WO2021002528A1 - 베타 코어 단편 hcg를 표지자로 포함하는 신규 임신 진단 장치 - Google Patents

Abstract

본 발명의 면역 장치는 1) 분석하고자 하는 피검 시료를 수용하는 검체 영역; 2) 상기 검체 영역과 연동되어 있고, 탐침물질-표지가 접합된 항 I-hCG 항체 및 탐침물질-표지가 접합된 항βcf hCG 항체를 포함하는 콘쥬게이트 영역; 및 3) 상기 검체 영역에 연결되어, 항 I-hCG 항체가 고정된 제1검출라인, 항βcf hCG 항체가 고정된 제2검출라인 및 대조라인을 포함하는, 상기 콘쥬게이트 영역과 연동된 신호검출 영역; 및 4) 신호검출반응이 종료된 피검 시료를 흡수하는, 상기 신호검출 영역의 다운스트림에 위치하는 흡수 영역을 포함하여 고농도의 hCG에 의한 후크 효과 및/또는 hCG-βcf의 간섭 효과에 의한 위음성을 최소화하여 정확한 임신 진단이 가능하다.

Description

베타 코어 단편 HCG를 표지자로 포함하는 신규 임신 진단 장치

본 발명은 임신 진단용 면역 장치, 그리고 이를 사용한 임신 진단 방법에 관한 것이다.

인간융모막성 생식선 자극호르몬(human chorionic gonadotropin; hCG)은 임신 중에 생성되는 당단백질 호르몬이다. hCG는 태반의 융모세포 영양막에서 생성되어 임신초기에 프로게스테론을 계속 생산하도록 하여 태반기능이 완성되는 임신 10주까지 착상을 유지시켜 주는 기능을 한다. 체내 활성 형태인 완전형 hCG(Intact hCG; I-hCG)는 약 37kDa의 분자량을 가지며 244개의 아미노산으로 구성된다. I-hCG는 크게 알파(α)와 베타(β) 2개의 서브 유닛(subunit)으로 이루어져 있으며, 알파-서브 유닛은 92개의 아미노산을 포함하고 베타-서브 유닛은 145개의 아미노산을 포함한다. I-hCG는 일반적으로 임신 기간 중 다양한 단계에 존재하며 체내에 존재하는 주된 구조이며, 임신초기에는 이러한 활성형 구조가 높은 비율로 다당쇄 hCG(hyperglycosylated hCG; H-hCG) 형태로 존재한다. 상기 활성형 외에도 hCG의 다양한 해리 및 분해 생성물이 혈액 및 소변에서 발견되며, 이들은 단편화 hCG(nicked hCG; N-hCG), 유리 베타 hCG(free β-hCG), 유리 알파 hCG(free α-hCG), 유리 베타 코어 단편 hCG(free β-core fragment hCG) 등으로 존재한다.

베타 코어 단편 hCG(βcf hCG)는 hCG의 하나의 뚜렷한 분해 산물인 free β -hCG의 단편이며 약 14kDa의 분자량을 가진다. βcf hCG는 임신 2주 이후부터 소변에서 I-hCG 대비 적은 양인 약 0.01pmol/mL 농도로 나타나기 시작하며, 임신 주수가 경과함에 따라 점차 증가하여, 5주가 경과하면 I-hCG 보다 우세한 농도로 나타난다. 또한, βcf hCG는 다른 대사산물과는 다르게 오직 소변에만 존재한다(J ClinEndocrinolMetab, 76, 1993, 704-10).

I-hCG의 농도는 혈청 및 소변에서 9-12주 사이에 가장 높은 수치를 보이며, 임산부의 소변 내 농도는 10주에 150,000mIU/mL 이며, 개인차에 따라 900,000mIU/mL의 높은 농도로 검출되기도 한다. 현재 사용되는 임신진단키트는 임신 초기(마지막 생리일 기준 3~5주)에 I-hCG를 정성 진단하여 임신여부를 판정한다. 그러나, 임신으로 판정된 11,760명에 대해 기존 임신진단키트로 시험결과 약 0.2%인 22명이 위음성(False negative)으로 확인되었고, 이들에 대한 I-hCG 농도는 최대 268,022.5IU/mL로 측정(J. Emergency Medicine 2013, 44:155)되어, 현재의 임신진단키트가 후크현상(Hook Effect)으로 인한 위음성 문제가 발생하고 있음을 시사한다.

