CN113109560A - 一种用于氟啶虫酰胺农药速测的试纸条及其制备方法及检测方法 - Google Patents
一种用于氟啶虫酰胺农药速测的试纸条及其制备方法及检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种用于氟啶虫酰胺农药速测的试纸条及其制备方法及检测方法，该试纸条包括一PVC衬板，PVC衬板上沿长度方向依次设置有吸水垫、硝酸纤维素膜、金标抗体结合垫和样品垫，金标抗体结合垫上包被有胶体金标记的农药特异性兔多抗，硝酸纤维素膜上包被有农药小分子完全抗原的检测线和羊抗兔IgG二抗质控线。速测法：将样品切碎，称取5g待测样品于5mL样品稀释液中，充分震荡混匀，提取完成后静置取上清液滴加2～3滴到样品垫进行层析反应，5～10分钟后根据检测线和质控线的显色情况直接判断样品中氟啶虫酰胺及其代谢物农药的阴阳性结果。本发明具有操作简便、灵敏度高、适用于现场速测、结果简单可视等优点，同时制备工艺简单，成本低，实用性能好。
Description
技术领域
本发明属于竞争性金标免疫层析法技术领域，涉及一种用于氟啶虫酰胺农药速测的试纸条及其制备方法及检测方法。
背景技术
氟啶虫酰胺(Flonicamid)，又名N-氰甲基-4-(三氟甲基)烟酰胺，是一种新型的有选择性的低毒吡啶酰胺类杀虫剂，对蚜虫等各种刺吸式口器害虫有效，该药剂通过阻碍害虫吮吸作用而致效，害虫摄入药剂后很快停止吮吸，最后饥饿而死。因为氟啶虫酰胺具有最小抵抗力交叉和哺乳动物急性毒性较低的特点，目前已被许多国家广泛使用在农作物上，如水稻、水果和蔬菜，用于控制蚜虫和其他刺吸式口器昆虫。氟啶虫酰胺作为一种较为新颖的杀虫剂具有广阔的未来市场，目前其单剂或复配制剂在我国的登记数量已达近三十种农作物。
然而，氟啶虫酰胺可携带到农产品中，并增加人类接触。为了保护消费者的健康，采用灵敏可靠的分析方法对氟啶虫酰胺的残留进行监测具有重要意义。近年来，许多氟啶虫酰胺残留的测定方法在不同类型的样本已被报道，这些方法包括气相色谱法(GC)、高效液相色谱(HPLC)和高效液相色谱质谱(HPLC-MS)。虽然这些方法具有很高的精度和灵敏度，但它们需要长时间的样品前处理程序和复杂的仪器分析程序，同时这些仪器也不适于大规模和现场分析。因此，要求采用更简单、更经济的方法来测定氟啶虫酰胺的残留量。而免疫分析正好满足这些要求，是筛选分析的可靠分析工具。目前已有针对氟啶虫酰胺的酶联免疫吸附检测方法，确实有潜在的市场应用前景，但检测需要多步反应，仍不能真正实现现场快速筛查。相对来讲，胶体金免疫层析检测法对仪器设备要求不高，对样品处理和检测环境要求低，一般无需对样品进行复杂的预处理，简单、快速、便携、经济，灵敏度高、特异性强，易于在基层普及和推广，可满足快速分析检测的需要，尤其适宜现场筛选和大量样品的快速分析。
因此，为了满足氟啶虫酰胺的快速检测，需要研制出一种对氟啶虫酰胺灵敏度高、特异性好的胶体金免疫层析试纸条。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种操作简便、灵敏度高的氟啶虫酰胺农药速测的试纸条，用于对氟啶虫酰胺农药的现场速测，具有结果简单可视的优点。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种氟啶虫酰胺农药速测的试纸条的制备方法。
本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种氟啶虫酰胺农药的速测方法，采用上述试纸条进行测试，具有操作简便、灵敏度高、结果简单可视的特点。
本发明解决上述第一个技术问题所采用的技术方案为：一种氟啶虫酰胺农药速测的试纸条，该试纸条是基于间接竞争免疫层析法金标速测试纸条，包括一条形的PVC衬板，PVC衬板上沿长度方向从左至右依次设置有吸水垫、硝酸纤维素膜、金标抗体结合垫和样品垫，其特征在于：其中金标抗体结合垫上包被有胶体金标记的农药特异性兔多抗，硝酸纤维素膜上包被有农药小分子完全抗原的检测线和羊抗兔IgG二抗质控线。
