CN105481977A - 一种基于抗甘胆酸特异性抗体的甘胆酸的免疫检测试剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了甘胆酸特异性半抗原、基于该半抗原的甘胆酸特异性单克隆抗体的制备方法以及用于检测甘胆酸的免疫层析检测方法。上述特异性单克隆抗体是由甘胆酸特异性半抗原偶联蛋白免疫动物获得的。本发明的甘胆酸特异性半抗原在与蛋白偶联后制备的免疫原保留了甘胆酸的特异性活性位点，获得的单克隆抗体与其他8种胆汁酸交叉均小于10％。用上述甘胆酸特异性单克隆抗体制备的时间分辨免疫层析试纸可以快速地测定样本中甘胆酸的含量，提高现有甘胆酸临床诊断的特异性和准确性。

Description

一种基于抗甘胆酸特异性抗体的甘胆酸的免疫检测试剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及免疫检测领域。具体而言涉及一种甘胆酸半抗原、以及使用该甘胆酸半抗原制备的抗体以及使用所制备抗体的免疫检测试剂。具体而言涉及一种甘胆酸时间分辨荧光免疫测试条，测试条所用的抗体是用合成的甘胆酸免疫原免疫小鼠制备的甘胆酸特异性单克隆抗体。
背景技术
甘胆酸(Cholyglycine,CG)是胆酸与甘氨酸结合而成的结合型胆酸之一。在肝细胞内，胆固醇经过及其复杂的酶促反应，转变成初级胆汁酸，其中有胆酸(CA)和鹅去氧胆酸(CD-CA)胆酸、鹅脱氧胆酸(CDCA)和脱氧胆酸(DCA)等。胆酸的类固醇核上有三个羟基(C3、C7、C12)，侧链末端的羧基以肽键与甘氨酸结合，形成甘胆酸，分子量为465.63，结构如式1，
甘胆酸正常代谢途径为肠—肝循环，先由肝细胞合成，经毛细胆管、胆管排入胆囊，随同胆汁进入十二指肠，帮助食物消化。95％甘胆酸在回肠末端重吸收，经门静脉再回肝脏，由肝细胞摄取再利用。正常情况下，肝脏能有效摄取门静脉血中99％以上的甘胆酸，仅有1％甘胆酸进入体循环，因此外周血中甘胆酸含量甚微，正常成人无论空腹或餐后，其血清甘胆酸浓度稳定在低水平。
当肝细胞受损时，肝细胞摄取甘胆酸能力下降，致使血中甘胆酸含量增高；胆汁郁滞时，肝脏排泄胆酸发生障碍，而返流血液循环的甘胆酸含量增高，也使血甘胆酸含量增高。临床证明，各种肝脏疾病如：肝癌、肝硬化、急性肝炎、慢性肝炎等患者的甘胆酸水平均显著升高。大量研究表明，肝损伤的生化指标中甘胆酸比谷丙转氨酶，胆红素等传统的肝功能检验指标更敏感。甘胆酸结合其他指标的分析可以为肝脏疾病的诊断、治疗和预后分析提供更多的依据。此外，甘胆酸水平也是多种胆道系统疾病、妊娠期肝内胆汁淤积症及酒精性肝损伤等的重要诊断依据。因此，测定血清甘胆酸是评价肝细胞功能及其肝胆系物质循环功能的敏感指标之一。
目前，体外定量测定甘胆酸主要是使用放射免疫分析法(RIA)，化学发光免疫分析法(CLIA)等。放射免疫分析法由于需要专门的放免实验室及设施，普通实验室难以开展，另外还会对操作人员的健康产生一定危害，目前已很少使用。化学发光法灵敏度高，但是测定速度较慢，且专用的化学发光检测仪器昂贵，不利于基层开展。
目前本领域需要制备特异性强、灵敏度高的抗甘胆酸特异性抗体，并用该抗体开发出快速、准确、高效、简便的甘胆酸检测试剂，而时间分辨免疫层析测试条，以其检测速度快、操作简单、灵敏度高等特点，已得到越来越多的关注。
发明内容：
为了解决现有甘胆酸临床诊断的不足，本发明的目的是提供一种快速、高效、简便、准确检测待测样本中甘胆酸含量的时间分辨免疫层析测试条及其制备方法。
