CN107389637A - 一种定量测定尿液中甘胆酸的检测方法 - Google Patents

一种定量测定尿液中甘胆酸的检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107389637A
CN107389637A CN201710581071.9A CN201710581071A CN107389637A CN 107389637 A CN107389637 A CN 107389637A CN 201710581071 A CN201710581071 A CN 201710581071A CN 107389637 A CN107389637 A CN 107389637A
Authority
CN
China
Prior art keywords
glycocholic acid
tracer
working solution
solution
polyclonal antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710581071.9A
Other languages
English (en)
Inventor
赵肃清
何绮怡
崔锡平
陈莹珊
沈定
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangdong Nanyue Pharmaceutical Co., Ltd
Original Assignee
Guangdong University of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangdong University of Technology filed Critical Guangdong University of Technology
Priority to CN201710581071.9A priority Critical patent/CN107389637A/zh
Publication of CN107389637A publication Critical patent/CN107389637A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6445—Measuring fluorescence polarisation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明提供了一种测试尿液中甘胆酸含量的检测方法，包括：a)将尿液待测样、甘胆酸示踪物工作溶液和甘胆酸多克隆抗体工作溶液混合、孵育，得到检测样；其中，甘胆酸示踪物具有式(Ⅰ)所示结构；甘胆酸多克隆抗体是由甘胆酸与牛血清蛋白偶联所得的免疫抗原免疫兔子后所得的抗血清；b)对所述检测样进行荧光偏振光检测，获得偏振光强度；c)根据所述偏振光强度与预定的甘胆酸标准曲线，得到尿液待测样中甘胆酸的浓度。本发明提供的检测方法能够简便快捷、准确的测定尿液中甘胆酸含量；而且，采用本发明检测方法进行实时检测时，线性范围宽、准确且灵敏度高，是一种易于高通量检测且低成本的检测方法。

Description

一种定量测定尿液中甘胆酸的检测方法
技术领域
本发明涉及检测分析技术领域，特别涉及一种定量测定尿液中甘胆酸的检测方法。
背景技术
甘胆酸(cholyglycine，简称CG)，别名N-(3,7,12-三羟基-24-羰基胆烷-24-基)-甘氨酸，是胆汁酸的主要成分之一，由胆酸与甘氨酸结合而成。甘胆酸是由肝细胞合成，同胆汁进入肠道，经门静脉再回到肝脏；当肝细胞受损时，肝细胞摄取甘胆酸的能力下降，致使血液中甘胆酸含量增加，因此，测定甘胆酸含量可以作为评价肝细胞功能及肝胆系统物质循环功能的敏感指标之一，也是肝病患者肝功能受损程度及肝病治疗恢复效果评价的灵敏度及特异性较好的指标之一。
临床上检测甘胆酸多取静脉血，而针对一些小儿患者或不便于取静脉血的患者，通常不便实施检测。相关研究表明，胆汁酸经肾脏排泄十分明显，并与肝胆疾病程度相关，因此，检测尿液中的甘胆酸对临床有较大的指导价值，对于小儿患者和不便于静脉取血的患者，也更方便实施检测。
目前，常用的定量检测方法主要是仪器检测法和免疫法，其中，仪器检测法包括薄层荧光法、高效液相色谱法、高效液相色谱-串联质谱法和超高液相色谱法，这些测试方法需要大型仪器和复杂的样品前处理；免疫法包括放射免疫法、化学发光免疫法和免疫透射比浊法等，这些方法中，有些会存在放射性污染，而且多数测试方法的测试结果解读或者配套仪器也比较复杂，不适合家庭、个人乃至医院使用。因此，建立一种操作简单快捷、成本低廉的定量测定甘胆酸的检测分析方法对于临床中相关疾病的诊断及监控具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种定量测定测试尿液中甘胆酸的检测方法，本发明提供的检测方法能够简便快捷、准确的测定尿液中甘胆酸含量。
本发明提供了一种定量测定尿液中甘胆酸的检测方法，包括以下步骤：
a)将尿液待测样、甘胆酸示踪物工作溶液和甘胆酸多克隆抗体工作溶液混合、孵育，得到检测样；
其中，甘胆酸示踪物具有式(Ⅰ)所示结构：
甘胆酸多克隆抗体是由甘胆酸与牛血清蛋白偶联所得的免疫抗原免疫兔子后所得的抗血清；
b)对所述检测样进行荧光偏振光检测，获得偏振光强度；
c)根据所述偏振光强度与预定的甘胆酸标准曲线，得到尿液待测样中甘胆酸的浓度。
优选的，所述步骤a)中，甘胆酸示踪物工作溶液为以硼酸盐缓冲液为稀释剂，将甘胆酸示踪物稀释到一定稀释度的稀释液；