作为优选，所述硝酸纤维素膜粘贴在PVC衬板的中间位置，金标抗体结合垫的左半部分粘贴在硝酸纤维素膜的右端上方，样品垫粘贴在金标抗体结合垫的右半部分上方，样品垫的右端与PVC衬板的右端齐平，吸水垫的左端与PVC衬板的左端齐平，吸水垫的右端粘贴在硝酸纤维素膜的上方，且盖住2.5～3.5mm。
进一步，所述胶体金标记的农药特异性兔多抗是由30±1nm的纳米金颗粒与农药特异性兔多抗相结合的复合物，农药特异性兔多抗与胶体金的结合浓度为60±1mg/L，即每1L的胶体金溶液中配用60±1mg的农药特异性兔多抗，胶体金溶液中胶体金的质量浓度为0.01±0.001％。
进一步，所述检测线包被的农药小分子完全抗原是指分别将农药半抗原偶联到鸡卵清蛋白(OVA)上的人工抗原，浓度为500±5mg/L；农药半抗原与OVA的偶联比为20±1：1；羊抗兔1gG二抗质控线浓度为800±5mg/L，检测线和质控线的包被量均为0.6±0.1μL/mm2。
进一步，所述样品垫采用奥斯龙8964玻璃纤维纸，样品垫需作封闭液处理，封闭模式为样品垫完全吸收封闭液，再作干燥处理。
本发明解决上述第二个技术问题所采用的技术方案为：一种上述氟啶虫酰胺农药速测的试纸条的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
一、抗原、包被原与多克隆抗体的制备
1)完全抗原的制备：称取4.5±0.1mg氟啶虫酰胺代谢物(TFNA)半抗原，用200±5uL无水N，N-二甲基甲酰胺溶解，然后加入6.7±0.1mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐，4.0±0.1mg N-羟基琥珀酰亚胺，混匀，室温持续搅拌反应6±1h(称为TFNA半抗原活化液)；将牛血清白蛋白10±1mg，用3±0.1ml硼酸缓冲溶液溶解(称为蛋白A液)，在室温条件，将TFNA半抗原活化液缓慢加入到蛋白A液中，室温搅拌反应过夜，透析，即得完全抗原；
2)包被原的制备：称取7.8±0.1mg氟啶虫酰胺代谢物(TFNA)半抗原，用300±5uL无水N，N-二甲基甲酰胺溶解，随后加入11.5±0.1mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐，6.9±0.1mgN-羟基琥珀酰亚胺，混匀，室温持续搅拌反应6±1h(称为TFNA半抗原活化液)；称取10±1mg鸡卵白蛋白OVA，溶解于2±0.1ml硼酸缓冲溶液中(称为B液)，在室温条件下，将TFNA半抗原活化液逐滴加入到B液中，室温搅拌反应过夜，透析，即得包被原；
3)多克隆抗体的制备：实验动物选择雄性新西兰大白兔，首免前7天，对试验动物的耳缘静脉取血，分离阴性血清；首次免疫将免疫原(2mg/mL)与等体积的弗氏完全佐剂进行混合，充分乳化，形成油包水的状态，背部皮下6点，后腿肌肉2点免疫；间隔两周，二次免疫，免疫原(1mg/mL)与等体积的弗氏不完全佐剂制备免疫原，背部皮下6点，后腿肌肉2点免疫；从第三次免疫开始直到第七次，免疫原(1mg/mL)与等体积的弗氏不完全佐剂制备免疫原，背部皮下6点，后腿肌肉2点免疫，以两周为间隔期，进行耳缘采血，分离血清，测效价；最后一次免疫，将佐剂用生理盐水替代，耳缘静脉注射，一周后，动脉取血，分离血清，经亲和层析纯化多克隆抗体；
二、试纸条制备
A、胶体金的制备
用新制去离子水配制一定体积的0.01±0.001％(质量浓度)氯金酸溶液，采用冷凝管回流、油浴锅等加热方式将氯金酸溶液加热至沸腾；在磁力搅拌的同时，迅速加入一定体积的1±0.1％(质量浓度)柠檬酸钠水溶液，氯金酸溶液与柠檬酸钠水溶液的体积用量比为100:(0.75～2)，观察溶液颜色变化；当溶液的颜色完全时，继续回流5-7min后停止加热，制备得到胶体金溶液；该胶体金溶液内金胶体的颗粒平均直径为20～60nm金胶体，冷却后无菌密封4℃下保存；
