,
   상기 검사선은 상기 제1접합체의 제1항-융모성성선자극호르몬 항체와 복합체를 형성한 검체내 융모성성선자극호르몬과 반응하는 제2항- 융모성성선자극호르몬 항체가 고정되어 있고,
   상기 이종 검사선은 융모성성선자극호르몬 또는 제1항 융모성성선자극호르몬 항체와 반응하는 융모성성선자극호르몬 유사체가 제2일정량으로 고정되어 있어서, 검체 내 융모성성선자극호르몬과 결합되지 않은 제1접합체의 베어(bare) 접합체와 반응할 수 있으며
   상기 검사선 및 상기 이종 검사선 상의 포획된 제1접합체의 골드물질로부터의 신호를 측정하여 그 신호세기로 검체 내 임신 유무, 또는 융모성성선자극호르몬 농도 또는 둘 모두를 측정할 수 있는 것인 면역크로마토그래피 스트립.

Images