所述甘胆酸示踪物工作溶液的稀释度为1∶16000；
所述甘胆酸多克隆抗体工作溶液为以硼酸盐缓冲液为稀释剂，将甘胆酸多克隆抗体稀释到一定稀释度的稀释液；
所述甘胆酸多克隆抗体工作溶液的稀释度为1∶1000。
优选的，所述步骤c)中，预设的甘胆酸标准曲线通过以下方式获得：
用PBS缓冲液将甘胆酸配制成系列浓度的甘胆酸标准液；
对所述系列浓度的甘胆酸标准液、甘胆酸示踪物工作溶液与甘胆酸多克隆抗体工作溶液经混合孵育所得的系列总混合液进行荧光偏振光检测，获得系列总混合液的系列偏振光强度mP；
对PBS缓冲液、甘胆酸示踪物工作溶液与甘胆酸多克隆抗体工作溶液经混合孵育所得的总空白液进行荧光偏振光检测，获得总空白液的偏振光强度mP0；
根据mP/mP0的比值和相应的甘胆酸标准液的浓度，获得甘胆酸标准曲线。
优选的，所述甘胆酸示踪物工作溶液中，硼酸盐缓冲液的浓度为1～8mmol/L，PH值为7.0～8.5；
所述甘胆酸多克隆抗体工作溶液中，硼酸盐缓冲液的浓度为1～8mmol/L，PH值为7.0～8.5。
优选的，所述PBS缓冲液的浓度为0.01mol/L，PH值为7.4。
优选的，所述步骤a)中，尿液待测样、甘胆酸示踪物工作溶液和甘胆酸多克隆抗体工作溶液的体积比为1：10：10。
优选的，所述系列浓度的甘胆酸标准液、甘胆酸示踪物工作溶液与甘胆酸多克隆抗体工作溶液混合孵育时，甘胆酸标准液、甘胆酸示踪物工作溶液与甘胆酸多克隆抗体工作溶液的体积比为1：10：10；
PBS缓冲液、甘胆酸示踪物工作溶液与甘胆酸多克隆抗体工作溶液混合孵育时，PBS缓冲液、甘胆酸示踪物工作溶液与甘胆酸多克隆抗体工作溶液的体积比为1：10：10。
优选的，所述甘胆酸示踪物通过以下方式获得：
将甘胆酸、N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基二亚胺溶于二甲基甲酰胺中，形成混合液；
将所述混合液与4-胺甲基荧光素混合反应，得到反应液；
以体积比为4∶1的氯仿与甲醇的混合物为层析液，采用TLC薄层色谱纯化方法对所得反应液进行薄层层析和分离提纯，得到甘胆酸示踪物。
优选的，在采用TLC薄层色谱纯化方法对所得反应液进行薄层层析和分离提纯后，用甲醇萃取，得到具有不同Rf值的分离物，选择Rf值为0.94的分离物为甘胆酸示踪物。
优选的，所述步骤a)中，甘胆酸示踪物工作溶液的稀释度通过以下方式获得：
用硼酸盐缓冲液将所述甘胆酸示踪物稀释成系列稀释度的示踪物供试液并进行荧光偏振光检测，获得系列稀释度的示踪物供试液的偏振光强度；
以硼酸盐缓冲液为空白溶液并进行荧光偏振光检测，获得空白溶液的偏振光强度；
选择偏振光强度为空白溶液偏振光强度10～15倍的示踪物供试液的稀释度为甘胆酸示踪物工作溶液的稀释度；
所述甘胆酸多克隆抗体工作溶液的稀释度通过以下方式获得：
用硼酸盐缓冲液将甘胆酸多克隆抗体稀释成系列稀释度的抗体供试液，分别与所述甘胆酸示踪物工作溶液混合、孵育，得到系列抗体-标记物混合液；
分别对所述系列抗体-标记物混合液进行荧光偏振光检测，获得系列抗体-标记物混合液的偏振光强度；
根据系列抗体-标记物混合液的偏振光强度和相应的抗体供试液的稀释度，获得抗体供试液曲线；
选择抗体供试液曲线中最大偏振光强度的70％为标准偏振值，以所述标准偏振值所对应的稀释度为甘胆酸多克隆抗体工作溶液的稀释度。
本发明提供了一种测试尿液中甘胆酸含量的检测方法，包括以下步骤：a)将尿液待测样、甘胆酸示踪物工作溶液和甘胆酸多克隆抗体工作溶液混合、孵育，得到检测样；其中，甘胆酸示踪物具有式(Ⅰ)所示结构；甘胆酸多克隆抗体是由甘胆酸与牛血清蛋白偶联所得的免疫抗原免疫兔子后所得的抗血清；b)对所述检测样进行荧光偏振光检测，获得偏振光强度；c)根据所述偏振光强度与预定的甘胆酸标准曲线，得到尿液待测样中甘胆酸的浓度。本发明提供的检测方法能够简便快捷、准确的测定尿液中甘胆酸含量；而且，采用本发明检测方法进行实时检测时，线性范围宽、准确且灵敏度高。实验结果表明，本发明提供的检测方法的线性范围为35.94～2598.9ng/mL，IC50＝305.62ng/mL，最低检测限为8.63ng/mL，加标回收率在100％左右，其线性范围宽，检出限低，灵敏度和准确度高；同时，本发明的检测方法简便易行，无需复杂昂贵的设备，且检测快速便捷，在十几分钟甚至数分钟即可完成检测，是一种易于高通量检测且低成本的检测方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为实施例1中甘胆酸示踪物的合成路线图；
图2为实施例1中所得抗体供试液曲线图；
图3为实施例1中所得甘胆酸标准曲线图。
具体实施方式
本发明提供了一种定量测定尿液中甘胆酸的检测方法，包括以下步骤：
a)将尿液待测样、甘胆酸示踪物工作溶液和甘胆酸多克隆抗体工作溶液混合、孵育，得到检测样；
其中，甘胆酸示踪物具有式(Ⅰ)所示结构：
甘胆酸多克隆抗体是由甘胆酸与牛血清蛋白偶联所得的免疫抗原免疫兔子后所得的抗血清；
b)对所述检测样进行荧光偏振光检测，获得偏振光强度；
c)根据所述偏振光强度与预定的甘胆酸标准曲线，得到尿液待测样中甘胆酸的浓度。
采用本发明提供的检测方法能够简便快捷、准确的测定尿液中甘胆酸含量；而且，采用本发明检测方法进行实时检测时，线性范围宽、灵敏度高，是一种易于高通量检测且低成本的检测方法。
按照本发明，将尿液待测样、甘胆酸示踪物工作溶液和甘胆酸多克隆抗体工作溶液混合、孵育，得到检测样。
本发明中，甘胆酸示踪物工作溶液中的甘胆酸示踪物优选由甘胆酸与4-胺甲基荧光素(即AMF)经偶联反应形成；所述甘胆酸示踪物具有式(Ⅰ)所示结构：