B、金标抗体的制备
取10±0.1mL质量浓度为0.01％的胶体金溶液，逐滴加入1±0.1mL60mg/L的氟啶虫酰胺及其代谢物特异性兔多抗(一抗)溶液，边加边混匀，混合均匀后静置1±0.1h；再加入2.5±0.1ml含5％BSA(牛血清蛋白)和0.1％PEG(聚乙二醇)的20mM硼酸缓冲溶液，混合均匀后静置1±0.1h；4℃条件下10000±100r/min离心30±1min，弃上清，红色沉淀再用10±0.1mL含1％BSA和0.02％PEG的20±1mM硼酸缓冲溶液复溶(洗涤作用)，然后4℃条件下10000±100r/min离心30±1min，弃上清，再重复上述复溶离心弃上清一次；最后用1％BSA和5％蔗糖的20mM硼酸缓冲溶液溶解红色沉淀并定容至1ml，即获得纯化的氟啶虫酰胺及其代谢物金标一抗，放置于4℃冰箱中备用；
C、样品垫处理
配制封闭液，称取60±1mg牛血清白蛋白(BSA)、60±1mg聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、1000±10mg蔗糖，加入20±1mL0.01M含0.05％吐温的磷酸缓冲溶液(PBST)中；
将上述试剂和溶液充分涡旋混匀，直至完全溶解，即完成封闭液配制；将样品垫浸入封闭液中，待完全吸附封闭液(即封闭液的余量不再改变，一般为20-30s)后取出，并在37±1℃烘箱中干燥3±0.5小时；放入封口袋，并保存于玻璃干燥器中；
D、金标抗体结合垫制备
将步骤B中所得农药特异性金标抗体均匀包被在步骤C中已干燥的样品垫上，包被量为0.6±0.01μL/mm2，37±1℃烘箱中干燥30±1min，得金标抗体结合垫；放入封口袋中并保存于玻璃干燥器中；
E、检测线、质控线的包被
首先配制保护剂，保护剂为含1±0.1％蔗糖的0.01M PBS溶液；再以配制好的保护剂作为稀释液，分别配制500mg/L的氟啶虫酰胺及其代谢物半抗原-OVA偶联物(检测线)和800mg/L的羊抗兔IgG(质控线)；
采用自动划线仪划线，将检测线和控制线包被在硝酸纤维素膜上，检测线和控制线的包被量均为0.6±0.01μL/mm2；划线完成后将硝酸纤维素膜放于37±1℃烘箱中干燥10±1min，得到包被氟啶虫酰胺及其代谢物半抗原-OVA的检测线和包被羊抗兔IgG二抗质控线硝酸纤维素膜；
F、试纸条的组装
先在PVC衬板的中间段贴上步骤E中制备好的包被有检测线和控制线的硝酸纤维素膜，然后在该硝酸纤维素膜上粘贴金标抗体结合垫，粘贴位置使约一半的金标抗体结合垫位于硝酸纤维素膜的上方；然后，将封闭液处理过的样品垫粘贴在金标抗体结合垫的上方，粘贴位置盖住约一半的金标抗体结合垫；最后粘贴吸水垫，粘贴位置为盖住硝酸纤维素膜约3±0.5mm；衬板组装完成后水平放入自动切条机中，将其切割成3-4mm宽的试纸条。
本发明解决上述第三个技术问题所采用的技术方案为：一种氟啶虫酰胺农药的速测方法，其特征在于：采用上述制备的试纸条进行测试，具体过程如下：
1)将待测样品匀浆或切碎，称取样品5.0±0.1g，放入5±0.1mL样品提取液中，并加入一份配套研磨珠，震荡提取1±0.1min，静置3±0.1min后取上清液检测；
2)取上清液滴加2～3滴到试纸条样品垫的点样区中进行层析反应，5～10分钟后，根据检测线和质控线的显色情况判断样品中氟啶虫酰胺及其代谢物农药的阴阳性；
3)质控线显红色表示试纸条有效，未显色则试纸条失效；
4)若质控线显红色且检测线显红色或浅红色则判断为阴性，表示样品中未检测到氟啶虫酰胺，或样品中氟啶虫酰胺的浓度低于最低检出限；
若质控线显红色且检测线未显色则判断为阳性，表示样品中氟啶虫酰胺农药的残留浓度高于最低检出限。
最后，所述步骤1)的样品提取液是含30％甲醇的0.01M、PH7.4的磷酸盐缓冲溶液。
