CN107247044A - 一种定量测定血清中甘胆酸的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种定量测定血清中甘胆酸的检测方法，包括：将血清待测样、甘胆酸荧光标记物工作溶液和甘胆酸多克隆抗体工作溶液混合、孵育，得到检测样；对所述检测样进行荧光偏振光检测，获得偏振光强度；根据所述偏振光强度与预设的甘胆酸标准曲线，得到血清待测样中甘胆酸的浓度。本发明提供的检测方法能够简便快捷、准确的测定血清中甘胆酸的浓度；而且，采用本发明检测方法进行实时检测时，在线检测干扰因素少、线性范围宽、灵敏度高。实验结果表明，本发明提供的检测方法的线性范围为884.49～7655.74ng/mL，决定系数R²＝0.9992，IC₅₀＝2602.20ng/mL，最低检测限为480.28ng/mL，其线性范围宽，检出限低，灵敏度高。

Description

一种定量测定血清中甘胆酸的检测方法

技术领域

本发明涉及检测分析技术领域，特别涉及一种定量测定血清中甘胆酸的检测方法。

背景技术

甘胆酸(cholyglycine，简称CG)，别名N-(3,7,12-三羟基-24-羰基胆烷-24-基)-甘氨酸，是胆酸与甘氨酸结合而成的结合型胆酸之一。甘胆酸是由肝细胞合成，同胆汁进入肠道，经门静脉再回到肝脏；当肝细胞受损时，肝细胞摄取甘胆酸的能力下降，致使血液中甘胆酸含量增加，因此，测定甘胆酸含量可以作为评价肝细胞功能及肝胆系统物质循环功能的敏感指标之一，也是肝病患者肝功能受损程度及肝病治疗恢复效果评价的灵敏度及特异性较好的指标之一。

目前，我国乙型肝炎病毒感染者较多，临床上各类肝炎患者的数量巨大，乙型肝炎病毒感染者治疗不当可能会引起肝硬化等疾病，而甘胆酸含量的测定是诊断乙型肝炎病毒感染和肝硬化的一个重要依据。而且，肝硬化患者血清中甘胆酸(CG)含量与肝硬化代偿期分级呈显著正相关，CG含量指标在判断肝硬化进展及预后方面优于GGT(谷氨酰转肽酶)、AFP(甲胎蛋白)、AST(谷草转氨酶)、ALT(谷丙转氨酶)和血液ALB(白蛋白)含量指标，因此，CG含量测定对肝硬化预后评估价值较大。

近年来，常用的体外定量测定甘胆酸的方法主要有放射免疫法(RIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、化学发光免疫法(CL)等。虽然这些方法准确度高、重复性好，但是其同时还均存在较多缺陷，如酶联免疫吸附法操作繁琐、耗时较长，不利于常规实验室开展，临床应用局限性明显；化学发光免疫法需要借助于复杂的仪器设备，价格昂贵，不利于推广使用；放射免疫法存在放射性污染、有效期较短且操作极为不便。因此，建立一种操作简单快捷、成本低廉的定量测定甘胆酸的检测分析方法对于临床中相关疾病的诊断及监控具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种定量测定血清中甘胆酸的检测方法，本发明提供的检测方法能够简便快捷、准确的定量测定血清中的甘胆酸。

本发明提供了一种定量测定血清中甘胆酸的检测方法，包括以下步骤：

a)将血清待测样、甘胆酸荧光标记物工作溶液和甘胆酸多克隆抗体工作溶液混合、孵育，得到检测样；

其中，甘胆酸荧光标记物由甘胆酸衍生物与4-胺甲基荧光素经偶联反应形成；

所述甘胆酸衍生物具有式(Ⅰ)所示结构：

所述甘胆酸荧光标记物具有式(Ⅱ)所示结构：

甘胆酸多克隆抗体是由所述甘胆酸衍生物与牛血清蛋白偶联所得的免疫抗原免疫兔子后所得的抗血清；

b)对所述检测样进行荧光偏振光检测，获得偏振光强度；

c)根据所述偏振光强度与预设的甘胆酸标准曲线，得到血清待测样中甘胆酸的浓度。

优选的，所述步骤a)中，甘胆酸荧光标记物工作溶液为以硼酸盐缓冲液为稀释剂，将甘胆酸荧光标记物稀释到一定稀释度的稀释液；

所述甘胆酸荧光标记物工作溶液的稀释度为1∶6500；

所述甘胆酸多克隆抗体工作溶液为以硼酸盐缓冲液为稀释剂，将甘胆酸多克隆抗体稀释到一定稀释度的稀释液；

所述甘胆酸多克隆抗体工作溶液的稀释度为1∶750。

优选的，所述步骤c)中，预设的甘胆酸标准曲线通过以下方式获得：

用PBS缓冲液将甘胆酸配制成系列浓度的甘胆酸标准液；

对所述系列浓度的甘胆酸标准液、甘胆酸荧光标记物工作溶液与甘胆酸多克隆抗体工作溶液经混合孵育所得的系列总混合液进行荧光偏振光检测，获得系列总混合液的系列偏振光强度mP；