本发明还提供一种新的甘胆酸免疫原合成方法，用该方法合成的甘胆酸免疫原免疫小鼠获取特异性和亲和力高的单克隆抗体，以及使用所获得的单克隆抗体的时间分辨层析测试条。
具体而言，本发明涉及一种甘胆酸半抗原，其结构式如式1，
其中R为－(CH2)n－，n为2-8的任意整数，载体蛋白为牛血清白蛋白或者人血清白蛋白。
此外，本发明还涉及由上述甘胆酸半抗原制备的抗体。可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体，尤其是由所述半抗原免疫小鼠得到的单克隆抗体。
再次，本发明还涉及一种检测甘胆酸的测试条，包括：
底板，样品垫，结合物释放垫，反应膜，吸水纸；
其中在背板上依次放置样品垫、结合物释放垫、反应膜和吸水纸，并且样品垫与结合物释放垫的一侧有部分重叠，但样品垫与反应膜不重叠；结合物释放垫另一侧与反应膜的一侧部分重叠，但结合物释放垫与吸水纸不重叠；反应膜的另一侧与吸水纸部分重叠；并且在反应膜上从与结合物释放垫部分重叠一侧至与吸水纸部分重叠一侧依次划有结核抗原检测线和质控线，并且检测线和质控线均不与结合物释放垫和吸水纸重叠；
并且其中与抗甘胆酸特异性单克隆抗体偶联的时间分辨荧光纳米粒子位于结合物释放垫中。反应膜上的检测线为卵清蛋白、血清白蛋白、血蓝蛋白或甲状腺球蛋白与甘胆酸衍生物偶联物，上述的甘胆酸衍生物如下式2所示，
其中R为－(CH2)n－，n为2-8的任意整数。
在所述测试条中，所述抗甘胆酸的特异性抗体可以是抗甘胆酸多克隆抗体或者单克隆抗体，尤其由所述半抗原免疫小鼠得到的单克隆抗体。
在所述的测试条，所述乳胶粒子外面包裹氨基葡萄糖凝胶层，内部含有镧系元素。镧系元素包括钐、铕、铽、或其螯合物。
在所述的测试条，所述反应膜为硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜或者尼龙膜，尤其是硝酸纤维素膜。
本发明所述的测试条适用的生物样品为血浆、血清或者尿液。
前述甘胆酸免疫检测试剂可以用于检测待测样本中甘胆酸的含量，所述的待测样本为血清、血浆或尿液。
本发明的主要优点包括：本发明制备的甘胆酸免疫原特异性强，暴露出甘胆酸特有的与其它胆汁酸相区别的甘氨酸部分，制备出的抗甘胆酸单克隆抗体的特异性强、效价高，与其他胆汁酸包括胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、熊脱氧胆酸等的交叉反应≤20％，与其他常见药物无交叉；而本发明制备的甘胆酸时间分辨免疫层析测试条，使用了时间分辨荧光纳米粒子，与普通荧光微球相比,大幅度消除了非特异性的结合,检测信号的信噪比显著提高，与胶体金定量方法相比,消除了样本和背景的干扰,结果更为准确，具有检测速度快、操作简单、灵敏度高等特点，具有明显的临床检验优势。
附图说明
图1是说明本发明免疫层析测试条与对照化学发光试剂盒检测结果的相互关系的图。
以下通过具体实施方式可以使本发明得到更清楚的说明，但本发明并不局限于以下实施例。
实施例一：甘胆酸衍生物的制备及鉴定
以下实施例中所用的甘胆酸衍生物甘氨酸甲酯丁二酸酯化学结构式如式4所示：
该化合物的合成路线如下：
该衍生物具体的合成步骤如下：
化合物2的合成
(1)将50.0g(122.4mmol)化合物1胆酸溶于120mL甲醇，在4℃冰浴搅拌下通氯化氢气体3g，加热回流20分钟。
(2)将上述合成溶液冷却,过滤,干燥,得42.7g产品，白色固体，产率82.6％。
化合物3的合成
(1)称取38.1g(90.2mmol)化合物2溶于400mL吡啶中，0℃加入21.2g(111.2mmol)对甲苯磺酰氯(TsCl)，将此溶液在室温下搅拌24h，得到合成溶液。
