CN117074670A - 一种粪便/血清样本中伤寒抗原检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种粪便/血清样本中伤寒抗原检测试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种粪便/血清样本中伤寒抗原检测试剂盒及其制备方法，采用双抗体夹心法检测患者和带菌者粪便和血清样本中的伤寒杆菌及抗原，具有灵敏度高、特异性好、反应时间短、操作简便、结果易于判断等优点，实现快速准确的定性检测粪便和血清样本中的伤寒沙门氏菌，直观地判断出样本中伤寒沙门氏菌含量的高低，适用于伤寒的早期诊断，有较高的临床价值。

Description

一种粪便/血清样本中伤寒抗原检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及医疗检测技术，尤其是一种粪便/血清样本中伤寒抗原检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
伤寒是由伤寒杆菌引起的急性肠道传染病,目前仍是较为常见的传染病之一，由Eberth(1880)在伤寒致命病例的肠系膜淋巴结和脾脏中观察到。伤寒是由沙门氏菌属中伤寒沙氏菌引起的，病菌经口进入肠腔，侵入肠壁淋巴组织进行繁殖再进入肠系膜淋巴结，或直接经咽部的淋巴组织进入淋巴系统，从淋巴系统进入血流是为原发菌血症期。细菌经血流进入肝、脾、胆囊、肾和骨髓，大量繁殖，再次进入血流，引起第2次严重的菌血症。细菌随血液循环扩散到全身各器官和皮肤等处。在胆囊中的细菌随胆汁进入肠腔，再随粪便排出体外。在小肠集合淋巴结和孤立淋巴结的细菌，引起炎性反应出血、坏死，形成溃疡。
临床上用于确诊伤寒患者的方法主要依靠血及骨髓中细菌培养和血清学检查。由于细菌培养时间长检测过程繁琐，难以达到早期诊断的目的；经典的血清学检查为肥达氏凝集试验。由于该反应是检测血清中抗体，一般需发病后5-6d，方可出现阳性结果，亦无早期诊断意义，且阳性率较低，并可出现假阴性和假阳性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简单、性能可靠，实现快速准确的定性检测粪便和血清样本中的伤寒沙门氏菌，直观地判断出样本中伤寒沙门氏菌含量的高低，成本低、适于临床快速检测的粪便和血清样本中的伤寒沙门氏菌检测试剂盒及其制备方法。
为达到上述发明目的，采用的技术方案如下：
本发明提供了一种粪便/血清样本中伤寒抗原检测试剂盒的制备方法，包括将样品垫、伤寒抗体标记物胶体金标记垫、硝酸纤维素膜和吸水纸顺序搭接PVC底板上，并按照规格要求切割，所述样品垫通过以下方法制备：
将玻璃纤维平放在网架上，将样本垫处理液均匀涂布于玻璃纤维上，将涂布好的样品垫放于湿度≤25％环境下，温度37℃干燥12～24小时，备用，所述样本垫处理液由1g/L胆酸，10g/L PVP40，10g/L S9，0.15g/L RBC，0.1％PC300和pH为8.0的0.1mol/L Tris-HCl缓冲液组成。该样本垫处理液的配方可适用于检测两种不同的样本，既能过滤处理粪便样本，又能过滤处理血清样本。
优选地，将样本垫处理液按照50mL/片(20*30cm)处理玻璃纤维。
优选地，所述伤寒抗体标记物胶体金标记垫通过以下方法制备：
a)烧制金水溶液；
b)制备伤寒胶体金溶液。按1ml胶体金溶液为例，取步骤a)烧制的金水50ml，加入10μg的伤寒单克隆抗体，室温反应30分钟后，加入1mL 1％的酪蛋白钠盐进行封闭，室温反应30分钟后，10000rpm离心30分钟后，弃上清液，收集沉淀，并加入保存液。
c)制备伤寒胶体金喷点溶液；使用0.01M的PBS稀释液稀释步骤b)得到的金标标记物，稀释浓度为30％。
d)浸泡：取聚酯膜素膜，按40mL/片(300*80mm)的处理量处理聚酯膜，浸泡12～24小时后置于湿度≤25％环境下，温度37℃干燥12～24小时。
e)将稀释后的伤寒胶体金溶液喷点在处理后的聚酯膜上，温度37℃干燥
12～24小时。