임신 진단에서 위음성은 응급실(emergency department, ED) 상황에서 심각한 결과를 초래할 수 있다. 예를 들어 여성 환자가 임신하였음에도 불구하고 소변을 이용하여 일반 임신진단키트로 측정 시 위음성 결과가 나오게 되면, 여성환자의 치료에 있어 태아를 고려하지 않고 치료를 행하게 되는 의료 사고가 발생할 수 있다. 즉, 자궁 외 임신을 진단하지 못하거나, 임신 시 금지되는 약물 투여 또는 태아의 방사선 피폭 및 이에 따른 쟁송 등의 문제를 야기한다 FDA의 MAUDE(Manufacturer and user facility device experience database) 조사 결과, 임신 정성 검사에서 음성으로 판정되어 자궁 경부 생검을 실시하였으나 이후 혈청검사에서 I-hCG가 탐지된 사례, 소변을 이용한 임신 테스트에서 음성으로 판정되어 CT 촬영을 실시하였으나 이후 임신 8주로 판명된 사례, 임신 음성으로 판단되어 자궁 내 피임기구를 설치하거나, 외과적 수술을 감행하였으나 추후 검사에서 임신으로 판정 된 사례 등이 보고된 바 있다(Nerenz et al., Clinical Chemistry 61:3, 483-486, 2015).

소변을 이용한 임신진단키트는 일반적으로 I-hCG에 대한 항체를 표지물질로 사용하여 검출라인(Test line)에서 I-hCG를 검출하나 다음의 경우 임신 진단에 있어 위음성의 결과가 나올 수 있다. I-hCG가 소변에 다량 존재하여 진단키트 멤브레인에 고정된 검출 항체 및 골드 또는 형광 등의 탐침물질-표지가 접합된 항체를 포화시켜 진단키트의 I-hCG 검출라인에서의 샌드위치 형성을 방해하는 경우, 즉 후크현상일 경우 위음성의 결과가 나올 수 있고, βcf hCG가 소변에 높은 농도로 존재하여탐침물질-표지가 접합된 자유부유 I-hCG 항체가 βcf hCG와결합함으로써 I-hCG와의 결합을 방해하고 간섭을 함으로써 비록 I-hCG가 진단키트의 검출라인에 고정된 검출 항체와 결합함에도 불구하고 βcf hCG와 결합한 자유부유 I-hCG 항체가 항원인 I-hCG와 결합하지 못하여, 샌드위치 형성을 방해하는 경우 발생한다(Griffey et al., The journal of Emergency Medicine, 44, 2013, 155-160).

즉, 소변을 이용한 임신진단키트는 I-hCG가 고농도일 경우에는 후크 현상으로 임신 진단에 있어 위음성 결과가 나올 수 있으며, 또한 βcf hCG가 고농도일 경우에도 위음성의 결과를 초래할 수 있다고 보고된 바 있다(Diwan, Med. Lab. Obeserver, 2011, 18-20; Cervinski et al., Clin. Chem. Lab. Med. 48(7), 2010, 935-942; Gronowski et al., Clin. Chem., 55(7), 2009, 1389-1394). 따라서, 마지막 생리일(last menstrual period, LMP) 이후 약 2주 이후에는 βcf hCG의 농도가 증가하여 I-hCG의 샌드위치 형성을 방해하는 간섭효과를 나타내어 위음성의 결과가 나올 수 있다.

이전의 임신진단키트는 I-hCG 만을 감지하는 것이 대부분이며 진단에 있어 위음성 문제를 해결하기 위하여 일부 임신진단키트의 경우 I-hCG 이외에 hCG-H 및 hCG-β의 일부 조합을 감지하고 있다. 따라서, 고농도의 I-hCG로 인한 후크현상에 의한 위음성 혹은 βcf hCG에 의한 정상적인 샌드위치 형성 방해로 인한 위음성의 결과가 초래될 수 있었다. 또한, I-hCG와 βcf hCG 그리고 다른 종류의 hCG 호르몬을 하나의 검출라인에서 동시에 감지하는 제품의 경우는 βcf hCG에 반응성을 보이지만 고농도의 I-hCG 및 βcf hCG가 섞인 검체에 대해 1개의 라인에서 상호 간섭 효과로 인한 위음성 결과를 야기했다. 예를 들어, C&D사의 임신진단키트는 1개의 검출라인에 I-hCG 이외에 βcf hCG, 그리고 다른 종류의 변이된 hCG를 감지하는 항체를 포함하고 있으나, 상호 간섭 효과로 인하여 검출라인에서의 민감도가 저하되어 위음성 결과가 나오는 문제가 발생하고 있다.

이에 본 발명자들은 임신진단키트와 관련한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 연구를 계속하던 중, I-hCG를 감지하는 검출라인 이외에 βcf hCG를 감지하는 검출라인을 별도로 추가하고, 상호 간섭현상이 발생하지 않는 I-hCG 항체 및 βcf hCG 항체를 각각 배치함으로써 고농도의 I-hCG에 의한 후크현상이 발생하더라도 βcf hCG 검출라인의 발색을 통해 임신 여부를 정확하게 진단하여 위음성 결과를 최소화한 임신진단키트를 발명하였다.