与现有技术相比，本发明的优点在于：采用胶体金标记农药特异性兔多抗作为免疫金标探针，可以监测样品中的氟啶虫酰胺及其代谢物农药残留，是一种快速简便的农药残留筛查手段；利用了农药特异性抗体与抗原反应原理，实现了氟啶虫酰胺及其代谢物农药的快速检测。本发明的试纸条具有操作简便、灵敏度高、适用于现场速测、结果简单可视等优点，同时制备工艺简单，成本低，可应用于现场筛查农产品中氟啶虫酰胺及其代谢物残留量及超标的快速检测与诊断，同时还能够实现农产品(如苹果)现场采摘时的快速筛查，具有良好的实用性，对于加强农产品生产的质量安全监督管理具有良好的应用前景。
附图说明
图1是本发明提供的氟啶虫酰胺及其代谢物结构示意图；
图2是本发明提供的试纸条的俯视图；
图3是检测结果判定方法；图3中，从左至右分别为；
C线和T线均显示红色→阴性；
C线显示红色，T线显示浅红色→阴性；
C线显示红色，T线不显色→阳性；
C线不显色，T线显示红色→失效；
C线和T线均不显色→失效；
图4为苹果中氟啶虫酰胺及其代谢物检测精密度结果；
图5是苹果中氟啶虫酰胺及其代谢物实际样品检测结果；
图6为本发明提供的试纸条的结构示意图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
如图2、6所示，一种氟啶虫酰胺农药速测的试纸条，该试纸条是基于间接竞争免疫层析法金标速测试纸条，包括一条形的PVC衬板5，PVC衬板5上沿长度方向从左至右依次设置有吸水垫1、硝酸纤维素膜2、金标抗体结合垫3和样品垫4，其中金标抗体结合垫3上包被有胶体金标记的农药特异性兔多抗，硝酸纤维素膜2上包被有农药小分子完全抗原的检测线22和羊抗兔IgG二抗质控线21。硝酸纤维素膜2粘贴在PVC衬板5的中间位置，金标抗体结合垫3的左半部分粘贴在硝酸纤维素膜2的右端上方，样品垫4粘贴在金标抗体结合垫3的右半部分上方，样品垫4的右端与PVC衬板的右端齐平，吸水垫1的左端与PVC衬板的左端齐平，吸水垫1的右端粘贴在硝酸纤维素膜2的上方，且盖住2.5～3.5mm；胶体金标记的农药特异性兔多抗是由30±1nm的纳米金颗粒与农药特异性兔多抗相结合的复合物，农药特异性兔多抗与胶体金的结合浓度为60±1mg/L，即每1L的胶体金溶液中配用60±1mg的农药特异性兔多抗，胶体金溶液中胶体金的质量浓度为0.01±0.001％。检测线22包被的农药小分子完全抗原是指分别将农药半抗原偶联到鸡卵清蛋白(OVA)上的人工抗原，浓度为500±5mg/L；农药半抗原与OVA的偶联比为20±1：1；羊抗兔1gG二抗质控线21浓度为800±5mg/L，检测线22和质控线21的包被量均为0.6±0.1μL/mm2；样品垫4采用奥斯龙8964玻璃纤维纸，样品垫4需作封闭液处理，封闭模式为样品垫4完全吸收封闭液，再作干燥处理。
下面通过具体实施例对本发明的试纸条的制备过程及应用进行具体说明：
实施例1：抗原、包被原与多克隆抗体的制备
1.完全抗原的制备：称取4.5mg氟啶虫酰胺代谢物(TFNA)半抗原，用200uL无水N，N-二甲基甲酰胺溶解，然后加入6.7mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐，4.0mg N-羟基琥珀酰亚胺，混匀，室温持续搅拌反应6h(称为TFNA半抗原活化液)。将牛血清白蛋白10mg，用3ml硼酸缓冲溶液溶解(称为蛋白A液)，在室温条件，将TFNA半抗原活化液缓慢加入到蛋白A液中，室温搅拌反应过夜，透析，即得完全抗原。
2.包被原的制备：称取7.8mg氟啶虫酰胺代谢物(TFNA)半抗原，用300uL无水N，N-二甲基甲酰胺溶解，随后加入11.5mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐，6.9mg N-羟基琥珀酰亚胺，混匀，室温持续搅拌反应6h(称为TFNA半抗原活化液)。称取10mg鸡卵白蛋白OVA，溶解于2ml硼酸缓冲溶液中(称为B液)，在室温条件下，将TFNA半抗原活化液逐滴加入到B液中，室温搅拌反应过夜，透析，即得包被原。