优选地，步骤d)采用预处理液浸泡，预处理液配方为：11.3g/L MOPSO，5g/L酪蛋白钠盐；0.5mL/L的吐温20；2mL/L的PC300。
优选地，所述硝酸纤维素膜通过以下方法制备：用包被缓冲液稀释伤寒检测线包被抗体和质控线包被抗体制备成包被工作液，检测线包被液浓度为0.5mg/mL，质控线包被液浓度为1.0mg/mL，采用点膜仪将制备的检测线包被液和质控线包被液分别包被在硝酸纤维素膜上，形成检测线T和质控线C，得到含有检测线T和质控线C的硝酸纤维素膜。
更优选地，所述质控线C至硝酸纤维素膜的底端距离为9mm，误差≤±0.5mm；所述检测线T至硝酸纤维素膜的底端距离为5mm，误差≤±0.5mm。
优选地，所述样品垫、伤寒抗体标记物胶体金标记垫、硝酸纤维素膜和吸水纸的条宽均不小于3.0mm。
本发明还提供了一种粪便/血清样本中伤寒抗原检测试剂盒，由上述制备方法制得。
优选地，如样本中含有伤寒抗原，在检测区T位置上会出现一条紫红色条带；若样本中不含伤寒抗原，则检测区不会出现紫红色条带；无论样本中是否含有伤寒抗原，质控区C都会出现一条紫红色条带，用来判定层析过程是否正常。
本发明的有益效果在于：
本发明制备了一种伤寒抗原检测试剂盒，采用双抗体夹心法检测患者和带菌者粪便和血清中的伤寒杆菌及抗原，具有灵敏度高、特异性好、反应时间短、操作简便、结果易于判断等优点，适用于伤寒的早期诊断，有较高的临床价值。
本发明可检测粪便样本用于自测，又可以检测血清样本，检测阴阳性样本时，产品和金标准的阴阳性符合率较高。检测100例的粪便样本，样本总符合率为95％，检测血清样本的总符合率为98.6％。
附图说明
图1为本发明中试剂盒的俯视结构示意图。
图2为金标色卡色系强度图示。
图3为本发明试剂盒的结果判读图示。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例
本发明制备的一种粪便/血清样本中伤寒抗原检测试剂盒，如图1所示，包括PVC底板1，PVC底板1上由左到右依次搭接设置有样品垫2、胶体金标记垫3、硝酸纤维素膜4和吸水纸7；硝酸纤维素膜4内含有从左到右依次分布设置的检测线T5和质控线C6，对应的检测线T5和质控线C6处分别在硝酸纤维素膜4上形成检测区T和质控区C；样品垫2右侧端部搭接于胶体金标记垫3的左侧端部上侧，胶体金标记垫3右侧端部搭接于硝酸纤维素膜4的左侧端部上侧，吸水纸7左侧端部搭接于硝酸纤维素膜4的右侧端部上侧；即胶体金标记垫3的左侧端部位于样品垫2的内侧，硝酸纤维素膜4的左侧端部位于胶体金标记垫3的内侧，硝酸纤维素膜4的右侧端部位于吸水纸7的内侧。
其中，胶体金标记垫3的材质为6613聚酯膜，样品垫2的材质为8964玻璃纤维素膜，样品垫2、胶体金标记垫3、硝酸纤维素膜4和吸水纸7的条宽均不小于3.0mm。
该伤寒抗原检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
A、制备样品垫2：
将8964玻璃纤维平放在网架上，将配好的样本垫处理液按照50mL/片(20*30cm)处理8964玻璃纤维，将处理液均匀涂布于8964玻璃纤维上，将涂布好的样品垫放于湿度≤25％环境下，温度37℃干燥12～24小时，备用；
样品垫处理液由1.0g/L胆酸，10g/L PVP40，10g/L S9，0.15g/L RBC，0.1％PC300和pH为8.0的0.1mol/L Tris-HCl缓冲液组成；“g/L”是指各成分在每L样品垫处理液中的质量；“％”是为体积百分比。配制方法如下：
在1000mL 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液中加入1.0g胆酸，10g PVP40，10g S9，0.15gRBC(人血红细胞抗体)，1mL PC300，磁力搅拌器中充分混匀后，将溶液的pH调至8.0。
B、制备胶体金标记垫3：
制备胶体金溶液和抗体标记，然后喷涂至6613聚酯膜上，干燥，得到胶体金标记垫；具体步骤包括：
a、烧制万四金水溶液；
b、制备伤寒胶体金溶液。按1ml胶体金溶液为例，取a烧制的金水50ml，加入10μg的伤寒单克隆抗体(市售产品即可)，室温反应30分钟后，加入1mL1％的酪蛋白钠盐进行封闭，室温反应30分钟后，10000rpm离心30分钟后，弃上清液，收集金标溶液，并加入保存液。