이에 본 발명자들은 임신진단키트와 관련한 종래 기술의 문제점인 후크 현상 등으로 인한 위음성 결과를 최소화한 I-hCG를 감지하는 제1검출라인 외에 βcf hCG를 감지하는 제2검출라인을 별도로 추가한 면역 장치를 개발하여 고농도의 I-hCG에 의한 후크현상이 발생하더라도 βcf hCG 감지를 통하여 임신 여부를 진단하고, βcf hCG의 간섭현상에 의한 위음성을 최소화한 면역 장치 및 임신 진단 방법을 발명하여 정확한 임신 진단이 가능하도록 하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 βcf hCG를 특이적으로 인식하는 항체를 포함하는 임신진단키트를 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 분석하고자 하는 피검 시료를 수용하는 검체 영역(Sample region);

2) 상기 검체 영역과 연동되어 있고, 탐침물질(Probe)에 접합된 항 I-hCG 항체 및 탐침물질에 접합된 항 βcf hCG 항체를 포함하는 콘쥬게이트 영역(Conjugate region);

3) 상기 검체 영역에 연결되어, 항 I-hCG 항체가 고정된 제1검출라인, 항 βcf hCG 항체가 고정된 제2검출라인 및 대조라인을 포함하는, 상기 콘쥬게이트 영역과 연동된 신호검출 영역; 및

4) 신호검출 반응이 종료된 피검 시료를 흡수하는, 상기 신호검출 영역의 다운스트림에 위치하는 흡습 영역을 포함하는 임신 진단용 면역 장치를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, 상기 2)의 탐침물질은 금 나노 입자, 은 나노 입자, 퀀텀닷(quantum dot) 나노 입자, 카본 나노 입자, 라텍스 비드/형광 나노 입자, 셀룰로오스 나노 입자, 자기 나노 입자. 실리카 나노 입자, 폴리머 비드(polymer bead), 형광물질(fluorescein), 발광물질(Luyminescent substances), 색소(dye), 단백질로 구성된 군으로부터 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, 상기 3)의 신호검출 영역은 항 I-hCG 항체가 고정된 제1검출라인, 상기 제1검출라인의 다운스트림에 항 βcf hCG 항체가 고정된 제2검출라인 및 상기 제2검출라인의 다운스트림에 대조라인을 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 상기 3)의 신호검출 영역은 항 βcf hCG 항체가 고정된 제2검출라인, 상기 제2검출라인의 다운스트림에 항 I-hCG 항체가 고정된 제1검출라인 및 상기 제1검출라인의 다운스트림에 대조라인을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, 상기 3)의 신호검출 영역은 니트로셀룰로오스, 셀룰로오즈, 폴리에틸렌, 폴리에테르설폰 및 나일론으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 한다.

상기 4)의 흡습영역은 다공성지지체 및 상기 다공성지지체의 공동(pore)에 분산되거나 다공성지지체의 섬유사에 흡착 또는 코팅되어 있는 흡수제를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 면역 장치는 1) 대조라인 및 제1검출라인, 2) 대조라인 및 제2검출라인 또는 3) 대조라인, 제1검출라인 및 제2검출라인에 발색선이 나타났을 때 임신인 것으로 판정하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면,

1) 시료를 상기 면역 장치에 적용하여 시료 내 I-hCG 및 βcf hCG가 탐침물질-표지가 접합된 항 I-hCG 항체 및 항 βcf hCG 항체와 반응하는 단계;

2) 제1검출라인 및 제2검출라인에 의해 시료 내 I-hCG 및 βcf hCG의 반응을 확인하는 단계로서, I-hCG, βcf hCG는 각각의 검출 라인에서 샌드위치 복합체의 존재에 의해 발생하는 신호에 의해 감지되는 단계; 및

3) 대조라인 및 제1검출라인에 발색선이 나타나거나, 대조라인 및 제2검출라인에 발색선이 나타나거나, 대조라인, 제1검출라인 및 제2검출라인에 발색선이 나타났을 때 임신인 것으로 판정하는 단계를 포함하는 임신 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 면역크로마토그래피 스트립은 I-hCG를 감지하는 검출라인 외에 βcf hCG를 감지하는 검출라인을 추가로 포함하여 고농도의 I-hCG에 의한 후크 현상 및/또는 βcf hCG의 간섭현상에 의한 위음성을 최소화하여 정확한 임신 진단이 가능하도록 하였다.

도 1은 본 발명에 따라 제조된 면역크로마토그래피 스트립의 구현 예를 보여주는 개요도이다.

도 2는 본 발명에 따른 면역크로마토그래피 스트립을 키트에 적용하는 구체예를 보여주는 모형도이다. 1은 진단 키트의 판독창을 나타내며, 2는 시험의 종료를 나타내는 대조라인이다. 3과 4은 검출라인을 나타내며, 5는 피검 시료를 투입하는 검체 영역을 나타낸다.

도 3은 I-hCG 및 βcf hCG 농도에 따른 본 발명에 따라 제조된 면역크로마토그래피 스트립을 포함하는 키트의 제1 및 제2검출라인 및 대조라인의 양상을 나타낸다.

도 4는 타 사 임신진단키트와 비교한 본 발명의 면역크로마토그래피 스트립을 포함하는 키트의 βcf hCG 반응 평가 결과를 나타낸다.

도 5는 일반적인 임신진단 면역크로마토그래피 스트립에서 위음성으로 판정되는 경우에도 본 발명의 이종검출라인을 구비한 면역크로마토그래피 스트립에서 임신 양성으로 판정이 가능함을 비교하여 나타낸다.