3.多克隆抗体的制备：实验动物选择雄性新西兰大白兔，体重约2.5kg。首免前7天，耳缘静脉取血，分离阴性血清。首次免疫将免疫原(2mg/mL)与等体积的弗氏完全佐剂进行混合，充分乳化，形成油包水的状态，背部皮下6点，后腿肌肉2点免疫；间隔两周，二次免疫，免疫原(1mg/mL)与等体积的弗氏不完全佐剂制备免疫原，背部皮下6点，后腿肌肉2点免疫；从第三次免疫开始直到第七次，免疫原(1mg/mL)与等体积的弗氏不完全佐剂制备免疫原，背部皮下6点，后腿肌肉2点免疫，以两周为间隔期，进行耳缘采血，分离血清，测效价；最后一次免疫，将佐剂用生理盐水替代，耳缘静脉注射，一周后，动脉取血，分离血清。经亲和层析纯化多克隆抗体。
实施例2：试纸条制备
1.胶体金的制备
用新制去离子水配制一定体积的0.01％(质量浓度)氯金酸溶液，采用冷凝管回流、油浴锅等加热方式将氯金酸溶液加热至沸腾；在磁力搅拌的同时，迅速加入一定体积的1％(质量浓度)柠檬酸钠水溶液(去离子水或蒸馏水配制)，氯金酸溶液与柠檬酸钠水溶液的体积用量比为100:(0.75～2)，观察溶液颜色变化。当溶液的颜色完全时，继续回流5-7min后停止加热，制备得到胶体金溶液。该胶体金溶液内金胶体的颗粒平均直径为20～60nm金胶体，冷却后无菌密封4℃下保存。
备注说明：上述所得金胶体的颗粒平均直径与柠檬酸钠用量密切相关，柠檬酸钠用量越多，颗粒越细。
2.金标抗体的制备
取10mL质量浓度为0.01％的胶体金溶液，逐滴加入1mL 60mg/L的氟啶虫酰胺及其代谢物特异性兔多抗(一抗)溶液，边加边混匀，混合均匀后静置1h。再加入2.5ml含5％BSA(牛血清蛋白)和0.1％PEG(聚乙二醇)的20mM硼酸缓冲溶液，混合均匀后静置1h。4℃条件下10000r/min离心30min，弃上清，红色沉淀再用10mL含1％BSA和0.02％PEG的20mM硼酸缓冲溶液复溶(洗涤作用)，然后4℃条件下10000r/min离心30min，弃上清，再重复上述复溶离心弃上清一次。最后用1％BSA和5％蔗糖的20mM硼酸缓冲溶液溶解红色沉淀并定容至1ml，即获得纯化的氟啶虫酰胺及其代谢物金标一抗，放置于4℃冰箱中备用。
备注说明：上述％均为重量％。例如，上述含5％BSA(牛血清蛋白)和0.1％PEG(聚乙二醇)的20mM硼酸缓冲溶液的制备方法为：在100ml的20mM硼酸缓冲溶液(pH 8.5)中加入5g的BSA(牛血清蛋白)和0.1g的PEG(聚乙二醇)。
3.样品垫4处理
配制封闭液，称取60mg牛血清白蛋白(BSA)、60mg聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、1000mg蔗糖，加入20mL0.01M含0.05％吐温的磷酸缓冲溶液(PBST)中。
备注说明：上述0.01M含0.05％吐温的磷酸缓冲溶液(PBST)是指在100mL0.01M磷酸缓冲溶液(PBS，PH7.4)中加入0.05mL吐温20。
将上述试剂和溶液充分涡旋混匀，直至完全溶解，即完成封闭液配制。将样品垫浸入封闭液中，待完全吸附封闭液(即封闭液的余量不再改变，一般为20-30s)后取出，并在37℃烘箱中干燥3小时；放入封口袋，并保存于玻璃干燥器中。
备注说明：上述样品垫4后续也作为金标抗体结合垫3的原始材料。
4.金标抗体结合垫3制备
将步骤2中所得农药特异性金标抗体均匀包被在步骤3中已干燥的样品垫4上，包被量为0.6μL/mm2，37℃烘箱中干燥30min，得金标抗体结合垫3；放入封口袋中并保存于玻璃干燥器中。
5.检测线22、质控线21的包被
首先配制保护剂，保护剂为含1％蔗糖的0.01M PBS溶液。再以配制好的保护剂作为稀释液，分别配制500mg/L的氟啶虫酰胺及其代谢物半抗原-OVA偶联物(检测线)和800mg/L的羊抗兔IgG(质控线)。