c、制备伤寒胶体金喷点溶液；使用0.01M的PBS稀释液稀释金标标记物，稀释浓度为30％。
d、标记垫预处理-浸泡：取6613聚酯膜素膜，按40mL/片(300*80mm)的处理量预处理6613聚酯膜，预处理液浸泡12～24小时后置于湿度≤25％环境下，温度37℃干燥12～24小时。预处理液配方：11.3g/L MOPSO，5g/L酪蛋白钠盐；0.5mL/L的吐温20；2mL/L的PC300。
e、将稀释后的伤寒胶体金溶液喷点在处理后的6613聚酯膜上；温度37℃干燥12～24小时。胶体金标记垫干燥后，用铝箔袋封存备用。
其中，胶体金标记垫制备完成后，在其表面上标记具有伤寒标记抗体和金标标记物的垫体。
C、制备硝酸纤维素膜4：
用包被缓冲液稀释检测线包被抗体和质控线包被抗体制备成包被工作液，即检测线包被液(对应检测线T6)和质控线包被液(对应质控线C5)，采用点膜仪将制备的检测线包被液和质控线包被液分别包被在硝酸纤维素膜上，形成检测线T6和质控线C5，得到含有检测线T6和质控线C5的硝酸纤维素膜4；
具体包括以下步骤：
e、按照配方要求配制伤寒检测线包被抗体和质控线包被物的溶液，对应分别形成检测线包被液、质控线包被液，检测线和质控线的喷量为0.8～1.0μL/cm，最终检测线包被液浓度为0.5mg/mL；质控线包被浓度为1.0mg/mL。
f、取已粘贴硝酸纤维素膜(规格宽度为20mm)的PVC底板，按照距离间隔一次性划出检测线T和质控线C；
g、质控线C至硝酸纤维素膜的底端距离为9mm，误差≤±0.5mm；检测线T至硝酸纤维素膜的底端距离为5mm，误差≤±0.5mm；
h、设定干燥温湿度，湿度≤25％、温度≤30℃的环境下干燥，干燥时间为12～24小时；
i、将干燥的硝酸纤维素膜放于自封袋密封，备用。
D、贴板及切割：
将样品垫2、胶体金标记垫3、硝酸纤维素膜4和吸水纸7顺序搭接PVC底板1上，并按照规格要求切割成条宽不小于3.0mm。
具体包括以下步骤：
j、检查生产车间湿度，确保湿度≤25％才能开始工作；
k、撕开PVC底板1表面的保护纸，将胶体金标记垫黏贴在PVC底板1上，让胶体金标记垫3的上边缘与硝酸纤维素膜4的下边缘重叠1～2mm，将样品垫2粘贴在胶体金标记垫3的下方，让样品垫2的上边缘与胶体金标记垫3的下边缘重叠1～2mm；
l、撕开PVC底板1表面的离层纸，将吸水纸6直线黏贴到PVC底板1上，让吸水纸7与硝酸纤维素膜4的上边缘重叠2mm左右；
m、贴隐形胶带，让隐形胶带与硝酸纤维素膜垫的下边缘重叠1～1.5mm左右；
n、操作自动切割机，按要求的宽度切割。
测试时，样本滴入加样处，如样本中含有伤寒抗原，则伤寒抗原可与伤寒抗体金标标记结合形成免疫复合物，在层析作用下复合物及样本由下向上移动。当复合物经过检测区T时被固定在膜上的伤寒单克隆抗体检测线捕获，在检测区T位置上会出现一条紫红色条带；若样本中不含伤寒抗原，则检测区不会出现紫红色条带；无论样本中是否含有伤寒抗原，质控区C都会出现一条紫红色条带，用来判定层析过程是否正常。
当C线区域出现红色线条，T线区域出现红色线条，结果判读为阳性，且在一定范围内颜色强度和样本浓度呈正比，金标色卡色系强度如图2所示；当C线区域出现红色线条，T线区域无红色线条出现，结果判读为阴性；当C线区域无红色线条出现，结果判读为无效，需重新复测样本。结果判读图示参考图3。
应用例
粪便样本的处理为取10～50mg的粪便样本，加入2mL的样本稀释液混匀；血清样本的处理为采取静脉血，离心或放置后沉降后取血清样本。粪便样本和血清样本各取80μL至样品垫上，10分钟后结果判读，对上述100例粪便样本和血清样本同时采用竞品试剂进行检测，对比结果如表1和表2所示。阴阳性总符合率分别为95％、98.6％。
表1：100例粪便样本的检测结果
表2：100例血清样本的检测结果
显然，本发明的上述实施例仅仅是为更清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方法予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (10)