도 6은 비교예 1(C&D 사의 임신 진단 키트)와 본 발명의 비교 실험 결과를 나타낸다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 아래 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시를 위한 구체적인 내용을 상세히 설명한다. 도면에 관계없이 동일한 부재번호는 동일한 구성요소를 지칭하며, "및/또는"은 언급된 아이템들의 각각 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함한다(comprises)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급된 구성요소 외에 하나 이상의 다른 구성요소의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.

다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다.

이하, 본 발명의 실시예들에 따른 임신 진단용 면역 장치 및 이를 사용한 임신 진단 방법에 관해 설명한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 임신 진단용 면역 장치는,

1) 분석하고자 하는 피검 시료를 수용하는 검체 영역;

2) 상기 검체 영역과 연동되어 있고, 탐침물질-표지가 접합된 항 I-hCG 항체 및 탐침물질-표지가 접합된 항 βcf hCG 항체를 결합시킨 콘쥬게이트 영역;

3) 상기 검체 영역에 연결되어, 항 I-hCG 항체가 고정된 제1검출라인, 항 βcf hCG 항체가 고정된 제2검출라인 및 대조라인을 포함하는, 상기 콘쥬게이트 영역과 연동된 신호검출 영역; 및

4) 신호검출반응이 종료된 피검 시료를 흡수하는, 상기 신호검출 영역의 다운스트림에 위치하는 흡습 영역을 포함한다.

상기 검체 영역은 가임기 여성의 혈액 또는 소변과 같은 액상 시료를 수용하는 것이 바람직하나, I-hCG 및/또는 βcf hCG를 포함하는 것으로 예상되는 시료라면 모두 사용 가능하다.

상기 검체 영역은 분석물질에 대한 선택성을 보다 향상시키기 위해 또는 상기 시료에 포함될 수 있는 간섭물질에 의한 영향을 최소화하기 위해, 필터링의 기능을 추가로 가질 수 있다. 필요한 경우, 상기 검체 영역의 업스트림에 분석물질과 콘쥬게이트 사이의 반응을 증가시키거나 또는 간섭물질에 의해 영향을 배제할 수 있는 물질을 포함하는 보조 영역을 추가로 구비할 수 있다.

상기 콘쥬게이트 영역의 대조라인은 피검 시료 중 I-hCG 또는 βcf hCG의 농도와 관계없이 일정한 신호를 내는 부분을 의미한다. 상기 대조라인은 I-hCG 또는 βcf hCG와는 결합하지 않으면서, 피검 시료와 함께 이동상에 의해 검출영역을 따라 이동하는 제3콘쥬게이트와 결합하는 리간드를 고정시켜 형성할 수 있다. 검체 중의 I-hCG 및 βcf hCG의 존재 유무와 무관하게 일정한 신호를 방출할 수 있는 리간드를 고정시키는 것이다. 따라서, 제1콘쥬게이트 및/또는 제2콘쥬게이트가 타겟 시료와 결합되지 않아 제1검출라인 및/또는 제2검출라인을 지나치더라도 제3콘쥬게이트가 시료와 결합되어 대조라인 상에서 포획될 수 있다. 예를 들면, 시료 내에 타겟 시료가 존재하지 않는 경우, 검출라인에서 색상 등이 발현하지 않더라도 대조라인에서는 색상 등이 발현하게 된다. 이처럼, 상기 대조라인에서의 응답(response)은 액상 샘플이 센서를 적절히 통과하고 있음을 의미한다. 상기 제3콘쥬게이트는 마우스 IgG 또는 치킨 IgY 등이 사용될 수 있다. 상기 대조라인으로 항-래빗 IgG, 항-치킨 IgY, 스트렙트아비딘(streptavidin), 소혈청알부민, 산양 항-마우스 IgG 또는 산양-항-치킨 IgY 등이 사용될 수 있다.

상기 콘쥬게이트 영역의 탐침물질은 금 나노 입자, 은 나노 입자, 퀀텀닷(quantum dot) 나노 입자, 카본 나노 입자, 라텍스 비드/형광 나노 입자, 셀룰로오스 나노 입자, 자기 나노 입자, 실리카 나노 입자, 폴리머 비드(polymer bead), 형광물질(fluorescein), 발광물질(Luyminescent substances), 색소(dye) 및 단백질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 탐침물질이 사용될 수 있다. 본 발명의 일 구현 예에 의하면 탐침물질이 콜로이드성 골드 나노입자이나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, 상기 3)의 신호검출 영역은 항 I-hCG 항체가 고정된 제1검출라인, 상기 제1검출라인의 다운스트림에 항 βcf hCG 항체가 고정된 제2검출라인 및 상기 제2검출라인의 다운스트림에 대조라인을 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 상기 3)의 신호검출 영역은 항 βcf hCG 항체가 고정된 제2검출라인, 상기 제2검출라인의 다운스트림에 항 I-hCG 항체가 고정된 제1검출라인 및 상기 제1검출라인의 다운스트림에 대조라인을 포함할 수 있다.