对PBS缓冲液、甘胆酸荧光标记物工作溶液与甘胆酸多克隆抗体工作溶液经混合孵育所得的总空白液进行荧光偏振光检测，获得总空白液的偏振光强度mP₀；

根据mP/mP₀的比值和相应的甘胆酸标准液的浓度，获得甘胆酸标准曲线。

优选的，所述甘胆酸荧光标记物工作溶液中，硼酸盐缓冲液的浓度为1～8mmol/L，PH值为7.0～8.5；

所述甘胆酸多克隆抗体工作溶液中，硼酸盐缓冲液的浓度为1～8mmol/L，PH值为7.0～8.5。

优选的，所述PBS缓冲液的浓度为0.01mol/L，PH值为7.4。

优选的，所述步骤a)中，血清待测样、甘胆酸荧光标记物工作溶液和甘胆酸多克隆抗体工作溶液的体积比为1：10：10。

优选的，所述系列浓度的甘胆酸标准液、甘胆酸荧光标记物工作溶液与甘胆酸多克隆抗体工作溶液混合孵育时，甘胆酸标准液、甘胆酸荧光标记物工作溶液与甘胆酸多克隆抗体工作溶液的体积比为1：10：10；

PBS缓冲液、甘胆酸荧光标记物工作溶液与甘胆酸多克隆抗体工作溶液混合孵育时，PBS缓冲液、甘胆酸荧光标记物工作溶液与甘胆酸多克隆抗体工作溶液的体积比为1：10：10。

优选的，所述甘胆酸荧光标记物通过以下方式获得：

将所述甘胆酸衍生物、N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基二亚胺溶于二甲基甲酰胺中，形成混合液；

将所述混合液与4-胺甲基荧光素混合反应，得到反应液；

第一次以体积比为4∶1的CHCl₃和CH₃OH的混合物为展开剂，第二次以CH₂Cl₂为展开剂，采用TLC薄层色谱纯化方法对所得反应液进行两次薄层层析和分离提纯，得到甘胆酸荧光标记物。

优选的，在采用TLC薄层色谱纯化方法对所得反应液进行薄层层析和分离提纯后，用甲醇萃取，得到具有不同Rf值的分离物，选择Rf值为0.47的分离物为甘胆酸荧光标记物。

优选的，所述步骤a)中，甘胆酸荧光标记物工作溶液的稀释度通过以下方式获得：

用硼酸盐缓冲液将所述甘胆酸荧光标记物稀释成系列稀释度的标记物供试液并进行荧光偏振光检测，获得系列稀释度的标记物供试液的偏振光强度；

以硼酸盐缓冲液为空白溶液并进行荧光偏振光检测，获得空白溶液的偏振光强度；

选择偏振光强度为空白溶液偏振光强度10～15倍的标记物供试液的稀释度为甘胆酸荧光标记物工作溶液的稀释度；

所述甘胆酸多克隆抗体工作溶液的稀释度通过以下方式获得：

用硼酸盐缓冲液将甘胆酸多克隆抗体稀释成系列稀释度的抗体供试液，分别与所述甘胆酸荧光标记物工作溶液混合、孵育，得到系列抗体-标记物混合液；

分别对所述系列抗体-标记物混合液进行荧光偏振光检测，获得系列抗体-标记物混合液的偏振光强度；

根据系列抗体-标记物混合液的偏振光强度和相应的抗体供试液的稀释度，获得抗体供试液曲线；

选择抗体供试液曲线中最大偏振光强度的70％为标准偏振值，以所述标准偏振值所对应的稀释度为甘胆酸多克隆抗体工作溶液的稀释度。

本发明提供了一种定量测定血清中甘胆酸的检测方法，a)将血清待测样、甘胆酸荧光标记物工作溶液和甘胆酸多克隆抗体工作溶液混合、孵育，得到检测样；其中，甘胆酸荧光标记物由甘胆酸衍生物与4-胺甲基荧光素经偶联反应形成；所述甘胆酸衍生物具有式(Ⅰ)所示结构；所述甘胆酸荧光标记物具有式(Ⅱ)所示结构；甘胆酸多克隆抗体是由所述甘胆酸衍生物与牛血清蛋白偶联所得的免疫抗原免疫兔子后所得的抗血清；b)对所述检测样进行荧光偏振光检测，获得偏振光强度；c)根据所述偏振光强度与预设的甘胆酸标准曲线，得到血清待测样中甘胆酸的浓度。本发明提供的检测方法能够简便快捷、准确的测定血清中甘胆酸的浓度；而且，采用本发明检测方法进行实时检测时，在线检测干扰因素少、线性范围宽、灵敏度高。实验结果表明，本发明提供的检测方法的线性范围为884.49～7655.74ng/mL，决定系数R²＝0.9992，IC₅₀＝2602.20ng/mL，最低检测限为480.28ng/mL，其线性范围宽，检出限低，灵敏度高；而且交叉反应率低、特异性高；且其准确度高；同时，本发明的检测方法简便易行，无需复杂昂贵的设备，是一种易于高通量检测且低成本的检测方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为实施例1中不同Rf值的分离物在加入抗体前后的荧光偏振检测结果图；