本发明中，所述式(Ⅰ)所示的甘胆酸示踪物优选通过以下方式获得：
S1)将甘胆酸、N-羟基琥珀酰亚胺(即NHS)、二环己基二亚胺(即DCC)溶于二甲基甲酰胺(即DMF)中，形成混合液；
S2)将所述混合液与4-胺甲基荧光素(即AMF)混合反应，得到反应液；
S3)以体积比为4∶1的氯仿与甲醇的混合物为层析液，采用TLC薄层色谱纯化方法对所得反应液进行薄层层析和分离提纯，得到甘胆酸示踪物。
其中，步骤S1)中，甘胆酸、N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基二亚胺的质量比优选为(3～10)∶(0.8～1.5)∶(1.5～2.5)。所述甘胆酸与4-胺甲基荧光素的质量比优选为(3～10)∶(1～2)。
本发明中，所述步骤S3)中利用TLC薄层色谱纯化方法进行薄层层析和分离提纯后，形成具有不同Rf值的条带，优选利用甲醇进行萃取溶解，得到具有不同Rf值的分离物，优选选择Rf值为0.94的分离物为甘胆酸示踪物。
TLC是一种薄层色谱纯化方法，将欲分离的样品点在薄层板上，利用适宜的展开剂或层析液展开，使样品中的成分得以分离，在薄层板上形成具有不同Rf值的条带。本发明的一些实施例中，在利用体积比为4∶1的氯仿与甲醇的混合物为层析液进行分离，形成了Rf值分别为0.31和0.94的条带，利用甲醇萃取后，得到了Rf值分别为0.31和0.94的分离物，最终选择Rf值为0.94的分离物为甘胆酸示踪物。
本发明中，优选通过以下方式从不同Rf值的分离物中筛选合适的甘胆酸示踪物：将具有不同Rf值的分离物分别与甘胆酸多克隆抗体混合，并进行荧光偏振检测，选择荧光偏振值显著增加的体系中所对应的Rf值分离物作为甘胆酸示踪物。本发明通过示踪物与抗体的结合测试来筛选甘胆酸示踪物，若示踪物与抗体发生结合，会形成大分子抗原抗体复合物，体系的荧光偏振值显著增加，相反，若示踪物与抗体不发生结合，则荧光偏振值变化不大，通过以上方式筛选出合适的甘胆酸示踪物。
本发明以甘胆酸为半抗原，并选择4-胺甲基荧光素与所述半抗原结合制备甘胆酸示踪物，能够使检测方法具有高灵敏度。
本发明中，在获得甘胆酸示踪物后，确定具有合适稀释度的甘胆酸示踪物工作溶液。
本发明中，所述甘胆酸示踪物工作溶液优选为以硼酸盐缓冲液为稀释剂，将甘胆酸示踪物稀释到一定稀释度的稀释液；所述甘胆酸示踪物工作溶液的稀释度优选为1∶16000。稀释度是指稀释前样品体积与稀释后样品体积的比例，如稀释度1∶10是指将1体积份的样品与稀释剂混合，使体积扩大至10体积份。
本发明中，所述甘胆酸示踪物工作溶液的稀释度优选通过以下方式获得：S1)用硼酸盐缓冲液将所述甘胆酸示踪物稀释成系列稀释度的示踪物供试液并进行荧光偏振光检测，获得系列稀释度的示踪物供试液的偏振光强度；S2)以硼酸盐缓冲液为空白溶液并进行荧光偏振光检测，获得空白溶液的偏振光强度；步骤S1)与步骤S2)没有顺序限制；S3)选择偏振光强度为空白溶液偏振光强度10～15倍的示踪物供试液的稀释度为甘胆酸示踪物工作溶液的稀释度。在一些实施例中，所述系列稀释度的示踪物供试液的稀释度可以分别为1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000、1∶32000和1∶640000；在一些实施例中，可以根据系列稀释度的示踪物供试液的偏振光强度和示踪物供试液的稀释度绘制示踪物供试液曲线，将10～15倍于空白溶液偏振光强度的荧光偏振值与所得示踪物供试液曲线比对，选择相应的稀释度为甘胆酸荧光示踪物工作溶液的稀释度。在一些实施例中，选择偏振光强度为空白溶液偏振光强度12倍的示踪物供试液的稀释度为甘胆酸示踪物工作溶液的稀释度。
本发明中，在稀释甘胆酸示踪物时，所用硼酸盐缓冲液稀释剂的浓度优选为1～8mmol/L，PH值优选为7.0～8.5。
本发明中，甘胆酸多克隆抗体工作溶液中的甘胆酸多克隆抗体是由甘胆酸与牛血清蛋白偶联所得的免疫抗原免疫兔子后所得的抗血清。
其中，所述免疫抗原优选通过以下方式获得：S1)将甘胆酸、N-羟基琥珀酰亚胺(即NHS)、二环己基碳二亚胺(即DCC)混合，离心，取上清液；S2)将所述上清液、牛血清蛋白和PBS缓冲液混合反应，得到反应液；S3)将所述反应液离心，取上清液并用PBS缓冲液透析，得到免疫抗原。本发明中，所述步骤S1)中，甘胆酸、N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺的质量比优选为(10～40)∶(10～30)∶(20～40)；所述步骤S1)中的甘胆酸与步骤S2)中的牛血清的质量比优选为(10～40)∶(100～150)。
得到免疫抗原后，用所述免疫抗原免疫兔子制取甘胆酸多克隆抗体，其过程优选如下：
S1)用PBS缓冲液将所得免疫抗原配制成免疫抗原溶液；
将所述免疫抗原溶液与弗氏完全佐剂混合乳化，得到乳液Ⅰ；
将所述免疫抗原溶液与弗氏不完全佐剂混合乳化，得到乳液Ⅱ；
S2)采用皮下多点注射的免疫方式对兔子注射乳液Ⅰ，即首次免疫；首次免疫两周后，采用皮下多点注射的免疫方式对兔子注射乳液Ⅱ，即首次加强免疫；之后，每隔两周进行一次加强免疫，共加强免疫四次，于最后一次加强免疫一周后对兔子耳部静脉取血，将收集到的血液离心分离，取上清液，即为甘胆酸多克隆抗体。
在一些实施例中，用免疫抗原免疫兔子制取甘胆酸多克隆抗体的具体过程如下：用浓度为0.01mol/L、PH值为7.4的PBS缓冲液将所得免疫抗原配制成1mg/mL的免疫抗原溶液；将1mL所述免疫抗原溶液与弗氏完全佐剂等体积混合乳化，得到乳液Ⅰ；将1mL所述免疫抗原溶液与弗氏不完全佐剂等体积混合乳化，得到乳液Ⅱ；采用皮下多点注射的免疫方式对兔子注射2mL乳液Ⅰ，即首次免疫；首次免疫两周后，采用皮下多点注射的免疫方式对兔子注射2mL乳液Ⅱ，即首次加强免疫；之后，每隔两周进行一次加强免疫，共加强免疫四次，于最后一次加强免疫一周后对兔子耳部静脉取血，将收集到的血液于4℃下以10000rpm的离心速度离心分离10min，取上清液，即得甘胆酸多克隆抗体；所得甘胆酸多克隆抗体优选置于-20℃下保存备用。