(2)将上述合成溶液加入水1000ml,用500ml乙酸乙酯萃取两次,合并有机相,5％盐酸洗,水洗,干燥蒸干。柱色谱纯化产品,得35.3g产品，白色固体，产率67.9％。
化合物4的合成
(1)称取18.2g(31.6mmol)化合物3和6.5g(100.0mmol)叠氮钠溶于120mlDMF中,60℃反应24小时,得到合成溶液。
(2)将上述合成溶液加入水1200ml,600ml乙酸乙酯萃取两次,合并乙酸乙酯萃取液,水洗,干燥,蒸干,柱色谱纯化得11.7g产品，白色固体，产率82.9％。
化合物5的合成
(1)称取10.9g(24.4mmol)化合物4，溶于50mL的甲醇，再加入50mL2M的KOH溶液，加热至完全溶解，冷却，加入水500ml，乙酸乙酯500ml，用盐酸酸化至pH1.0，得到合成溶液。
(2)将上述合成溶液分液，乙酸乙酯层用水洗一次，干燥蒸干，得9.73产品，白色固体，产率92.2％
化合物6的合成
(1)称取5.3g(12.2mmol)化合物5，甘氨酸甲酯盐酸盐4.9g(39.3mmol)，三乙胺3mL，溶于20mL二甲基甲酰胺(DMF)，然后加入2.7g(13.1mmol)，室温反应24小时，得到合成溶液。
(2)将上述合成溶液过滤除去固体，减压蒸干，柱色谱纯化得3.87g产品，白色固体，产率63.0％。
化合物7的合成
(1)称取1.7g(3.4mmol)化合物6，三苯基膦3.8g(14.5mmol)，溶于100ml四氢呋喃，再加入去离子水6mL，氮气保护下回流12小时，得到合成溶液。
(2)将上述合成溶液减压蒸干，柱色谱纯化得1.4g产品，白色固体，产率86.2％。
化合物8的合成
(1)称取533mg(1.1mmol)化合物7放入50mL圆底烧瓶中，然后加20mL无水吡啶，搅拌至完全溶解：再加入285mg(2.85mmol)琥珀酸酐，置通风厨中，加热搅拌反应24h，温度恒定在80℃，经TLC检测，反应基本完成后，终止反应，得到合成溶液。
(2)将上述合成溶液旋转蒸发除去混合物中的吡啶，加入10mL0.1M氢氧化钠溶解，再加入20mL正己烷充分混合除去有机相，用20mL0.2M的盐酸中和，有大量沉淀产生，再用24mL三氯甲烷重复萃取两次合并有机相。除去三氯甲烷溶剂真空干燥，得529mg产品，白色固体，即式4所示的甘氨酸衍生物甘氨酸甲酯丁二酸酯，产率82.3％。
对甘氨酸甲酯丁二酸酯的固体纯化产物进行鉴定：
(1)利用BrukerAvanceIIIplus400MHz对上述化合物进行核磁共振光谱扫描，采用TMS作为内标。结果如下：1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.15(s,1H),8.20(t,J＝6.0Hz,1H),4.45(dt,J＝11.8,6.7Hz,1H),4.14–4.00(m,2H),3.80(d,J＝5.8Hz,3H),3.62(s,3H),2.46(s,4H),2.30–0.51(m,31H)。表征是式4所示化合物。
(2)利用色谱/质谱技术(LCMS)对得到的衍生物进行分析鉴定，采用安捷伦公司的串联四级杆质谱仪LC/MSD1200系列，离子源采用正离子或负离子化模式。色谱柱规格为：KromasilC18(150×4.6mm,5μm)，柱温为50℃，流速为1.0mL/min，检测波长为214nm，流动相为5-95％乙腈-0.01％TFA。LCMS结果显示：纯度>90％；保留时间1.63min.