图2为实施例1中抗体供试液曲线图；

图3为实施例1中甘胆酸标准曲线图；

图4为实施例3中两种检测方法的效果对比图；

图5为实施例4中不同人群血清中甘胆酸含量的测试对比图。

具体实施方式

本发明提供了一种定量测定血清中甘胆酸的检测方法，包括以下步骤：

a)将血清待测样、甘胆酸荧光标记物工作溶液和甘胆酸多克隆抗体工作溶液混合、孵育，得到检测样；

其中，甘胆酸荧光标记物由甘胆酸衍生物与4-胺甲基荧光素经偶联反应形成；

所述甘胆酸衍生物具有式(Ⅰ)所示结构：

所述甘胆酸荧光标记物具有式(Ⅱ)所示结构：

甘胆酸多克隆抗体是由所述甘胆酸衍生物与牛血清蛋白偶联所得的免疫抗原免疫兔子后所得的抗血清；

b)对所述检测样进行荧光偏振光检测，获得偏振光强度；

c)根据所述偏振光强度与预设的甘胆酸标准曲线，得到血清待测样中甘胆酸的浓度。

采用本发明提供的检测方法能够简便快捷、准确的测定血清中甘胆酸的浓度；而且，采用本发明检测方法进行实时检测时，在线检测干扰因素少、线性范围宽、灵敏度高，是一种易于高通量检测且低成本的检测方法。

按照本发明，将血清待测样、甘胆酸荧光标记物工作溶液和甘胆酸多克隆抗体工作溶液混合、孵育，得到检测样。

血清可通过凝血后提取析出液或者离心等方式获得，本发明中，血清待测样优选通过离心血液的方式获得；在一些实施例中，可将抽取的血液在4℃及3000rpm下离心10min而获得血清待测样。

本发明中，甘胆酸荧光标记物工作溶液中的甘胆酸荧光标记物由甘胆酸衍生物与4-胺甲基荧光素(即AMF)经偶联反应形成；其中，甘胆酸衍生物具有式(Ⅰ)所示结构：

本发明中，所述式(Ⅰ)所示甘胆酸衍生物优选通过以下方式获得：在三乙胺和氯甲酸异丁酯的催化作用下，将溶于四氢呋喃的胆酸与4-氨基丁酸发生反应，得到甘胆酸衍生物。在一些实施例中，具体可通过以下方式获得：S1)将胆酸、三乙胺、氯甲酸异丁酯和四氢呋喃混合搅拌，得到澄清混合液；S2)将所述澄清混合液与4-氨基丁酸混合反应，得到反应混合物；S3)去除所述反应混合物中的四氢呋喃溶剂后，调整PH至酸性，再用乙酸乙酯萃取，之后进行分离提纯，获得式(Ⅰ)所示甘胆酸衍生物。

本发明中，甘胆酸荧光标记物由式(Ⅰ)所示的甘胆酸衍生物与4-胺甲基荧光素经偶联反应形成，所得甘胆酸荧光标记物具有式(Ⅱ)所示结构：

本发明中，所述式(Ⅱ)所示甘胆酸荧光标记物优选通过以下方式获得：

S1)将甘胆酸衍生物、N-羟基琥珀酰亚胺(即NHS)、二环己基碳二亚胺(即DCC)溶于二甲基甲酰胺(即DMF)中，形成混合液；

S2)将所述混合液与4-胺甲基荧光素(即AMF)混合反应，得到反应液；

S3)以体积比为4∶1∶4的CHCl₃、CH₃OH与CH₂Cl₂的混合物为展开剂，采用TLC薄层色谱纯化方法对所得反应液进行薄层层析和分离提纯，得到甘胆酸荧光标记物。

其中，步骤S1)中，甘胆酸衍生物、N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺的质量比优选为(1～5)∶(1～5)∶(1～10)。步骤S1)中的甘胆酸衍生物与步骤S2)中的4-胺甲基荧光素的质量比优选为(1～5)∶1。

本发明中，所述步骤S3)中利用TLC薄层色谱纯化方法进行薄层层析和分离提纯后，形成具有不同Rf值的条带，优选利用甲醇进行萃取溶解，得到具有不同Rf值的分离物，优选选择Rf值为0.47的分离物为甘胆酸荧光标记物。

TLC是一种薄层色谱纯化方法，将欲分离的样品点在薄层板上，利用适宜的展开剂或层析液展开，使样品中的成分得以分离，在薄层板上形成具有不同Rf值的条带。本发明的一些实施例中，第一次以体积比为4∶1的CHCl₃和CH₃OH的混合物为展开剂，第二次以CH₂Cl₂为展开剂，采用TLC薄层色谱纯化方法对所得反应液进行两次薄层层析和分离提纯，形成了Rf值分别为0.97、0.86和0.47的条带，利用甲醇萃取后，得到了Rf值分别为0.97、0.86和0.47的分离物，最终选择Rf值为0.47的分离物为甘胆酸荧光标记物。

本发明中，优选通过以下方式从不同Rf值的分离物中筛选合适的甘胆酸荧光标记物：将具有不同Rf值的分离物分别与甘胆酸多克隆抗体混合，并进行荧光偏振检测，选择荧光偏振值显著增加的体系中所对应的Rf值分离物作为甘胆酸荧光标记物。本发明通过标记物与抗体的结合测试来筛选甘胆酸荧光标记物，若标记物与抗体发生结合，会形成大分子抗原抗体复合物，体系的荧光偏振值显著增加，相反，若标记物与抗体不发生结合，则荧光偏振值变化不大，通过以上方式筛选出合适的甘胆酸荧光标记物。