备注说明：上述氟啶虫酰胺及其代谢物半抗原-OVA偶联物偶联方法为活性酯法，将农药半抗原偶联到鸡卵清蛋白(OVA)上，半抗原与OVA的偶联比例为20：1。
采用自动划线仪划线，将检测线22和质控线21包被在硝酸纤维素膜2上(划线位置见图2)，检测线22和质控线21的包被量均为0.6μL/mm2。划线完成后将硝酸纤维素膜放于37℃烘箱中干燥10min，得到包被氟啶虫酰胺及其代谢物半抗原-OVA的检测线22和包被羊抗兔IgG二抗质控线21硝酸纤维素膜2。
6.试纸条的组装
先在PVC衬板的中间段贴上步骤5中制备好的包被有检测线22和质控线21的硝酸纤维素膜2，然后在该硝酸纤维素膜2上粘贴金标抗体结合垫3(纵向长度为2mm)，粘贴位置使约一半的金标抗体结合垫3位于硝酸纤维素膜2的上方。然后，将封闭液处理过的样品垫4粘贴在金标抗体结合垫3的上方，粘贴位置盖住约一半的金标抗体结合垫3。最后粘贴吸水垫1，粘贴位置为盖住硝酸纤维素膜2约3mm。衬板组装完成后水平放入自动切条机中，将其切割成3-4mm宽的试纸条。
实施例3：试纸条在苹果上的应用
1.苹果空白样品中氟啶虫酰胺及其代谢物标准溶液添加试验
称取5份苹果样品各5g，分别加入100μL甲醇以及最低检测限的氟啶虫酰胺及其代谢物标准品，静置10min后，空白样品与加标样品分别加入5mL含20％甲醇的磷酸盐缓冲液，充分振荡混匀，得到的上清液作为样品基质，使用同一批次的残留速测卡进行检测。结果表明，添加最低检测限的4种农药单个标准品后，试纸条为阳性结果。
表1苹果氟啶虫酰胺及其代谢物速测试纸条标准工作液添加检测结果
| 农药种类 | 无添加 | 氟啶虫酰胺 | TFNA | TFNG | TFNA-AM |
| 显色情况 | - | + | + | + | + |
注：-表示质控线21与检测线22显色，判断为阴性；+表示质控线21显色，检测线22不显色，判断为阳性。结果判定方法见图3。
2.苹果样品中氟啶虫酰胺及其代谢物试纸条速测法精密度试验
称取4份苹果样品各5g，一份加入100μL甲醇，一份加入氟啶虫酰胺及其代谢物农混合药标准品，静置10min后，空白样品与加标样品分别加入5mL含20％甲醇的磷酸盐缓冲液，充分振荡混匀，得到的上清液作为样品基质，使用同一批次的残留速测卡进行检测。结果表明，添加最低检测限的氟啶虫酰胺及其代谢物农药混合标准品后，3个试纸条均为阳性结果，具体结果见图4。
表3苹果样品中氟啶虫酰胺及其代谢物试纸条速测法精密度试验结果
注：-表示控制线与检测线显色，判断为阴性；+表示控制线显色，检测线不显色，判断为阳性。结果判定方法见图3。
3.苹果样品检测及结果判定
苹果样品用同一批次的残留速测试纸条进行检测，检测方法同上。检测结果见图5，结果显示：仪器检测结果超出试纸条最低检测限的苹果样品试纸条显色为阳性，仪器检测结果未超出试纸条最低检测限的苹果样品试纸条显色为阴性或弱阳性，说明此试纸条测定结果和仪器检测结果相符合，从而验证了试纸条检测结果的准确性和实用性。
Claims (8)
1.一种氟啶虫酰胺农药速测的试纸条，该试纸条是基于间接竞争免疫层析法金标速测试纸条，包括条形的PVC衬板，PVC衬板上沿长度方向从左至右依次设置有吸水垫、硝酸纤维素膜、金标抗体结合垫和样品垫，其特征在于：其中金标抗体结合垫上包被有胶体金标记的农药特异性兔多抗，硝酸纤维素膜上包被有农药小分子完全抗原的检测线和羊抗兔IgG二抗质控线。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：所述硝酸纤维素膜粘贴在PVC衬板的中间位置，金标抗体结合垫的左半部分粘贴在硝酸纤维素膜的右端上方，样品垫粘贴在金标抗体结合垫的右半部分上方，样品垫的右端与PVC衬板的右端齐平，吸水垫的左端与PVC衬板的左端齐平，吸水垫的右端粘贴在硝酸纤维素膜的上方，且盖住2.5～3.5mm。