以上结果可以确定最后得到的白色固体化合物是式4所示的甘氨酸衍生物甘氨酸甲酯丁二酸酯。
该化合物能最大限度暴露了甘胆酸的特异性结构，其在甘胆酸和蛋白之间增加了间隔臂，该间隔臂属于柔韧的钢性结构结构，既保持了甘胆酸与蛋白的空间距离，又保留了甘胆酸偶联后的空间活动范围提高了免疫效果。另外增加的间隔臂只有C和O两种元素，它们之间产生的范得华力较小，空间结构较小，偶联蛋白后间隔臂的免疫原性几乎为零，提高了抗体的特异性。
实施例二：BSA－甘胆酸衍生物偶联物的制备
牛血清白蛋白(BSA)与式3中的甘氨酸衍生物偶联物进行偶联可以作为免疫原，在本实施例中，R为－(CH2)n－，以n＝2为例来说明偶联物的合成方法，用该偶联物免疫动物生产抗甘胆酸的特异性抗体，偶联步骤如下：
(1)称取5mg甘胆酸衍生物，将其溶解在0.1mL二甲基甲酰胺(DMF)中，；称取15mgN-羟基琥珀酰亚胺，将其溶解在0.2mLDMF中；称取15mg二环己基碳二亚胺(EDC)，将其溶解在0.2mLDMF中；将上述3种溶液混合，室温搅拌2h即得A液；
(2)称取10mgBSA，将其溶解在2mL0.05M碳酸氢钠溶液中，所得溶液为B液；
(3)将A液在B液4℃搅拌时逐滴加入到B液，4℃条件下继续搅拌12h；
(4)将步骤(3)反应完溶液在0.02MpH7.4磷酸盐缓冲液中完全透析，即得BSA－甘胆酸衍生物偶联物。放－20℃保存。
类似的－(CH2)n－中的n可取2-8范围中的其他整数，用同样方法可以制备出如式2所示的载体蛋白－甘胆酸衍生物偶联物，作为免疫原时载体蛋白可以是血清白蛋白、血蓝蛋白和甲状腺球蛋白，用于包被反应膜上的检测线时，载体蛋白可以时卵清蛋白和免疫球蛋白。
实施例三：抗甘胆酸特异性抗体的制备
用实施例二中制得的甘胆酸免疫原免疫Balb/c小鼠，制备抗甘胆酸单抗，具体步骤如下：
将甘胆酸免疫原稀释至0.4g/L，并用等体积弗氏完全佐剂进行乳化，然后采用多点皮下方法注射于6～8周龄Balb/c雌性小鼠颈背部。免疫剂量为40μg/只。隔两周进行第二次免疫，免疫剂量减半，并采用弗氏不完全佐剂进行乳化。以后每隔四周加强免疫一次，免疫剂量与第二次相同。四次免疫后，眼底采血，用于抗体滴度检测。
测定免疫小鼠的抗甘胆酸特异性抗血清滴度，选择抗血清滴度较高小鼠用于融合，融合前三天开始向待融合的小鼠腹腔注射20μg免疫原。取免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞以3:1～5:1的比例融合。融合后将细胞置于HAT培养基中，铺到含有饲养细胞的96孔培养板中，铺板浓度约为2×106个细胞/mL，于37℃在含5％CO2的培养箱中培养。
待杂交瘤细胞生长至1/4孔大小时进行筛选。筛选可分泌抗甘胆酸特异性抗体的杂交瘤细胞。然后采用有限稀释法对分泌抗体强的杂交瘤细胞株进行多次的筛选和克隆化，直至所有细胞生长孔的上清均为抗体阳性为止。经过多次筛选和克隆化共筛选出两株阳性克隆，分别命名CG1F5H和CG3G12，用HBT公司的小鼠单克隆抗体亚类鉴定试剂盒进行进行鉴定分别为IgG1和IgG3型。用获得的单克隆细胞诱发小鼠腹水产生抗体，并用Protein-G亲和层析柱对抗体进行纯化，纯化后放－20℃进行冻存。
实施例四：抗甘胆酸特异性抗体的鉴定
通过间接ELISA测定纯化的抗甘胆酸特异性抗体CG1F5H和CG3G12的效价和特异性。CG1F5H和CG3G12的效价分别是1:20000和1:30000。根据公式交叉反应率＝[IC50(甘胆酸)/IC50(类似物)]×100％进行计算CG1F5H和CG3G12与8种常见甘胆酸类似物以及22种常见药物的交叉反应率，。
表2交叉反应实验结果
以上结果表明，用本发明的抗甘胆酸特异性抗体CG3G128亲和性好，特异性高，与8种甘胆酸类似物，交叉反应率<10％，测试22种常见药物无交叉。该抗体的获得主要与设计了高特异性的甘胆酸半抗原有关，半抗原增加了间隔臂，最大限度暴露了甘胆酸的特异性结构，使半抗原与蛋白偶联后，既保持了甘胆酸与蛋白的空间距离，又保留了甘胆酸偶联后的空间活动范围提高了免疫效果。另外隔臂的免疫原性几乎为零，提高了抗体的特异性。