상기 신호검출 영역은 이동상과 시료가 전개되는 매질로서, 이동상과 피검 시료는 신호검출 영역의 다공성 멤브레인의 모세관 현상에 의해 이동할 수 있다. 신호검출 영역은 니트로셀룰로오스, PVDF, 폴리비닐(Polyvinyl) 수지 또는 폴리스티렌(Polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트(Well plate) 및 유리로 된 슬라이드 글라스(Slide glass)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 사용될 수 있다. 본 발명의 일 구현 예에 의하면 신호검출 영역은 니트로셀룰로오스가 사용되나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 일 구현 예에 의하면 5 내지 15μm의 기공을 가지는 니트로셀룰로스 멤브레인이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 흡습 영역은 다공성지지체 및 상기 다공성지지체의 공동에 분산되거나 다공성지지체의 섬유사에 흡착 또는 코팅되어 있는 흡수제를 포함할 수 있으며, 상기 다공성지지체의 상부면에 다공성필름층을 추가로 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 상기 흡수제는 염화칼슘, 염화마그네슘, 규조토, 벤토나이트, 백운석, 석고, 실리카겔 및 이들의 혼합물로 구성되는 군에서 선택될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 있어서, 제1검출라인 및 제2검출라인의 신호세기를 통한 시료 내의 표적 물질의 농도 측정 범위는 I-hCG는 25mIU/mL 이상이며, βcf hCG는 1 pmol/mL이상이다.

종래 면역크로마토그래피 스트립은 검체 내 표적물질이 일정 농도를 초과하게 되면 후크현상의 발생으로, 검출라인에서의 신호 세기가 오히려 감소하는 현상을 보인다. 그러나 본 발명의 2개의 검출라인으로 이루어진 면역 장치는 검체 내 I-hCG 농도가 증가하더라도 I-hCG 농도 증가에 의한 후크현상과 관계없이 βcf hCG를 감지하는 검출라인에 의해 임신으로 진단이 가능하고, 검체 내 βcf hCG 농도 증가에 의해 발생하는 간섭현상에 의한 위음성을 최소화하기 위하여 검출라인에 항 βcf hCG 항체를 포함한다. 따라서, 면역크로마토그래피 스트립 상의 대조라인 및 제1검출라인, 대조라인 및 제2검출라인 또는 대조라인 및 제1, 2검출라인에 착색선이 나타났을 때 임신인 것으로 판정한다. 따라서, 임신 약 3주 이후 βcf hCG의 증가에 의한 간섭현상에 의해 위음성으로 판단되던 기존 임신진단키트와 달리 항 βcf hCG 항체를 구비한 별도의 검출라인에 의해 βcf hCG의 존재를 검출하여 임신 여부를 정확히 진단한다. 따라서, 제1검출라인 및 제2검출라인의 조합을 통하여 종래 1개의 검출라인으로 한계가 있던 임신진단 범위를 넓히고 정확도를 개선한 특징이 있다.

본 발명에 있어서, 상기 콘쥬게이트 영역 내에 존재하는 항 I-hCG 항체 제1콘쥬게이트는 가임기 여성의 혈액 또는 소변등과 같은 액상검체와 멤브레인 쪽으로 이동 전개 시 검체 내 I-hCG와 결합하여 (I-hCG)-콘쥬게이트 제1복합체를 형성하게 된다. 상기 콘쥬게이트 영역 내에 존재하는 항 βcf hCG 항체 제2콘쥬게이트는 액상 검체와 신호검출 영역으로 이동 전개 시 검체 내 βcf hCG와 결합하여 βcf hCG-콘쥬게이트 제2복합체를 형성하게 된다. 상기 제1복합체는 전개되는 과정에서 제1검출라인에 고정된 항 I-hCG항체와 반응하고, 상기 제2복합체는 전개되는 중 제2검출라인에 고정된 항 βcf hCG 항체와 반응한다. I-hCG 검출라인의 신호의 세기는 검체 내의 I-hCG 농도가 증가함에 따라 증가하지만, 일정 농도 이상으로 증가하면 후크현상에 의해 오히려 신호의 세기가 감소하는 결과를 보인다. 본 발명의 면역크로마토그래피 스트립은 다량의 I-hCG에 의해 후크현상이 발생하더라도 제2검출라인에 의해 βcf hCG를 민감하게 검출하여 후크현상의 영향을 받지 않아 양성으로 판정할 수 있도록 하였다.

본 발명의 I-hCG 농도증가에 따른 제1검출라인 및 제2검출라인 결과는 도 3에 나타내었다. 후크현상이 발생하는 I-hCG의 농도에서 제2검출라인은 βcf hCG를 검출하여 임신으로 진단함을 확인하였다.

또한, 본 발명의 면역 장치는 하부에 고체지지대를 포함할 수 있다.