3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：所述胶体金标记的农药特异性兔多抗是由30±1nm的纳米金颗粒与农药特异性兔多抗相结合的复合物，农药特异性兔多抗与胶体金的结合浓度为60±1mg/L，即每1L的胶体金溶液中配用60±1mg的农药特异性兔多抗，胶体金溶液中胶体金的质量浓度为0.01±0.001％。
4.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：所述检测线包被的农药小分子完全抗原是指分别将农药半抗原偶联到鸡卵清蛋白(OVA)上的人工抗原，浓度为500±5mg/L；农药半抗原与OVA的偶联比为20±1：1；羊抗兔1gG二抗质控线浓度为800±5mg/L，检测线和质控线的包被量均为0.6±0.1μL/mm2。
5.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：所述样品垫采用奥斯龙8964玻璃纤维纸，样品垫需作封闭液处理，封闭模式为样品垫完全吸收封闭液，再作干燥处理。
6.一种根据权利要求1～5任一权利要求所述的试纸条的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
一、抗原、包被原与多克隆抗体的制备
1)完全抗原的制备：称取4.5±0.1mg氟啶虫酰胺代谢物(TFNA)半抗原，用200±5uL无水N，N-二甲基甲酰胺溶解，然后加入6.7±0.1mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐，4.0±0.1mg N-羟基琥珀酰亚胺，混匀，室温持续搅拌反应6±1h(称为TFNA半抗原活化液)；将牛血清白蛋白10±1mg，用3±0.1ml硼酸缓冲溶液溶解(称为蛋白A液)，在室温条件，将TFNA半抗原活化液缓慢加入到蛋白A液中，室温搅拌反应过夜，透析，即得完全抗原；
2)包被原的制备：称取7.8±0.1mg氟啶虫酰胺代谢物(TFNA)半抗原，用300±5uL无水N，N-二甲基甲酰胺溶解，随后加入11.5±0.1mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐，6.9±0.1mg N-羟基琥珀酰亚胺，混匀，室温持续搅拌反应6±1h(称为TFNA半抗原活化液)；称取10±1mg鸡卵白蛋白OVA，溶解于2±0.1ml硼酸缓冲溶液中(称为B液)，在室温条件下，将TFNA半抗原活化液逐滴加入到B液中，室温搅拌反应过夜，透析，即得包被原；
3)多克隆抗体的制备：实验动物选择雄性新西兰大白兔，首免前7天，对试验动物的耳缘静脉取血，分离阴性血清；首次免疫将免疫原(2mg/mL)与等体积的弗氏完全佐剂进行混合，充分乳化，形成油包水的状态，背部皮下6点，后腿肌肉2点免疫；间隔两周，二次免疫，免疫原(1mg/mL)与等体积的弗氏不完全佐剂制备免疫原，背部皮下6点，后腿肌肉2点免疫；从第三次免疫开始直到第七次，免疫原(1mg/mL)与等体积的弗氏不完全佐剂制备免疫原，背部皮下6点，后腿肌肉2点免疫，以两周为间隔期，进行耳缘采血，分离血清，测效价；最后一次免疫，将佐剂用生理盐水替代，耳缘静脉注射，一周后，动脉取血，分离血清，经亲和层析纯化多克隆抗体；
二、试纸条制备
A、胶体金的制备
用新制去离子水配制一定体积的0.01±0.001％(质量浓度)氯金酸溶液，采用冷凝管回流、油浴锅等加热方式将氯金酸溶液加热至沸腾；在磁力搅拌的同时，迅速加入一定体积的1±0.1％(质量浓度)柠檬酸钠水溶液，氯金酸溶液与柠檬酸钠水溶液的体积用量比为100:(0.75～2)，观察溶液颜色变化；当溶液的颜色完全时，继续回流5-7min后停止加热，制备得到胶体金溶液；该胶体金溶液内金胶体的颗粒平均直径为20～60nm金胶体，冷却后无菌密封4℃下保存；