本发明以式(Ⅰ)所示的甘胆酸衍生物为半抗原，并选择4-胺甲基荧光素与所述半抗原结合制备甘胆酸荧光标记物，能够使检测方法具有高灵敏度。

本发明中，在获得甘胆酸荧光标记物后，确定具有合适稀释度的甘胆酸荧光标记物工作溶液。

本发明中，所述甘胆酸荧光标记物工作溶液优选为以硼酸盐缓冲液为稀释剂，将甘胆酸荧光标记物稀释到一定稀释度的稀释液；所述甘胆酸荧光标记物工作溶液的稀释度优选为1∶6500。稀释度是指稀释前样品体积与稀释后样品体积的比例，如稀释度1∶10是指将1体积份的样品与稀释剂混合，使体积扩大至10体积份。

本发明中，所述甘胆酸荧光标记物工作溶液的稀释度优选通过以下方式获得：S1)用硼酸盐缓冲液将所述甘胆酸荧光标记物稀释成系列稀释度的标记物供试液并进行荧光偏振光检测，获得系列稀释度的标记物供试液的偏振光强度；S2)以硼酸盐缓冲液为空白溶液并进行荧光偏振光检测，获得空白溶液的偏振光强度；步骤S1)与步骤S2)没有顺序限制；S3)选择偏振光强度为空白溶液偏振光强度10～15倍的标记物供试液的稀释度为甘胆酸荧光标记物工作溶液的稀释度。在一些实施例中，所述系列稀释度的标记物供试液的稀释度可以分别为1∶3000、1∶4000、1∶5000、1∶6000、1∶6500和1∶7000；在一些实施例中，可以根据系列稀释度的标记物供试液的偏振光强度和标记物供试液的稀释度绘制标记物供试液曲线，将10～15倍于空白溶液偏振光强度的荧光偏振值与所得标记物供试液曲线比对，选择相应的稀释度为甘胆酸荧光标记物工作溶液的稀释度。在一些实施例中，选择偏振光强度为空白溶液偏振光强度11倍的标记物供试液的稀释度为甘胆酸荧光标记物工作溶液的稀释度。

本发明中，在稀释甘胆酸荧光标记物时，所用硼酸盐缓冲液稀释剂的浓度优选为1～8mmol/L，PH值优选为7.0～8.5。

本发明中，甘胆酸多克隆抗体工作溶液中的甘胆酸多克隆抗体是由所述式(Ⅰ)所示甘胆酸衍生物与牛血清蛋白偶联所得的免疫抗原免疫兔子后所得的抗血清。

其中，所述免疫抗原优选通过以下方式获得：

S1)将式(Ⅰ)所示甘胆酸衍生物、N,N-二甲基甲酰胺、三正丁胺和氯甲酸异丁酯混合，得到A液；

将碳酸盐缓冲液、N,N-二甲基甲酰胺和牛血清蛋白混合，得到B液；

S2)将A液与B液混合，搅拌过夜后，用磷酸盐缓冲液(即PBS缓冲液)透析，得到免疫抗原。

得到免疫抗原后，用所述免疫抗原免疫兔子制取甘胆酸多克隆抗体，其过程优选如下：

S1)用PBS缓冲液将所得免疫抗原配制成免疫抗原溶液；

将所述免疫抗原溶液与弗氏完全佐剂混合乳化，得到乳液Ⅰ；

将所述免疫抗原溶液与弗氏不完全佐剂混合乳化，得到乳液Ⅱ；

S2)采用皮下多点注射的免疫方式对兔子注射乳液Ⅰ，即首次免疫；首次免疫两周后，采用皮下多点注射的免疫方式对兔子注射乳液Ⅱ，即首次加强免疫；之后，每隔两周进行一次加强免疫，共加强免疫四次，于最后一次加强免疫一周后对兔子耳部静脉取血，将收集到的血液离心分离，取上清液，即为甘胆酸多克隆抗体。

在一些实施例中，用免疫抗原免疫兔子制取甘胆酸多克隆抗体的具体过程如下：用浓度为0.01mol/L、PH值为7.4的PBS缓冲液将所得免疫抗原配制成1mg/mL的免疫抗原溶液；将所述免疫抗原溶液与弗氏完全佐剂等体积混合乳化，得到乳液Ⅰ；将所述免疫抗原溶液与弗氏不完全佐剂等体积混合乳化，得到乳液Ⅱ；采用皮下多点注射的免疫方式对兔子注射2mL乳液Ⅰ，即首次免疫；首次免疫两周后，采用皮下多点注射的免疫方式对兔子注射2mL乳液Ⅱ，即首次加强免疫；之后，每隔两周进行一次加强免疫，共加强免疫四次，于最后一次加强免疫一周后对兔子耳部静脉取血，将收集到的血液于4℃下过夜后，再以10000r/min的离心速度离心分离10min，取上清液，即得甘胆酸多克隆抗体；所得甘胆酸多克隆抗体优选置于-20℃下保存备用。

本发明中，在获得甘胆酸多克隆抗体后，确定具有合适稀释度的甘胆酸多克隆抗体工作溶液。

本发明中，所述甘胆酸多克隆抗体工作溶液优选为以硼酸盐缓冲液为稀释剂，将甘胆酸多克隆抗体稀释到一定稀释度的稀释液；所述甘胆酸多克隆抗体工作溶液的稀释度优选为1∶750。