상기 고체지지대는 니트로셀룰로스, 나일론, 피브이디에프(PVDF), 유리 및 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택된 재료로 형성된 것일 수 있다. 상기 고체지지대 상에 스트립을 부착하여 제조하므로, 스트립의 내구성을 높일 수 있고, 취급 및 보관을 용이하게 할 수 있다. 또한, 추가적인 외부 디바이스 장착을 용이하게 할 수 있다.

상기 고체지지대로 사용될 수 있는 플라스틱 재질로는 폴리프로필렌(polypropylene) 필름, 폴리에스테르(polyester) 필름, 폴리카보네이트(polycarbonate) 필름, 아크릴(acrylic) 필름 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 면역 장치를 추가적으로 디바이스 내에 고정되는 것인 키트로서, 하부 디바이스에는 가이드 및 스트립 지지부가 구비되어 있고, 상부 디바이스에는 검체투입구; 및 제1검출라인 및 제2검출라인, 대조라인이 상응하는 위치에 결과확인창이 구비된 키트를 제공한다.

상기 상부 및 하부 디바이스는 통상의 플라스틱 소재를 이용하여 제조 될 수 있으며, 예를들어 폴리카보네이트, 아크릴로니트릴부타디엔스티렌(acrylonitrile butadiene styrene; ABS) 등의 소재가 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, 본 발명의 임신 진단용 면역 장치는

1) 대조라인 및 제1검출라인, 2) 대조라인 및 제2검출라인, 또는 3) 대조라인, 제1검출라인 및 제2검출라인에 발색선이 나타났을 때 임신인 것으로 판정하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 1) 피검 시료를 상기 면역 장치에 적용하여 시료 내 I-hCG 및 βcf hCG가 탐침물질-표지가 접합된 항 I-hCG 항체 및 탐침물질-표지가 접합된 항 βcf hCG 항체와 각각 반응하는 단계; 2) 제1검출라인 및 제2검출라인에 의해 시료 내 I-hCG 및 βcf hCG의 반응을 확인하는 단계로서, I-hCG, βcf hCG는 각각의 검출 라인에서 샌드위치 복합체의 존재에 의해 발생하는 신호에 의해 감지되는 단계; 및 3) 대조라인 및 제1검출라인에 발색선이 나타나거나, 대조라인 및 제2검출라인에 발색선이 나타나거나, 대조라인, 제1검출라인 및 제2검출라인에 발색선이 나타났을 때 임신인 것으로 판정하는 단계를 포함하는 임신 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 면역크로마토그래피 스트립을 이용하여 임신을 진단하는 방법을 제공한다.

1) 피검 시료를 상기 면역 장치에 적용하여 시료 내 I-hCG 및 βcf hCG가 탐침물질-표지가 접합된 항 I-hCG 항체 및 탐침물질-표지가 접합된 항 βcf hCG 항체와 각각 반응하는 단계; 2) 제1검출라인 및 제2검출라인에 의해 시료 내 I-hCG 및 βcf hCG의 반응을 확인하는 단계로서, I-hCG, βcf hCG는 각각의 검출 라인에서 샌드위치 복합체의 존재에 의해 발생하는 신호에 의해 감지되는 단계; 및 3) 대조라인 및 제1검출라인에 발색선이 나타나거나, 대조라인 및 제2검출라인에 발색선이 나타나거나, 대조라인, 제1검출라인 및 제2검출라인에 발색선이 나타났을 때 임신인 것으로 판정하는 임신 진단 방법을 제공한다.

실시예

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명하다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 면역크로마토그래피 스트립의 제조

A. 제1검출라인, 제2검출라인 및 대조선이 형성된 멤브레인 제작

3개의 분석 리간드를 멤브레인(nitrocellulose membrane)에 분주하였다. 제1검출라인의 I-hCG 항체로서 항-I-hCG 단클론항체 (Monoclonal anti-hCG)를, 제2검출라인의 βcf hCG 항체로서 항-βcf hCG 단클론항체 (Monoclonal anti- βcf hCG)를 대조선의 리간드로는 산양 항-쥐 면역글로불린(Goat anti-mouse IgG)을 분주 후 건조시켰다.

B. 콘쥬게이트 패드(conjugate pad) 제작

콜로이드성 골드나노입자(colloidal gold nanoparticle)와 항 I-hCG 항체(Monoclonal anti-hCG)가 접합된 제1콘쥬게이트 용액을 준비하였고, 콜로이드성 골드나노입자와 항-βcf hCG 항체(Monoclonal anti-βcf hCG)가 접합된 제2콘쥬게이트 용액을 준비하였다. 또한 콜로이드성 골드나노입자와 쥐 면역글로불린(Mouse IgG)이 결합된 제3콘쥬게이트 용액을 준비하였다. 상기 제1콘쥬게이트 용액, 제2콘쥬게이트 용액 및 제3콘쥬게이트 용액을 전처리된 콘쥬게이트 패드에 분주하고, 완전히 건조시킨 후, 적절한 크기로 절단하여 준비하였다.