B、金标抗体的制备
取10±0.1mL质量浓度为0.01％的胶体金溶液，逐滴加入1±0.1mL 60mg/L的氟啶虫酰胺及其代谢物特异性兔多抗(一抗)溶液，边加边混匀，混合均匀后静置1±0.1h；再加入2.5±0.1ml含5％BSA(牛血清蛋白)和0.1％PEG(聚乙二醇)的20mM硼酸缓冲溶液，混合均匀后静置1±0.1h；4℃条件下10000±100r/min离心30±1min，弃上清，红色沉淀再用10±0.1mL含1％BSA和0.02％PEG的20±1mM硼酸缓冲溶液复溶(洗涤作用)，然后4℃条件下10000±100r/min离心30±1min，弃上清，再重复上述复溶离心弃上清一次；最后用1％BSA和5％蔗糖的20mM硼酸缓冲溶液溶解红色沉淀并定容至1ml，即获得纯化的氟啶虫酰胺及其代谢物金标一抗，放置于4℃冰箱中备用；
C、样品垫处理
配制封闭液，称取60±1mg牛血清白蛋白(BSA)、60±1mg聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、1000±10mg蔗糖，加入20±1mL 0.01M含0.05％吐温的磷酸缓冲溶液(PBST)中；
将上述试剂和溶液充分涡旋混匀，直至完全溶解，即完成封闭液配制；将样品垫浸入封闭液中，待完全吸附封闭液(即封闭液的余量不再改变，一般为20-30s)后取出，并在37±1℃烘箱中干燥3±0.5小时；放入封口袋，并保存于玻璃干燥器中；
G、金标抗体结合垫制备
将步骤B中所得农药特异性金标抗体均匀包被在步骤C中已干燥的样品垫上，包被量为0.6±0.01μL/mm2，37±1℃烘箱中干燥30±1min，得金标抗体结合垫；放入封口袋中并保存于玻璃干燥器中；
H、检测线、质控线的包被
首先配制保护剂，保护剂为含1±0.1％蔗糖的0.01M PBS溶液；再以配制好的保护剂作为稀释液，分别配制500mg/L的氟啶虫酰胺及其代谢物半抗原-OVA偶联物(检测线)和800mg/L的羊抗兔IgG(质控线)；
采用自动划线仪划线，将检测线和控制线包被在硝酸纤维素膜上，检测线和控制线的包被量均为0.6±0.01μL/mm2；划线完成后将硝酸纤维素膜放于37±1℃烘箱中干燥10±1min，得到包被氟啶虫酰胺及其代谢物半抗原-OVA的检测线和包被羊抗兔IgG二抗质控线硝酸纤维素膜；
I、试纸条的组装
先在PVC衬板的中间段贴上步骤E中制备好的包被有检测线和控制线的硝酸纤维素膜，然后在该硝酸纤维素膜上粘贴金标抗体结合垫，粘贴位置使约一半的金标抗体结合垫位于硝酸纤维素膜的上方；然后，将封闭液处理过的样品垫粘贴在金标抗体结合垫的上方，粘贴位置盖住约一半的金标抗体结合垫；最后粘贴吸水垫，粘贴位置为盖住硝酸纤维素膜约3±0.5mm；衬板组装完成后水平放入自动切条机中，将其切割成3-4mm宽的试纸条。
7.一种氟啶虫酰胺农药的速测方法，其特征在于：采用权利要求6制备的试纸条进行测试，具体过程如下：
1)将待测样品匀浆或切碎，称取样品5.0±0.1g，放入5±0.1mL样品提取液中，并加入一份配套研磨珠，震荡提取1±0.1min，静置3±0.1min后取上清液检测；
2)取上清液滴加2～3滴到试纸条样品垫的点样区中进行层析反应，5～10分钟后，根据检测线和质控线的显色情况判断样品中氟啶虫酰胺及其代谢物农药的阴阳性；
3)质控线显红色表示试纸条有效，未显色则试纸条失效；
4)若质控线显红色且检测线显红色或浅红色则判断为阴性，表示样品中未检测到氟啶虫酰胺，或样品中氟啶虫酰胺的浓度低于最低检出限；
若质控线显红色且检测线未显色则判断为阳性，表示样品中氟啶虫酰胺农药的残留浓度高于最低检出限。
8.根据权利要求7所述的速测方法，其特征在于：所述步骤1)的样品提取液是含30％甲醇的0.01M、pH7.4的磷酸盐缓冲溶液。
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