本发明中，所述甘胆酸多克隆抗体工作溶液的稀释度优选通过以下方式获得：S1)用硼酸盐缓冲液将甘胆酸多克隆抗体稀释成系列稀释度的抗体供试液，分别与所述甘胆酸荧光标记物工作溶液混合、孵育，得到系列抗体-标记物混合液；S2)分别对所述系列抗体-标记物混合液进行荧光偏振光检测，获得系列抗体-标记物混合液的偏振光强度；S3)根据系列抗体-标记物混合液的偏振光强度和相应的抗体供试液的稀释度，获得抗体供试液曲线；S4)选择抗体供试液曲线中最大偏振光强度的70％为标准偏振值，以所述标准偏振值所对应的稀释度为甘胆酸多克隆抗体工作溶液的稀释度。在一些实施例中，所述系列稀释度的抗体供试液的稀释度可以分别为1∶143、1∶167、1∶200、1∶250、1∶333、1∶500和1∶1000。本发明中，抗体供试液与甘胆酸荧光标记物工作溶液优选等体积混合；一些实施例中，二者的体积均为500μL。

本发明中，在稀释甘胆酸多克隆抗体时，所用硼酸盐缓冲液稀释剂的浓度优选为1～8mmol/L，PH值优选为7.0～8.5。

本发明中，采用所得稀释度的甘胆酸荧光标记物工作溶液和甘胆酸多克隆抗体工作溶液能够使检测方法准确、灵敏。

按照本发明，在获得血清待测样、甘胆酸荧光标记物工作溶液和甘胆酸多克隆抗体工作溶液后，将三者混合，得到检测样。本发明中，所述血清待测样、甘胆酸荧光标记物工作溶液和甘胆酸多克隆抗体工作溶液的体积比优选为1：10：10；在一些实施例中，具体可分别为50μL、500μL和500μL。

按照本发明，在获得检测样后，对所述检测样进行荧光偏振光检测，获得偏振光强度。所述荧光偏振光检测可借助荧光偏振光测试仪，经检测后，获得偏振光强度。

按照本发明，在获得检测样的偏振光强度后，根据所得偏振光强度与预设的甘胆酸标准曲线，得到血清待测样中甘胆酸的浓度。

本发明中，所述预设的甘胆酸标准曲线优选通过以下方式获得：

S1)用PBS缓冲液将甘胆酸配制成系列浓度的甘胆酸标准液；

S2)对所述系列浓度的甘胆酸标准液、甘胆酸荧光标记物工作溶液与甘胆酸多克隆抗体工作溶液经混合孵育所得的系列总混合液进行荧光偏振光检测，获得系列总混合液的系列偏振光强度mP；

S3)对PBS缓冲液、甘胆酸荧光标记物工作溶液与甘胆酸多克隆抗体工作溶液经混合孵育所得的总空白液进行荧光偏振光检测，获得总空白液的偏振光强度mP₀；

步骤S2)和步骤S3)没有顺序限制；

S4)根据mP/mP₀的比值和相应的甘胆酸标准液的浓度，获得甘胆酸标准曲线。

本发明中，所述步骤S1)中，PBS缓冲液的浓度优选为0.01mol/L，PH值优选为7.4。在一些实施例中，可利用PBS缓冲液将甘胆酸配制成如下系列浓的甘胆酸标准液：10⁶ng/mL、10⁵ng/mL、10⁴ng/mL、10³ng/mL、500ng/mL、100ng/mL、10ng/mL、1ng/mL。

在得到系列浓度的甘胆酸标准液后，将所述系列浓度的甘胆酸标准液、甘胆酸荧光标记物工作溶液与甘胆酸多克隆抗体工作溶液进行混合孵育，得到系列总混合液；对所得系列总混合液进行荧光偏振光检测，获得系列总混合液所对应的系列偏振光强度mP。其中，甘胆酸标准液、甘胆酸荧光标记物工作溶液与甘胆酸多克隆抗体工作溶液的体积比优选为1：10：10；在一些实施例中，可分别为50μL、500μL和500μL。本发明中，所述孵育的时间优选为1～10min。

本发明还将PBS缓冲液、甘胆酸荧光标记物工作溶液与甘胆酸多克隆抗体工作溶液进行混合孵育，得到总空白液；对所得总空白液进行荧光偏振光检测，获得总空白液的偏振光强度mP₀。本发明中，PBS缓冲液、甘胆酸荧光标记物工作溶液与甘胆酸多克隆抗体工作溶液的体积比优选为1∶10∶10；在一些实施例中，可分别为50μL、500μL和500μL。本发明中，所述孵育的时间优选为1～10min。

本发明中，获得mP与mP₀的顺序没有限制。

本发明中，获得mP与mP₀后，根据mP与mP₀的比值(即抑制率mP/mP₀)和相应的甘胆酸标准液的浓度，获得甘胆酸标准曲线。在一些实施例中，以mP/mP₀的比值为纵坐标，以每个mP所对应的甘胆酸标准液的浓度为横坐标，绘制得到甘胆酸标准曲线。

按照本发明，在获得甘胆酸标准曲线和检测样的偏振光强度后，根据二者的对应关系，即得检测样中血清待测样中甘胆酸的浓度。具体的，在获得检测样的偏振光强度mP_x后，将mP_x/mP₀的比值与甘胆酸标准曲线进行比对，吻合点对应的甘胆酸浓度即为血清待测样中甘胆酸的浓度。