本发明中，在获得甘胆酸多克隆抗体后，确定具有合适稀释度的甘胆酸多克隆抗体工作溶液。
本发明中，所述甘胆酸多克隆抗体工作溶液优选为以硼酸盐缓冲液为稀释剂，将甘胆酸多克隆抗体稀释到一定稀释度的稀释液；所述甘胆酸多克隆抗体工作溶液的稀释度优选为1∶1000。
本发明中，所述甘胆酸多克隆抗体工作溶液的稀释度优选通过以下方式获得：S1)用硼酸盐缓冲液将甘胆酸多克隆抗体稀释成系列稀释度的抗体供试液，分别与所述甘胆酸示踪物工作溶液混合、孵育，得到系列抗体-标记物混合液；S2)分别对所述系列抗体-标记物混合液进行荧光偏振光检测，获得系列抗体-标记物混合液的偏振光强度；S3)根据系列抗体-标记物混合液的偏振光强度和相应的抗体供试液的稀释度，获得抗体供试液曲线；S4)选择抗体供试液曲线中最大偏振光强度的70％为标准偏振值，以所述标准偏振值所对应的稀释度为甘胆酸多克隆抗体工作溶液的稀释度。在一些实施例中，所述系列稀释度的抗体供试液的稀释度可以分别为1∶222、1∶250、1∶285、1∶333、1∶400、1∶500、1∶1000和1∶2000。本发明中，抗体供试液与甘胆酸示踪物工作溶液优选等体积混合；一些实施例中，二者的体积均为0.5mL。
本发明中，在稀释甘胆酸多克隆抗体时，所用硼酸盐缓冲液稀释剂的浓度优选为1～8mmol/L，PH值优选为7.0～8.5。
本发明中，采用所得稀释度的甘胆酸示踪物工作溶液和甘胆酸多克隆抗体工作溶液能够使检测方法准确、灵敏。
按照本发明，在获得尿液待测样、甘胆酸示踪物工作溶液和甘胆酸多克隆抗体工作溶液后，将三者混合，得到检测样。本发明中，所述尿液待测样、甘胆酸示踪物工作溶液和甘胆酸多克隆抗体工作溶液的体积比优选为1：10：10；在一些实施例中，具体可分别为50μL、500μL和500μL。
按照本发明，在获得检测样后，对所述检测样进行荧光偏振光检测，获得偏振光强度。所述荧光偏振光检测可借助荧光偏振光测试仪，经检测后，获得偏振光强度。
按照本发明，在获得检测样的偏振光强度后，根据所得偏振光强度与预定的甘胆酸标准曲线，得到尿液待测样中甘胆酸的浓度。
本发明中，所述预定的甘胆酸标准曲线优选通过以下方式获得：
S1)用PBS缓冲液将甘胆酸配制成系列浓度的甘胆酸标准液；
S2)对所述系列浓度的甘胆酸标准液、甘胆酸示踪物工作溶液与甘胆酸多克隆抗体工作溶液经混合孵育所得的系列总混合液进行荧光偏振光检测，获得系列总混合液的系列偏振光强度mP；
S3)对PBS缓冲液、甘胆酸示踪物工作溶液与甘胆酸多克隆抗体工作溶液经混合孵育所得的总空白液进行荧光偏振光检测，获得总空白液的偏振光强度mP0；
步骤S2)和步骤S3)没有顺序限制；
S4)根据mP/mP0的比值和相应的甘胆酸标准液的浓度，获得甘胆酸标准曲线。
本发明中，所述步骤S1)中，PBS缓冲液的浓度优选为0.01mol/L，PH值优选为7.4。在一些实施例中，可利用PBS缓冲液将甘胆酸配制成如下系列浓的甘胆酸标准液：106ng/mL、105ng/mL、104ng/mL、103ng/mL、500ng/mL、100ng/mL、10ng/mL、1ng/mL。
在得到系列浓度的甘胆酸标准液后，将所述系列浓度的甘胆酸标准液、甘胆酸示踪物工作溶液与甘胆酸多克隆抗体工作溶液进行混合孵育，得到系列总混合液；对所得系列总混合液进行荧光偏振光检测，获得系列总混合液所对应的系列偏振光强度mP。其中，甘胆酸标准液、甘胆酸示踪物工作溶液与甘胆酸多克隆抗体工作溶液的体积比优选为1：10：10；在一些实施例中，可分别为50μL、500μL和500μL。本发明中，所述孵育的时间优选为1～10min。
本发明还将PBS缓冲液、甘胆酸示踪物工作溶液与甘胆酸多克隆抗体工作溶液进行混合孵育，得到总空白液；对所得总空白液进行荧光偏振光检测，获得总空白液的偏振光强度mP0。本发明中，PBS缓冲液、甘胆酸示踪物工作溶液与甘胆酸多克隆抗体工作溶液的体积比优选为1：10：10；在一些实施例中，可分别为50μL、500μL和500μL。本发明中，所述孵育的时间优选为1～10min。
本发明中，获得mP与mP0的顺序没有限制。
本发明中，获得mP与mP0后，根据mP与mP0的比值(即抑制率mP/mP0)和相应的甘胆酸标准液的浓度，获得甘胆酸标准曲线。在一些实施例中，以mP/mP0的比值为纵坐标，以每个mP所对应的甘胆酸标准液的浓度为横坐标，绘制得到甘胆酸标准曲线。
按照本发明，在获得甘胆酸标准曲线和检测样的偏振光强度后，根据二者的对应关系，即得检测样中尿液待测样中甘胆酸的浓度。具体的，在获得检测样的偏振光强度mPx后，将mPx/mP0的比值与甘胆酸标准曲线进行比对，吻合点对应的甘胆酸浓度即为尿液待测样中甘胆酸的浓度。本发明的一些实施例中，所述尿液待测样为将收集的尿液上清液稀释数倍后的测试样，待测出甘胆酸浓度后，再反算相应的稀释倍数即得尿液中甘胆酸浓度。
本发明提供的检测方法能够简便快捷、准确的测定尿液中甘胆酸含量；而且，采用本发明检测方法进行实时检测时，线性范围宽、准确且灵敏度高。实验结果表明，本发明提供的检测方法的线性范围为35.94～2598.9ng/mL，IC50＝305.62ng/mL(即抑制率mP/mP0为50％时所对应的甘胆酸的浓度)，最低检测限为8.63ng/mL，加标回收率在100％左右，其线性范围宽，检出限低，灵敏度和准确度高；同时，本发明的检测方法简便易行，无需复杂昂贵的设备，且检测快速便捷，在十几分钟甚至数分钟即可完成检测，是一种易于高通量检测且低成本的检测方法。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