最后选择CG3G12应用于本发明甘胆酸测试条的制备。
实施例五:抗甘胆酸特异性单克隆抗体偶联的时间分辨荧光纳米粒子的制备
(1)将时间分辨荧光纳米粒子用0.05MpH6.0的2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液稀释，终浓度为0.1％，为A液；称取20mgEDC溶于1mL去离子水中，即为B液；
(2)取10mLA液加入B液，混匀，室温振荡1h。即为活化的纳米粒子；
(3)将上述活化的纳米粒子用0.05MpH7.5的硼酸缓冲液离心洗涤2次，然后用0.05MpH7.5的硼酸缓冲液复溶至10mL，超声分散；
(4)将0.5mg抗甘胆酸特异性抗体CG3G12加入到步骤(3)复溶的纳米粒子中，室温震荡2小时；
(5)抗体偶联的纳米粒子用0.05MpH7.5的硼酸缓冲液离心洗涤2次，用含1％BSA0.5MpH7.5Tris-甘氨酸缓冲液封闭，室温震荡2小时；
(6)将上述封闭的纳米粒子离心，去上清液，用1mL含1％BSA0.5MpH7.5Tris-甘氨酸缓冲液复溶，放4℃保存，即为抗甘胆酸特异性单克隆抗体CG3G12偶联的时间分辨荧光纳米粒子。
实施例六:甘胆酸时间分辨荧光免疫层析测试条的制备：
甘胆酸时间分辨荧光免疫层析测试条由样品垫、结合物释放垫、反应膜(含检测线和质控线)、吸收垫、背板等几部分组成，组装成4mm宽度的测试条。其中结合物释放垫包被有抗甘胆酸特异性单克隆抗体偶联的时间分辨荧光纳米粒子，反应膜上的检测线包被载体蛋白－甘胆酸衍生物偶联物，反应膜上的质控线包被羊抗鼠IgG多抗。载体蛋白－甘胆酸衍生物偶联物中的载体蛋白可以是血清白蛋白、血蓝蛋白、甲状腺球蛋白、卵清蛋白和免疫球蛋白，优选的载体蛋白为卵清蛋白。
甘胆酸时间分辨荧光免疫层析测试条的具体制备方法如下：
(1)结合物释放垫制备：将上述制备的抗甘胆酸特异性单克隆抗体偶联的时间分辨荧光纳米粒子用含0.5％的Tween20的0.02MpH7.4的磷酸盐缓冲液稀释，均匀地涂布在玻璃纤维素纸上，真空干燥，抗体偶联纳米粒子的稀释倍数范围1:100-1:10000，在本实施例中具体的比例是1:5000。
(2)反应膜上的检测线：将卵清蛋白－甘胆酸衍生物偶联物用0.02MpH7.4的磷酸盐缓冲液稀释，按1uL/厘米喷在硝酸纤维膜上,干燥，偶联物的浓度范围在0.2-2.0mg/mL，在本实施例中具体的浓度为1mg/mL。
(3)反应膜上的质控线：将羊抗鼠IgG用0.02MpH7.4的磷酸盐缓冲液稀释，按1ul/厘米喷在硝酸纤维膜上,干燥，经稀释的羊抗鼠IgG的浓度范围在0.5-2.0mg/mL，在本实施例中具体的浓度为2mg/mL。
(4)样品垫：用样品垫处理液浸泡样品垫，干燥处理。样品垫处理液为pH为7.4的0.02M磷酸盐缓冲溶液,含0.1－1％TritonX-100，0.2-2％聚乙烯吡咯烷酮)PVP，0.1-1％EDTA和0.1-2％BSA。含0.1－1％TritonX-100、0.2-2％聚乙烯吡咯烷酮)PVP、0.1-1％EDTA和0.1-2％BSA。在本实施例中TritonX-100，PVP，EDTA和BSA的具体浓度分别是0.1％、0.5％、0.5％和0.2％。
(5)测试条组装：将样品垫、结合物释放垫、反应膜(含检测线和质控线)、吸收垫、背板组装成测试条，切割成适宜宽度，例如4mm宽度。
上述的甘胆酸时间分辨荧光免疫层析测试条可以用于检测待测样本中甘胆酸的含量，所述的待测样本为血清、血浆或尿液。
实施例七：甘胆酸时间分辨荧光免疫层析测试条检验及性能评价