本发明提供的检测方法能够简便快捷、准确的测定血清中甘胆酸的浓度；而且，采用本发明检测方法进行实时检测时，在线检测干扰因素少、线性范围宽、灵敏度高。实验结果表明，本发明提供的检测方法的线性范围为884.49～7655.74ng/mL，决定系数R²＝0.9992，IC₅₀＝2602.20ng/mL，最低检测限为480.28ng/mL，其线性范围宽，相关性和重复性好，检出限低，灵敏度高；而且交叉反应率低、特异性高；且其准确度高；同时，本发明的检测方法简便易行，无需复杂昂贵的设备，且检测快速便捷，在十几分钟甚至数分钟即可完成检测，是一种易于高通量检测且低成本的检测方法。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

实施例1

1.1甘胆酸荧光标记物的制备

(1)甘胆酸衍生物的制备：

称取1.5g胆酸加到烧瓶中，依次加入3ml无水四氢呋喃、509μL三乙胺和464μL氯甲酸异丁酯，室温搅拌30min，待溶液变澄清后，再加入379mg 4-氨基丁酸，继续室温搅拌反应3天；反应完成后，加入去离子水，减压旋转蒸发除去四氢呋喃，然后用盐酸调节溶液的PH至酸性，用乙酸乙酯进行萃取，收集乙酸乙酯层，减压旋转蒸发得到粗产品；再以二氯甲烷：甲醇：乙酸＝10:1:0.01的体积比的混合物为展开剂将上述粗产品通过硅胶柱进行分离提纯，得到式(Ⅰ)所示甘胆酸衍生物。

(2)荧光标记物的制备：

称取3mg所得甘胆酸衍生物、3mg NHS、5.4mg DCC溶于500μL DMF中，搅拌过夜，得到混合液；向200μL所述混合液中加入1mg AMF，震荡并常温避光搅拌3h，得到反应液；第一次以体积比为4∶1的CHCl₃和CH₃OH混合物为展开剂，第二次以CH₂Cl₂为展开剂，采用TLC薄层色谱纯化方法对所得反应液进行两次薄层层析和分离提纯，在紫外透射仪下观察，并用200μL甲醇萃取，得到Rf值分别为0.97、0.86和0.47的3种分离物。

(3)荧光标记物的筛选：

将所得3种分离物分别与甘胆酸多克隆抗体(制备方法参见下文1.3节)混合，在加入抗体前后，分别进行荧光偏振检测，检测结果如图1所示(图1为不同Rf值的分离物在加入抗体前后的荧光偏振检测结果图；每组柱形图中，左侧为加入抗体前的分离物空白样，右侧为加入抗体后的试样)。由图1可以看出，Rf值为0.47的分离物在加入抗体后，荧光偏振强度显著增加，说明其上成功偶联荧光素，且与抗体结合形成了大分子抗原抗体复合物，选择Rf值为0.47的分离物为甘胆酸荧光标记物，其结构式如式(Ⅱ)所示。

1.2甘胆酸荧光标记物工作溶液的确定

用浓度为4mmol/L、PH值为8.5的硼酸盐缓冲液将所得甘胆酸荧光标记物稀释成如下系列稀释度的供试溶液：1∶3000、1∶4000、1∶5000、1∶6000、1∶6500和1∶7000；检测并记录各供试溶液的偏振光强度。以硼酸盐缓冲液为空白溶液并进行荧光偏振光检测，获得空白溶液的偏振光强度。选择偏振光强度为空白溶液偏振光强度11倍的标记物供试液的稀释度为甘胆酸荧光标记物工作溶液的稀释度，所得稀释度为1∶6500，选择该稀释度的供试溶液为甘胆酸荧光标记物工作溶液。

1.3甘胆酸多克隆抗体的制备

(1)免疫抗原的制备：

称取10mg第1.1节所得甘胆酸衍生物溶于300μL N,N-二甲基甲酰胺中，再加入4.7μL三正丁胺和3.8μL氯甲酸异丁酯，得到A液；向2mL碳酸缓冲液中加入400μL N,N-二甲基甲酰胺和20mg牛血清蛋白，得到B液；将A液滴加到B液中，于4℃搅拌过夜后，将所得反应液放入透析袋中，在4℃下用PBS缓冲液透析三天，每天换三次透析液，得到免疫抗原。

(2)抗体的制备：

提供2只新西兰大白兔，雌性，月龄3个月，体重1.5～2公斤，饲养在标准动物房内，连续观察一周，确定其状态良好后，开始进行免疫。

用浓度为0.01mol/L，PH值为7.4的PBS缓冲液将所得免疫抗原配制成1mg/mL的免疫抗原溶液；将免疫抗原溶液与弗氏完全佐剂等体积混合乳化，得到乳液Ⅰ；将免疫抗原溶液与弗氏不完全佐剂等体积混合乳化，得到乳液Ⅱ；采用皮下多点注射的免疫方式对每只兔子注射2mL乳液Ⅰ，即首次免疫；首次免疫两周后，采用皮下多点注射的免疫方式对每只兔子注射2mL乳液Ⅱ，即首次加强免疫；之后，每隔两周进行一次加强免疫，共加强免疫四次，于最后一次加强免疫一周后对兔子耳部静脉取血，将收集到的血液置于4℃冰箱过夜，第二天以10000r/min的离心速度离心分离10min，取上清液，即为甘胆酸多克隆抗体，于-20℃下保存备用。