实施例1
1.1甘胆酸示踪物的制备
(1)示踪物的制备
将20mg NHS溶于4mL DMF中，形成NHS溶液；将40mgDCC溶于4mLDMF中，形成DCC溶液；取200μL NHS溶液、200μL DCC溶液、5mg甘胆酸混合，于室温下避光旋转过夜后，形成混合液；向所述混合液中加入1.5mg AMF，室温下避光旋转反应1小时，得到反应液；以体积比为4∶1的氯仿与甲醇的混合物为层析液，采用TLC薄层色谱纯化方法对所得反应液进行薄层层析和分离提纯，在紫外透射仪下观察，并用500μL甲醇萃取，得到Rf值分别为0.31和0.94的2种分离物。
(2)示踪物的筛选：
将所得2种分离物分别与甘胆酸多克隆抗体(制备方法参见下文1.3节)混合，在加入抗体前后，分别进行荧光偏振检测。结果显示，Rf值为0.94的分离物在加入抗体后，荧光偏振强度显著增加，说明其上成功偶联荧光素，且与抗体结合形成了大分子抗原抗体复合物，选择Rf值为0.94的分离物为甘胆酸示踪物，其结构式如式(Ⅰ)所示，其合成路线如图1所示(图1为甘胆酸示踪物的合成路线图)。
1.2甘胆酸示踪物工作溶液的确定
用浓度为4mmol/L、PH值为8.5的硼酸盐缓冲液将所得甘胆酸示踪物稀释成如下系列稀释度的供试溶液：1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000、1∶32000和1∶640000；检测并记录各供试溶液的偏振光强度。以硼酸盐缓冲液为空白溶液并进行荧光偏振光检测，获得空白溶液的偏振光强度。选择偏振光强度为空白溶液偏振光强度12倍的标记物供试液的稀释度为甘胆酸示踪物工作溶液的稀释度，所得稀释度为1∶16000，选择该稀释度的供试溶液为甘胆酸示踪物工作溶液。
1.3甘胆酸多克隆抗体的制备
(1)免疫抗原的制备：
称取25mg甘胆酸、20mg NHS、30mgDCC混合，于4℃下搅拌过夜，然后在10000rpm速度下离心分离10min，取上清液；将所得上清液加入5mL含有120mg牛血清蛋白的PBS缓冲液中，于4℃搅拌反应12小时，得到反应液；将所得反应液再次离心，取上清液置于透析袋中，在4℃下用PBS缓冲液透析三天，每隔12小时换一次透析液，即得免疫抗原。
(2)抗体的制备：
提供2只新西兰大白兔，雌性，月龄3个月，体重1.5～2.5公斤，饲养在标准动物房内，连续观察一周，确定其状态良好后，开始进行免疫。
用浓度为0.01mol/L，PH值为7.4的PBS缓冲液将所得免疫抗原配制成1mg/mL的免疫抗原溶液；将1mL免疫抗原溶液与弗氏完全佐剂等体积混合乳化，得到乳液Ⅰ；将1mL免疫抗原溶液与弗氏不完全佐剂等体积混合乳化，得到乳液Ⅱ；采用皮下多点注射的免疫方式对每只兔子注射2mL乳液Ⅰ，即首次免疫；首次免疫两周后，采用皮下多点注射的免疫方式对每只兔子注射2mL乳液Ⅱ，即首次加强免疫；之后，每隔两周进行一次加强免疫，共加强免疫四次，于最后一次加强免疫一周后对兔子耳部静脉取血，将收集到的血液置于4℃下以10000r/min的离心速度离心分离，取上清液，即为甘胆酸多克隆抗体，于-20℃下保存备用。
1.4甘胆酸多克隆抗体工作溶液的确定
用浓度为4mmol/L、PH值为8.5的硼酸盐缓冲液将所得甘胆酸多克隆抗体稀释成如下系列稀释度的抗体供试液：1∶222、1∶250、1∶285、1∶333、1∶400、1∶500、1∶1000和1∶2000；取上述各稀释度下的抗体供试液0.5mL分别置于8个试管中，再向每个试管中分别加入0.5mL甘胆酸示踪物工作溶液进行混合，常温下孵育10min，分别进行荧光偏振光检测，获得系列偏振光强度。以系列抗体供试液的稀释度为横坐标，以所得系列偏振光强度为纵坐标，绘制抗体供试液曲线，如图2所示。选择所得曲线中最大偏振光强度的70％为标准偏振值，该值所对应的抗体供试液的稀释度为1∶1000，以该稀释度下的抗体供试液为甘胆酸多克隆抗体工作溶液。
1.5甘胆酸标准曲线的建立
将1mg甘胆酸溶于1mL PBS缓冲液中做贮存液(浓度为1mg/mL)；用浓度为0.01mol/L、PH为7.4的PBS缓冲液将上述贮存液配制成如下系列浓度的甘胆酸标准液：106ng/mL、105ng/mL、104ng/mL、103ng/mL、500ng/mL、100ng/mL、10ng/mL、1ng/mL。所得标准液避光保存，每次使用前摇匀3min。
取上述各浓度的甘胆酸标准液50μL分别置于8个试管中，再向每个试管中分别加入0.5mL甘胆酸示踪物工作溶液和0.5mL多克隆抗体工作溶液，充分混匀，于常温下孵育10min，分别检测8个混合样的偏振光强度mP。
取50μL未引入甘胆酸的PBS缓冲液、0.5mL甘胆酸示踪物工作溶液和0.5mL甘胆酸多克隆抗体工作溶液充分混匀，于常温下孵育10min，检测器偏振光强度mP0。
以甘胆酸标准液的系列浓度为横坐标，以mP/mP0的比值为纵坐标，绘制甘胆酸标准曲线，如图3所示。由图3可以看出，甘胆酸浓度与荧光偏振值之间存在良好的线性关系且重复性好，决定系数R2可达0.9981；最低检测限为8.63ng/mL，具有高灵敏度；且具有较宽的线性范围，为35.94～2598.9ng/mL，IC50＝305.62ng/mL。
实施例2尿液中甘胆酸的测定及检测方法精密度的考察