1.一种粪便/血清样本中伤寒抗原检测试剂盒的制备方法，包括将样品垫、伤寒抗体标记物胶体金标记垫、硝酸纤维素膜和吸水纸顺序搭接PVC底板上，并按照规格要求切割，所述样品垫通过以下方法制备：
将玻璃纤维平放在网架上，将样本垫处理液均匀涂布于玻璃纤维上，将涂布好的样品垫放于湿度≤25％环境下，温度37℃干燥12～24小时，备用，所述样本垫处理液由1g/L胆酸，10g/L PVP40，10g/L S9，0.15g/L RBC，0.1％PC300和pH为8.0的0.1mol/L Tris-HCl缓冲液组成。
2.根据权利要求1所述的一种粪便/血清样本中伤寒抗原检测试剂盒的制备方法，其特征在于，将样本垫处理液按照50mL/片(20*30cm)处理玻璃纤维。
3.根据权利要求1所述的一种粪便/血清样本中伤寒抗原检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述伤寒抗体标记物胶体金标记垫通过以下方法制备：
a)烧制金水溶液；
b)制备伤寒胶体金溶液，按1ml胶体金溶液为例，取步骤a)烧制的金水50ml，加入10μg的伤寒单克隆抗体，室温反应30分钟后，加入1mL 1％的酪蛋白钠盐进行封闭，室温反应30分钟后，10000rpm离心30分钟后，弃上清液，收集金标溶液，并加入保存液；
c)制备伤寒胶体金喷点溶液：使用0.01M的PBS稀释液稀释金标标记物，稀释浓度为30％；
d)浸泡：取聚酯膜素膜，按40mL/片(300*80mm)的处理量处理聚酯膜，浸泡12～24小时后置于湿度≤25％环境下，温度37℃干燥12～24小时；
e)将稀释后的伤寒胶体金溶液喷点在处理后的聚酯膜上；温度37℃干燥12～24小时。
4.根据权利要求3所述的一种粪便/血清样本中伤寒抗原检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤d)采用预处理液浸泡，预处理液配方为：11.3g/L MOPSO，5g/L酪蛋白钠盐；0.5mL/L的吐温20；2mL/L的PC300。
5.根据权利要求1所述的一种粪便/血清样本中伤寒抗原检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述硝酸纤维素膜通过以下方法制备：用包被缓冲液稀释伤寒检测线包被抗体和质控线包被抗体制备成包被工作液，检测线包被液浓度为0.5mg/mL，质控线包被液浓度为1.0mg/mL，采用点膜仪将制备的检测线包被液和质控线包被液分别包被在硝酸纤维素膜上，形成检测线T和质控线C，得到含有检测线T和质控线C的硝酸纤维素膜。
6.根据权利要求5所述的一种粪便/血清样本中伤寒抗原检测试剂盒的制备方法，其特征在于，检测线和质控线的喷量为0.8～1.0μL/cm。
7.根据权利要求5所述的一种粪便/血清样本中伤寒抗原检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述质控线C至硝酸纤维素膜的底端距离为9mm，误差≤±0.5mm；
所述检测线T至硝酸纤维素膜的底端距离为5mm，误差≤±0.5mm。
8.根据权利要求1所述的一种粪便/血清样本中伤寒抗原检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述样品垫、伤寒抗体标记物胶体金标记垫、硝酸纤维素膜和吸水纸的条宽均不小于3.0mm。
9.一种粪便/血清样本中伤寒抗原检测试剂盒，由权利要求1～8任意一项所述的一种粪便/血清样本中伤寒抗原检测试剂盒的制备方法制得。
10.根据权利要求9所述的一种粪便/血清样本中伤寒抗原检测试剂盒，其特征在于，如样本中含有伤寒抗原，在检测区T位置上会出现一条紫红色条带；若样本中不含伤寒抗原，则检测区不会出现紫红色条带；无论样本中是否含有伤寒抗原，质控区C都会出现一条紫红色条带，用来判定层析过程是否正常。
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