C. 검체 패드(sample pad) 제작

완충제 및 보존제가 포함되어 있는 검체 패드 전처리 용액에 검체패드를 충분히 적셔, 완전히 건조시킨 후, 적절한 크기로 절단하여 준비하였다.

D. 흡습 패드(absorbance pad) 제작

건조되어 있는 상태의 흡습 패드를 적절한 크기로 절단하여 준비하였다.

E. 면역크로마토그래피 스트립의 제작

위의 각 과정을 통해 준비된 멤브레인, 콘쥬게이트 패드, 검체 패드 및 흡습 패드를 도 1에 나타난 구조대로 조립한다.

즉, 검체 패드를 콘쥬게이트 패드의 일 말단과 중첩되도록 부착하고, 검출패드의 일 말단을 상기 콘쥬게이트 패드의 다른 일 말단과 중첩되도록 부착하고, 검출 패드의 다른 일 말단과 흡습 패드의 일 말단을 서로 중첩되도록 부착하였다.

도 1에 있어서, 각각의 도면 부호가 의미하는 바는 아래와 같다.

1: 검체 패드부(Sample pad)

2: 콘쥬게이트 패드부(Conjugate pad)

3: 니트로셀룰로오스 멤브레인(Nitrocellulose membrane)

4: 흡습 패드(Absorbent Pad)

5: I-hCG 항체가 고정된 제1검출라인

6: βcf hCG 항체가 고정된 제2검출라인

7: 산양 항-쥐 면역글로불린이 고정된 대조라인

F. 디바이스 조립

제조된 임신진단용 면역크로마토그래피 스트립을 플라스틱 하부 디바이스의 스트립 고정 위치에 넣은 후 검체투입구와 결과확인창이 있는 상부 디바이스에 끼운 후 조립한다.

실시예 2 : I-hCG 및 βcf hCG 농도에 따른 면역크로마토그래피 스트립 분석

I-hCG와 βcf hCG 표준물질을 비임신 소변에 스파이킹하여 혼합된 표준시료를 제조하여 시험을 실시하였다. 제조된 표준시료 용액을 디바이스 검체투입구에 100㎕씩 분주하여 전개시켜 3분 이후부터 최대 10분 사이에 결과를 확인하였다. 제조된 표준시료 용액의 I-hCG와 βcf hCG의 농도는 아래와 같다(표 1).

	Cut-off Value	실험군 1	실험군 2	실험군 3	후크현상
					실험군 4	실험군 5
I-hCG (mIU/mL)	≥25	25	100	1,000	212,000	800,000
βcf hCG (pmol/mL)	≥1	1	10	100	10	500

도 3에 나타난 바와 같이, 검체 내의 I-hCG의 농도가 증가할수록 검출라인의 골드입자 신호세기는 점차 증가하여, I-hCG의 농도 1,000mIU/mL 를 갖는 실험군 3에서 가장 강한 세기를 보였으나, I-hCG 농도 212,000mIU/ml 및 800,000mIU/ml인 실험군 4 및 5에서는 후크현상에 의해 I-hCG을 감지하는 제1검출라인이 희미하거나 감지되지 않았다. 그러나 βcf hCG를 감지하는 제2검출라인의 경우, 검체 내의 I-hCG 농도가 증가하여 후크현상이 발생하는 것과 상관없이 βcf hCG를 감지할 수 있었다(도 3).

실시예 3 : 고농도의 βcf hCG에 의한 위음성 평가

βcf hCG에 의한 간섭현상으로 인한 위음성 평가를 위해 국내 타사 3개의 제품과 본 발명의 면역 장치를 비교 평가하였으며 평가 방식은 Nerenz et al.,의 스크리닝을 참조하였다(Nerenz et al., , Clinical chem, 2014, Vol. 60:4, 667-674)

비임신소변에 I-hCG 0.5pmol/mL(약 200mIU/mL)을 혼합한 시료, 비임신소변에 βcf hCG 50pmol/mL을 혼합한 시료, 비임신소변에 I-hCG 0.5pmol/mL 및 βcf hCG 500pmol/mL을 혼합한 시료를 사용하여 육안 판정하였다.

βcf hCG 50pmol/mL 시료를 처리하는 경우, I-hCG 0.5pmol/mL 및 βcf hCG 500pmol/mL 혼합 시료를 처리하는 경우, 타사 제품의 경우 밴드가 발색되지 않거나 매우 약하게 발색되는 위음성을 확인하였으며, 이는 실제 시료에서 위음성 판정의 가능성을 내포한다. 그러나 본 발명에 의한 면역 장치(ADTech)는 상기 모든 시료를 처리하는 경우 밴드가 발색되어 임신으로 진단하여 위음성의 문제를 해결하였다(도 4).