将医院收集的某晨尿在4℃下以2000rpm的离心速度离心分离10min，取上清液，用PBS缓冲液稀释10倍后，得到尿液待测样。取50μL尿液待测样、0.5mL甘胆酸示踪物工作溶液和0.5mL甘胆酸多克隆抗体工作溶液充分混合，室温孵育10min，测试其荧光偏振值。将所得荧光偏振值与甘胆酸标准曲线比对，得到血清待测样中甘胆酸的浓度。
对上述尿液待测样重复检测6次，其检测结果和相对标准偏差参见表1。
表1重复测定6次的检测结果及偏差
由以上测试结果可知，本发明的检测方法连续重复测定6次待测样所得检测结果的相对标准偏差不超过2.5％，表明本发明的检测方法具有良好的精密度。
实施例3
加标回收试验：将医院取得的3份晨尿以2000rpm离心10min，取上清液，并用PBS缓冲液稀释10倍后，得到3份尿液试样(分别为1，2，3)；每份尿液试样平行设置3个子样，均为0.5mL，向3个子样中分别加入0.5mL浓度为50ng/mL(记为a)、250ng/mL(记为b)、500ng/mL(记为c)的甘胆酸标准液，即基于每份尿液试样，形成3个加标试样(如1a、1b、1c)，共形成9个加标试样。
按照实施例1的检测方法分别检测3份试样和9个加标试样中的甘胆酸浓度，并计算加标回收率和偏差，每个样品重复测试3次取平均值，结果参见表2。
表2加标回收测试结果
其中，回收率＝(加标试样测定值－试样测定值)÷标准液理论值×100％；
偏差CV＝(相对偏差÷平均值)×100％。
由表1测试结果可以看出，加标回收率在93.1％～118.7％之间，平均回收率为102.5％，本发明的检测方法具有高准确度。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种定量测定尿液中甘胆酸的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)将尿液待测样、甘胆酸示踪物工作溶液和甘胆酸多克隆抗体工作溶液混合、孵育，得到检测样；
其中，甘胆酸示踪物具有式(Ⅰ)所示结构：
甘胆酸多克隆抗体是由甘胆酸与牛血清蛋白偶联所得的免疫抗原免疫兔子后所得的抗血清；
b)对所述检测样进行荧光偏振光检测，获得偏振光强度；
c)根据所述偏振光强度与预定的甘胆酸标准曲线，得到尿液待测样中甘胆酸的浓度。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤a)中，甘胆酸示踪物工作溶液为以硼酸盐缓冲液为稀释剂，将甘胆酸示踪物稀释到一定稀释度的稀释液；
所述甘胆酸示踪物工作溶液的稀释度为1∶16000；
所述甘胆酸多克隆抗体工作溶液为以硼酸盐缓冲液为稀释剂，将甘胆酸多克隆抗体稀释到一定稀释度的稀释液；
所述甘胆酸多克隆抗体工作溶液的稀释度为1∶1000。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述步骤c)中，预设的甘胆酸标准曲线通过以下方式获得：
用PBS缓冲液将甘胆酸配制成系列浓度的甘胆酸标准液；
对所述系列浓度的甘胆酸标准液、甘胆酸示踪物工作溶液与甘胆酸多克隆抗体工作溶液经混合孵育所得的系列总混合液进行荧光偏振光检测，获得系列总混合液的系列偏振光强度mP；
对PBS缓冲液、甘胆酸示踪物工作溶液与甘胆酸多克隆抗体工作溶液经混合孵育所得的总空白液进行荧光偏振光检测，获得总空白液的偏振光强度mP0；
根据mP/mP0的比值和相应的甘胆酸标准液的浓度，获得甘胆酸标准曲线。
4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述甘胆酸示踪物工作溶液中，硼酸盐缓冲液的浓度为1～8mmol/L，PH值为7.0～8.5；
所述甘胆酸多克隆抗体工作溶液中，硼酸盐缓冲液的浓度为1～8mmol/L，PH值为7.0～8.5。
5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述PBS缓冲液的浓度为0.01mol/L，PH值为7.4。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤a)中，尿液待测样、甘胆酸示踪物工作溶液和甘胆酸多克隆抗体工作溶液的体积比为1：10：10。
7.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述系列浓度的甘胆酸标准液、甘胆酸示踪物工作溶液与甘胆酸多克隆抗体工作溶液混合孵育时，甘胆酸标准液、甘胆酸示踪物工作溶液与甘胆酸多克隆抗体工作溶液的体积比为1：10：10；
PBS缓冲液、甘胆酸示踪物工作溶液与甘胆酸多克隆抗体工作溶液混合孵育时，PBS缓冲液、甘胆酸示踪物工作溶液与甘胆酸多克隆抗体工作溶液的体积比为1：10：10。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述甘胆酸示踪物通过以下方式获得：
将甘胆酸、N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基二亚胺溶于二甲基甲酰胺中，形成混合液；
将所述混合液与4-胺甲基荧光素混合反应，得到反应液；
以体积比为4∶1的氯仿与甲醇的混合物为层析液，采用TLC薄层色谱纯化方法对所得反应液进行薄层层析和分离提纯，得到甘胆酸示踪物。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，在采用TLC薄层色谱纯化方法对所得反应液进行薄层层析和分离提纯后，用甲醇萃取，得到具有不同Rf值的分离物，选择Rf值为0.94的分离物为甘胆酸示踪物。