1.4甘胆酸多克隆抗体工作溶液的确定

用浓度为4mmol/L、PH值为8.5的硼酸盐缓冲液将所得甘胆酸多克隆抗体稀释成如下系列稀释度的抗体供试液：1∶143、1∶167、1∶200、1∶250、1∶333、1∶500和1∶1000；取上述各稀释度下的抗体供试液500μL分别置于7个试管中，再向每个试管中分别加入500μL甘胆酸荧光标记物工作溶液进行混合，常温下孵育1～10min，分别进行荧光偏振光检测，获得系列偏振光强度。以系列抗体供试液的稀释度为横坐标，以所得系列偏振光强度为纵坐标，绘制抗体供试液曲线，如图2所示。选择所得曲线中最大偏振光强度的70％为标准偏振值，该值所对应的抗体供试液的稀释度为1∶750，以该稀释度下的抗体供试液为甘胆酸多克隆抗体工作溶液。

1.5甘胆酸标准曲线的建立

将1mg甘胆酸溶于1mL PBS缓冲液中做贮存液(1mg/mL)；用浓度为0.01mol/L、PH为7.4的PBS缓冲液将上述贮存液配制成如下系列浓度的甘胆酸标准液：10⁶ng/mL、10⁵ng/mL、10⁴ng/mL、10³ng/mL、500ng/mL、100ng/mL、10ng/mL、1ng/mL。所得标准液避光保存，每次使用前摇匀3min。

取上述各浓度的甘胆酸标准液50μL分别置于8个试管中，再向每个试管中分别加入500μL甘胆酸荧光标记物工作溶液和500μL多克隆抗体工作溶液，充分混匀，于常温下孵育1～10min，分别检测8个混合样的偏振光强度mP。

取50μL未引入甘胆酸的PBS缓冲液、500μL甘胆酸荧光标记物工作溶液和500μL甘胆酸多克隆抗体工作溶液充分混匀，于常温下孵育1～10min，检测器偏振光强度mP₀。

以甘胆酸标准液的系列浓度为横坐标，以mP/mP₀的比值为纵坐标，绘制甘胆酸标准曲线，如图3所示。可以看出，甘胆酸浓度与荧光偏振值之间存在良好的线性关系且重复性好，决定系数R²可达0.9992；最低检测限为480.28ng/mL，具有高灵敏度；且具有较宽的线性范围，为884.49～7655.74ng/mL，IC₅₀＝2602.20ng/mL。

实施例2血清中甘胆酸的测定及检测方法精密度的考察

将医院收集的某血样在4℃下以3000rpm的离心速度离心分离10min，取上清液为血清待测样。取50μL血清待测样、500μL甘胆酸荧光标记物工作溶液和500μL甘胆酸多克隆抗体工作溶液充分混合，室温孵育1～10min，测试其荧光偏振值。将所得荧光偏振值与甘胆酸标准曲线比对，得到血清待测样中甘胆酸的浓度。

对上述血清待测样重复检测6次，其检测结果和相对标准偏差参见表1。

表1重复测定6次的检测结果及偏差

由以上测试结果可知，本发明的检测方法连续重复测定6次待测样所得检测结果的相对标准偏差不超过3％，表明本发明的检测方法具有良好的精密度。

实施例3

交叉反应性研究：选取9种甘胆酸类似物(即结构和功能与甘胆酸类似的物质)“胆酸、石胆酸、鹅去氧胆酸、甘氨鹅去养胆酸、牛黄胆酸、去氧胆酸、维生素D3、牛黄脱氧胆酸、猪去氧胆酸”作为研究对象，分别与上述甘胆酸多克隆抗体进行交叉反应。

对每种甘胆酸类似物，分别配制成如下系列浓度的供试溶液：10⁶ng/mL、10⁵ng/mL、10⁴ng/mL、10³ng/mL、500ng/mL、100ng/mL、10ng/mL、1ng/mL；分别与甘胆酸多克隆抗体进行交叉反应，获得抗体对各种甘胆酸类似物的IC₅₀′值，并与抗体对甘胆酸的IC₅₀值进行比较，获得交叉反应率CR(％)，CR＝IC₅₀/IC₅₀′；测试结果参见表2。

表2甘胆酸多克隆抗体与相关物质的交叉反应率测试结果

由以上测试结果可知，甘胆酸类似物的交叉反应率极低，基本无交叉反应，这些甘胆酸类似物对检测甘胆酸的干扰性极小，该检测方法特异性高。

实施例4

分别用实施例1的检测方法和现有技术中准确度较高的酶联免疫吸附法对同一批血清待测样进行检测，将本发明检测方法的检测结果(记为“方法1”)作为横坐标，酶联免疫吸附法的检测结果(记为“方法2”)作为纵坐标，利用Origin软件建立两种方法的对比图，结果如图4所示(图4为两种检测方法的效果对比图)。由图4可以看出，两种检测方法具有很好的相似性，进一步证明本发明的检测方法具有高准确度。

实施例5

采集一批健康人和肝炎患者的血样，在4℃下以3000rpm的离心速度离心分离10min，取上清液，得到血清；健康人血清用PBS缓冲液稀释5倍，肝炎患者血清用PBS缓冲液稀释10倍；稀释后的样品在沸水中煮5min，得到一批血清待测样。采用实施例1的检测方法检测该批血清待测样，结果参见图5(图5为不同人群血清中甘胆酸含量的测试对比图)。由图5可以看出，肝硬化患者血清中甘胆酸含量明显比健康人血清中甘胆酸含量高，进一步证明甘胆酸含量可以作为肝炎的临床检测指标。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种定量测定血清中甘胆酸的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)将血清待测样、甘胆酸荧光标记物工作溶液和甘胆酸多克隆抗体工作溶液混合、孵育，得到检测样；