1.检测方法：取100μl校准品或待测样本,缓慢滴加于本发明的甘胆酸时间分辨荧光免疫层析测试条的加样孔中,等待10分钟后,将检测板插入到时间分辨荧光检测仪,读取检测结果。由于校准品中或待测样本中含有甘胆酸,甘胆酸与抗甘胆酸特异性单克隆抗体偶联的时间分辨荧光纳米粒子结合,一起沿硝酸纤维膜向前流动,到达检测线位置时,与固定在膜上的卵清蛋白－甘胆酸衍生物竞争结合时间分辨荧光纳米粒子上的抗甘胆酸抗体,校准品中或样本中甘胆酸含量越高,结合在检测线上的纳米粒子就越少，荧光值低，反之含量越低，荧光值越高，可以通过荧光值定量检测甘胆酸。纳米粒子标记的抗甘胆酸特异性单克隆抗体会与对照线上的羊抗鼠IgG多抗结合,形成对照线,说明检测系统工作正常。
2.制定标曲：取空白血清样本，添加甘胆酸，梯度稀释浓度为0.5、1.5、4.5、13.5、40.5mg/L。用上述5个浓度依次用本发明的甘胆酸时间分辨荧光免疫层析测试条检测三次，并用时间分辨荧光检测仪读值，三次结果平均后制作标准曲线。
3.准确度和精密度
通过本发明的甘胆酸时间分辨荧光免疫层析测试条得到的标准曲线，测定具有溯源性的人血清配制的低值、中值和高值质控各一份,甘胆酸浓度分别是2、15和30mg/L用发明的测试条进行检测10次,检测数据及数据分析见表1。
表1准确度和精密度
以上结果说明本发明的甘胆酸时间分辨荧光免疫层析测试条测定的准确度高，回收率范围在98.0％－106.8％，精密度高，批内变异小于10％。
4.线性相关性分析
用实施例五制备的甘胆酸测试条和新产业的甘胆酸化学发光检测试剂盒,同时检测包括10份阴性样本在内的60份临床血清样本,比较本发明甘胆酸测试条与市售甘胆酸化学发光检测试剂盒检测结果的相关性。测定数据见表2.
表2临床真实样本测定值
根据上述数据作图，得到图1，线性相关方程为：y＝0.9899x-0.0837，R＝0.991，结果表明本发明的甘胆酸测试条与化学发光试剂盒测定结果相关性较好，测定甘胆酸临床标本准确度高。

Claims (12)

1.一种甘胆酸半抗原，其结构式如式1，
其中R为－(CH2)n－，n为2-8的任意整数，载体蛋白为牛血清白蛋白或者人血清白蛋白。
2.由权利要求1中所述甘胆酸半抗原制备的抗体。
3.根据权利要求2所述的抗体，其中所述抗体是多克隆抗体。
4.根据权利要求2所述的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的抗体，其中所述单克隆抗体是用权利要求1的半抗原免疫小鼠得到的单克隆抗体。
6.一种检测甘胆酸的测试条，包括：
底板，样品垫，结合物释放垫，反应膜，吸水纸；
其中在背板上依次放置样品垫、结合物释放垫、反应膜和吸水纸，并且样品垫与结合物释放垫的一侧有部分重叠，但样品垫与反应膜不重叠；结合物释放垫另一侧与反应膜的一侧部分重叠，但结合物释放垫与吸水纸不重叠；反应膜的另一侧与吸水纸部分重叠；并且在反应膜上从与结合物释放垫部分重叠一侧至与吸水纸部分重叠一侧依次划有结核抗原检测线和质控线，并且检测线和质控线均不与结合物释放垫和吸水纸重叠；
并且其中与抗甘胆酸特异性单克隆抗体偶联的时间分辨荧光纳米粒子位于结合物释放垫中。反应膜上的检测线为反应膜上的检测线为卵清蛋白、血清白蛋白、血蓝蛋白或甲状腺球蛋白与甘胆酸衍生物偶联物，上述的甘胆酸衍生物如下式2所示，
其中R为－(CH2)n－，n为2-8的任意整数。
7.权利要求6所述的测试条，其中所述抗甘胆酸的特异性单抗是权利要求5所述的抗体。
8.权利要求6所述的测试条，其中所述乳胶粒子外面包裹氨基葡萄糖凝胶层，内部含有镧系元素。
9.权利要求8所述的测试条，其中所述的镧系元素包括钐、铕、铽、或其螯合物。
10.权利要求6所述的测试条，其中所述的反应膜为硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜或者尼龙膜。
11.权利要求10所述的测试条，其中所述的反应膜为硝酸纤维素膜。
12.权利要求6中任一项所述的测试条，其中所述生物样品为、血浆、血清或者尿液。
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