10.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述步骤a)中，甘胆酸示踪物工作溶液的稀释度通过以下方式获得：
用硼酸盐缓冲液将所述甘胆酸示踪物稀释成系列稀释度的示踪物供试液并进行荧光偏振光检测，获得系列稀释度的示踪物供试液的偏振光强度；
以硼酸盐缓冲液为空白溶液并进行荧光偏振光检测，获得空白溶液的偏振光强度；
选择偏振光强度为空白溶液偏振光强度10～15倍的示踪物供试液的稀释度为甘胆酸示踪物工作溶液的稀释度；
所述甘胆酸多克隆抗体工作溶液的稀释度通过以下方式获得：
用硼酸盐缓冲液将甘胆酸多克隆抗体稀释成系列稀释度的抗体供试液，分别与所述甘胆酸示踪物工作溶液混合、孵育，得到系列抗体-标记物混合液；
分别对所述系列抗体-标记物混合液进行荧光偏振光检测，获得系列抗体-标记物混合液的偏振光强度；
根据系列抗体-标记物混合液的偏振光强度和相应的抗体供试液的稀释度，获得抗体供试液曲线；
选择抗体供试液曲线中最大偏振光强度的70％为标准偏振值，以所述标准偏振值所对应的稀释度为甘胆酸多克隆抗体工作溶液的稀释度。
CN201710581071.9A 2017-07-17 2017-07-17 一种定量测定尿液中甘胆酸的检测方法 Pending CN107389637A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710581071.9A CN107389637A (zh) 2017-07-17 2017-07-17 一种定量测定尿液中甘胆酸的检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710581071.9A CN107389637A (zh) 2017-07-17 2017-07-17 一种定量测定尿液中甘胆酸的检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107389637A true CN107389637A (zh) 2017-11-24

Family

ID=60340303

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710581071.9A Pending CN107389637A (zh) 2017-07-17 2017-07-17 一种定量测定尿液中甘胆酸的检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107389637A (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102944673B (zh) * 2012-11-30 2014-11-12 北京华宇亿康生物工程技术有限公司 一种用于检测血清中甘胆酸含量的试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)
CN105132521A (zh) * 2015-09-14 2015-12-09 绍兴圣康生物科技有限公司 一种甘胆酸测定试剂盒及其使用方法
CN105352930A (zh) * 2015-12-01 2016-02-24 深圳市绿诗源生物技术有限公司 基于amf为荧光素标记物的双酚a荧光偏振免疫分析检测方法
CN105481977A (zh) * 2015-10-30 2016-04-13 北京华信缘生物技术有限公司 一种基于抗甘胆酸特异性抗体的甘胆酸的免疫检测试剂及其制备方法
CN106018787A (zh) * 2016-03-31 2016-10-12 广东工业大学 一种检测甘胆酸的荧光增强免疫分析方法及免疫试剂盒
CN106366193A (zh) * 2016-08-25 2017-02-01 广东工业大学 一种以胆酸为原料制备甘氨胆酸多克隆抗体的方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102944673B (zh) * 2012-11-30 2014-11-12 北京华宇亿康生物工程技术有限公司 一种用于检测血清中甘胆酸含量的试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)
CN105132521A (zh) * 2015-09-14 2015-12-09 绍兴圣康生物科技有限公司 一种甘胆酸测定试剂盒及其使用方法
CN105481977A (zh) * 2015-10-30 2016-04-13 北京华信缘生物技术有限公司 一种基于抗甘胆酸特异性抗体的甘胆酸的免疫检测试剂及其制备方法
CN105352930A (zh) * 2015-12-01 2016-02-24 深圳市绿诗源生物技术有限公司 基于amf为荧光素标记物的双酚a荧光偏振免疫分析检测方法
CN106018787A (zh) * 2016-03-31 2016-10-12 广东工业大学 一种检测甘胆酸的荧光增强免疫分析方法及免疫试剂盒
CN106366193A (zh) * 2016-08-25 2017-02-01 广东工业大学 一种以胆酸为原料制备甘氨胆酸多克隆抗体的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
沈定 等: "甘胆酸人工抗原合成及荧光偏振免疫分析方法研究", 《中国化学会第十九届全国有机分析及生物分析学术研讨会论文汇编》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11959912B2 (en) Fluorescence immunochromatographic detection card and a preparation method therefor and use thereof