其中，甘胆酸荧光标记物由甘胆酸衍生物与4-胺甲基荧光素经偶联反应形成；

所述甘胆酸衍生物具有式(Ⅰ)所示结构：

所述甘胆酸荧光标记物具有式(Ⅱ)所示结构：

甘胆酸多克隆抗体是由所述甘胆酸衍生物与牛血清蛋白偶联所得的免疫抗原免疫兔子后所得的抗血清；

b)对所述检测样进行荧光偏振光检测，获得偏振光强度；

c)根据所述偏振光强度与预设的甘胆酸标准曲线，得到血清待测样中甘胆酸的浓度。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤a)中，甘胆酸荧光标记物工作溶液为以硼酸盐缓冲液为稀释剂，将甘胆酸荧光标记物稀释到一定稀释度的稀释液；

所述甘胆酸荧光标记物工作溶液的稀释度为1∶6500；

所述甘胆酸多克隆抗体工作溶液为以硼酸盐缓冲液为稀释剂，将甘胆酸多克隆抗体稀释到一定稀释度的稀释液；

所述甘胆酸多克隆抗体工作溶液的稀释度为1∶750。

3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述步骤c)中，预设的甘胆酸标准曲线通过以下方式获得：

用PBS缓冲液将甘胆酸配制成系列浓度的甘胆酸标准液；

对所述系列浓度的甘胆酸标准液、甘胆酸荧光标记物工作溶液与甘胆酸多克隆抗体工作溶液经混合孵育所得的系列总混合液进行荧光偏振光检测，获得系列总混合液的系列偏振光强度mP；

对PBS缓冲液、甘胆酸荧光标记物工作溶液与甘胆酸多克隆抗体工作溶液经混合孵育所得的总空白液进行荧光偏振光检测，获得总空白液的偏振光强度mP₀；

根据mP/mP₀的比值和相应的甘胆酸标准液的浓度，获得甘胆酸标准曲线。

4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述甘胆酸荧光标记物工作溶液中，硼酸盐缓冲液的浓度为1～8mmol/L，PH值为7.0～8.5；

所述甘胆酸多克隆抗体工作溶液中，硼酸盐缓冲液的浓度为1～8mmol/L，PH值为7.0～8.5。

5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述PBS缓冲液的浓度为0.01mol/L，PH值为7.4。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤a)中，血清待测样、甘胆酸荧光标记物工作溶液和甘胆酸多克隆抗体工作溶液的体积比为1：10：10。

7.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述系列浓度的甘胆酸标准液、甘胆酸荧光标记物工作溶液与甘胆酸多克隆抗体工作溶液混合孵育时，甘胆酸标准液、甘胆酸荧光标记物工作溶液与甘胆酸多克隆抗体工作溶液的体积比为1：10：10；

PBS缓冲液、甘胆酸荧光标记物工作溶液与甘胆酸多克隆抗体工作溶液混合孵育时，PBS缓冲液、甘胆酸荧光标记物工作溶液与甘胆酸多克隆抗体工作溶液的体积比为1：10：10。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述甘胆酸荧光标记物通过以下方式获得：

将所述甘胆酸衍生物、N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基二亚胺溶于二甲基甲酰胺中，形成混合液；

将所述混合液与4-胺甲基荧光素混合反应，得到反应液；

第一次以体积比为4∶1的CHCl₃和CH₃OH的混合物为展开剂，第二次以CH₂Cl₂为展开剂，采用TLC薄层色谱纯化方法对所得反应液进行两次薄层层析和分离提纯，得到甘胆酸荧光标记物。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，在采用TLC薄层色谱纯化方法对所得反应液进行薄层层析和分离提纯后，用甲醇萃取，得到具有不同Rf值的分离物，选择Rf值为0.47的分离物为甘胆酸荧光标记物。

10.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述步骤a)中，甘胆酸荧光标记物工作溶液的稀释度通过以下方式获得：

用硼酸盐缓冲液将所述甘胆酸荧光标记物稀释成系列稀释度的标记物供试液并进行荧光偏振光检测，获得系列稀释度的标记物供试液的偏振光强度；

以硼酸盐缓冲液为空白溶液并进行荧光偏振光检测，获得空白溶液的偏振光强度；

选择偏振光强度为空白溶液偏振光强度10～15倍的标记物供试液的稀释度为甘胆酸荧光标记物工作溶液的稀释度；

所述甘胆酸多克隆抗体工作溶液的稀释度通过以下方式获得：

用硼酸盐缓冲液将甘胆酸多克隆抗体稀释成系列稀释度的抗体供试液，分别与所述甘胆酸荧光标记物工作溶液混合、孵育，得到系列抗体-标记物混合液；

分别对所述系列抗体-标记物混合液进行荧光偏振光检测，获得系列抗体-标记物混合液的偏振光强度；

根据系列抗体-标记物混合液的偏振光强度和相应的抗体供试液的稀释度，获得抗体供试液曲线；

选择抗体供试液曲线中最大偏振光强度的70％为标准偏振值，以所述标准偏振值所对应的稀释度为甘胆酸多克隆抗体工作溶液的稀释度。