실시예 4 : 비교 실험

일반적으로 사용되어 온 임신 진단 테스트기의 검출 영역은 1개의 검출라인과 대조라인으로 이루어져 2줄이 나타나는 경우에 임신으로 진단을 한다. 따라서, 고농도 I-hCG에 의한 후크현상으로 인한 위음성이 발생하거나, 임신 초기의 βcf hCG의 간섭효과로 인해 위음성으로 진단 가능성이 있다. 반면 본원 발명의 면역스트립은 βcf hCG를 감지하는 선이 존재하여 고농도의 I-hCG에 의한 후크 현상 또는 임신 초기(LMP 2주 이후)부터 증가하는 βcf hCG에 의해 간섭현상이 발생하더라도 βcf hCG를 별도의 검출라인에서 감지하여 임신으로 판정 가능하므로 초기 및 후기 임신에서 발생하는 위음성 문제를 해결하였다(도 5).

또한, 본 발명에 따른 임신 진단 장치와 C&D 사의 임신 진단 키트(비교예 1)를 비교 실험하였다. 비교예 1의 경우 고농도의 βcf hCG 처리시 1개의 검출라인에서 양성반응을 나타냈다. 이는 비교예 1이 βcf hCG 간섭에 의한 후크효과를 보이지 않는 것을 입증하지만, 고농도의 I-hCG (약 3,000 IU/mL)를 βcf hCG와 같이 처리하였을 때, 1개의 검출라인 상에서는 상호 간섭 현상을 보이며 위음성이 발생하였다. 이에 반해 I-hCG, βcf hCG 검출라인을 분리한 것에 특징이 있는 본 발명에서는 고농도의 I-hCG에 상호 간섭현상을 받지 않고 βcf hCG 검출라인이 발색되어 양성으로 판정 가능하였다(표 2 및 도 6).

	결과
	본 발명 면역 장치	비교예 1
βcf hCG 500 pmol/mL	양성	양성
Intact hCG 100 mIU/mL + βcf hCG 500 pmol/mL	양성	양성
Intact hCG 0.5 mg/mL (3,000 IU/mL) + βcf hCG 500 pmol/mL	양성	음성(Hook effect)

Claims (6)

1) 분석하고자 하는 피검 시료를 수용하는 검체 영역;

2) 상기 검체 영역과 연동되어 있고, 탐침물질-표지가 접합된 항 I-hCG 항체 및 탐침물질-표지가 접합된 항 βcf hCG 항체를 포함하는 콘쥬게이트 영역; 및

3) 상기 검체 영역에 연결되어, 항 I-hCG 항체가 고정된 제1검출라인, 항 βcf hCG 항체가 고정된 제2검출라인 및 대조라인을 포함하는, 상기 콘쥬게이트 영역과 연동된 신호검출 영역; 및

4) 신호검출 반응이 종료된 피검 시료를 흡수하는, 상기 신호검출 영역의 다운스트림에 위치하는 흡수 영역을 포함하는 임신 진단용 면역 장치.

제1항에 있어서, 상기 2)의 탐침물질은 금 나노 입자, 은 나노 입자, 퀀텀닷(quantum dot) 나노 입자, 카본 나노 입자, 라텍스 비드/형광 나노 입자, 셀룰로오스 나노 입자, 자기 나노 입자, 실리카 나노 입자, 폴리머 비드(polymer bead), 형광물질(fluorescein), 발광물질(Luyminescent substances), 색소(dye) 및 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 임신 진단용 면역 장치.

제1항에 있어서, 상기 2)의 탐침물질은 금 나노 입자, 은 나노 입자, 퀀텀닷(quantum dot) 나노 입자, 카본 나노 입자, 라텍스 비드/형광 나노 입자, 셀룰로오스 나노 입자, 자기 나노 입자, 실리카 나노 입자, 폴리머 비드(polymer bead), 형광물질(fluorescein), 발광물질(Luyminescent substances), 색소(dye) 및 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 임신 진단용 면역 장치.

제1항에 있어서, 상기 4)의 흡수 영역은 다공성 지지체의 공동(pore)에 분산되거나 다공성 지지체의 섬유사에 흡착 또는 코팅되어 있는 흡수제를 포함하는 것을 특징으로 하는 임신 진단용 면역 장치.

제1항에 있어서,

1) 대조라인 및 제1검출라인,

2) 대조라인 및 제2검출라인, 또는

3) 대조라인, 제1검출라인 및 제2검출라인에 발색선이 나타났을 때 임신인 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는 임신 진단용 면역 장치.

1) 피검 시료를 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 면역 장치에 적용하여 시료 내 I-hCG 및 βcf hCG가 탐침물질-표지가 접합된 항 I-hCG 항체 및 탐침물질-표지가 접합된 항 βcf hCG 항체와 반응하는 단계;

2) 제1검출라인 및 제2검출라인에 의해 시료 내 I-hCG 및 βcf hCG의 반응을 확인하는 단계로서, I-hCG, βcf hCG는 각각의 검출 라인에서 샌드위치 복합체의 존재에 의해 발생하는 신호에 의해 감지되는 단계; 및

3) 대조라인 및 제1검출라인에 발색선이 나타나거나, 대조라인 및 제2검출라인에 발색선이 나타나거나, 대조라인, 제1검출라인 및 제2검출라인에 발색선이 나타났을 때 임신인 것으로 판정하는 단계를 포함하는 임신 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.

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