BINDSCHADLER et al. Serology of human cryptococcosis
CN107942069A (zh) 一种ngal胶乳免疫比浊法检测试剂盒及其制备方法
CN107102135A (zh) 用于减少非特异性结合的免疫检验方法和试剂
CA1146852A (en) Reagent for latex agglutination
CN107056891A (zh) 一组用于制备系统性红斑狼疮诊断产品的多肽及其应用
Ajdukiewicz et al. Immunological studies in an epidemic of infective, short-incubation hepatitis
CN107271682A (zh) 一种犬c反应蛋白荧光检测试纸条
CN107389637A (zh) 一种定量测定尿液中甘胆酸的检测方法
CN107014992B (zh) 一种定量检测人血型抗体浓度方法的建立
CN107247044A (zh) 一种定量测定血清中甘胆酸的检测方法
Catlin Urine testing: A comparison of five current methods for detecting morphine
Chin et al. Heterophile antibody interference with thyroid assay
CN106018787B (zh) 一种检测甘胆酸的荧光增强免疫分析方法及免疫试剂盒
Stamm et al. Evaluation of a latex agglutination test for amoebiasis
RU2473908C2 (ru) Способ количественного определения специфических иммуноглобулинов g к конъюгату формальдегид - сывороточный человеческий альбумин в сыворотке крови
JP2000055917A (ja) 抗抗原−抗体複合体抗体を用いた検出または測定方法
CN105652006A (zh) 梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方法
Janek et al. Validation of a new panel of automated chemiluminescence assays for anticardiolipin antibodies in the screening for antiphospholipid syndrome
Amadori et al. Identification of IgG-immunocomplex macroprolactin with an immunometric “sandwich” system: technical and clinical considerations
JPH0611507A (ja) ヒトポドカリキシンの測定方法
CN202870098U (zh) 肺炎衣原体IgM抗体胶体金法检测试剂盒
CN112782404B (zh) 基于荧光免疫检测方法的多重生物标志物检测试剂盒
Mansour et al. Qualitative and semi-quantitative comparison of an rK39 strip test and direct agglutination test for detection of anti-Leishmania donovani antibodies in the Sudan
Chen et al. No difference of accuracy between capillary and venous blood in rapid whole blood test for diagnosis of Helicobacter pylori infection

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20200520

Address after: 510515 room 729, No. 613, North Guangzhou Avenue, Tianhe District, Guangzhou City, Guangdong Province

Applicant after: Guangdong Nanyue Pharmaceutical Co., Ltd

Address before: 510062, No. 729, Dongfeng East Road, Guangzhou, Guangdong, Yuexiu District

Applicant before: GUANGDONG UNIVERSITY OF TECHNOLOGY

TA01 Transfer of patent application right
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20171124

RJ01 Rejection of invention patent application after publication