CN105352930A - 基于amf为荧光素标记物的双酚a荧光偏振免疫分析检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于AMF为荧光素标记物的双酚A荧光偏振免疫分析检测方法，旨在提供一种具有较好的特异性和灵敏度的检测方法，该方法是利用双酚酸BVA作为半抗原偶联AMF荧光素合成得到荧光标记物，并以双酚A为标准品，用双酚A单克隆抗体作为抗体，建立双酚A的荧光偏振免疫分析检测方法该方法；属于荧光偏振免疫检测技术领域。

Description

基于AMF为荧光素标记物的双酚A荧光偏振免疫分析检测方法

技术领域

本发明公开了一种荧光偏振免疫分析检测方法，具体地说，是一种基于AMF为荧光素标记物的双酚A荧光偏振免疫分析检测方法；属于荧光偏振免疫检测技术领域。

背景技术

双酚A(BisphenolA,BPA),学名为2,2-二(4-羟基苯基)丙烷，是重要的有机化工原料之一，主要用于生产聚碳酸酯、不饱和聚酯树脂、环氧树脂聚苯醚树脂等高分子材料，适量添加双酚A能使塑料制品拥有轻巧、耐用等特性。因此，双酚A被广泛应用于饮料瓶、婴儿奶瓶、玩具、牙齿填充物等，在生产生活过程中双酚A在强酸、强碱或高温环境下，极易被释放出来进入水生环境中。研究发现垃圾堆中双酚A会从废弃塑料制品中释放出来，并随之进入生态环境中。人们可通过皮肤接触、呼吸道、消化道等途径摄入双酚A，双酚A在低剂量时即具有破坏人体内环境，对DNA以及肝肾细胞造成损伤，让人出现头昏、头痛、精神不安等身体不适。近年来，国内外非常重视对环境雌激素双酚A的检测，应用的较多为高效液相色谱法、荧光光度法、质谱联机法等仪器方法，仪器方法检测的灵敏度和精确性较好，但样品前处理过程复杂，且操作费时、分析成本高。目前，基于特异性抗原抗体结合的免疫分析方法成为研究的热点，因其具有操作简单快速、成本低廉同时具有较高的灵敏度，符合现场环境样本痕量监测的需要。荧光偏振免疫分析方法具有灵敏度高，适用范围广，不需样品前处理，快速得出分析结果等优点，适用于大量样本的快速筛选检测，目前没有基于双酚A单克隆抗体和4-胺甲基荧光素(AMF)为荧光素标记物的荧光偏振免疫分析方法的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以4-胺甲基荧光素AMF与半抗原偶联制得的荧光标记物的双酚A荧光偏振免疫检测方法，该方法具有较好的特异性和灵敏度。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是这样的：

一种基于AMF为荧光素标记物的双酚A荧光偏振免疫分析检测方法，该方法是利用双酚酸BVA作为半抗原偶联AMF荧光素合成得到荧光标记物，并以双酚A为标准品，用双酚A单克隆抗体作为抗体，建立双酚A的荧光偏振免疫分析检测方法。

进一步的，上述的基于AMF为荧光素标记物的双酚A荧光偏振免疫分析检测方法，该方法依次包括下述步骤：

1)AMF荧光素标记物的制备：

取双酚酸，N-羟基琥珀酰亚胺，二环己基碳二亚胺，溶解于N-N二甲基甲酰胺中，室温避光搅拌过夜；

向以上反应液中加入AMF荧光素，室温避光搅拌反应3小时，制得BVA-AMF荧光标记物；

其中：双酚酸、N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺与AMF荧光素质量比为：8-12﹕9-12﹕16-20﹕0.8-1.2；

2)AMF荧光标记物的纯化：

室温下进行薄层层析分离，分离纯化得到AMF荧光标记物，紫外透射仪下观察，选择二次分离纯化的R_f＝0.99的橙黄色条带，用甲醇洗脱萃取；

3)AMF荧光标记物工作浓度的确定

用0.025M、pH8.0的硼酸盐缓冲液稀释不同浓度的AMF标记物，取1mL稀释液放在试管中，充分混匀，用荧光偏振仪检测偏振光强度，以10倍空白溶液的偏振光强度作为其工作浓度，确定选取1﹕12500稀释度作为工作浓度，空白溶液选用0.025M、pH8.0的硼酸盐缓冲液；

4)双酚A单克隆抗体工作浓度的确定

首先在每个试管中加入500μL1﹕12500稀释度的AMF荧光标记物工作液，再分别于每个试管加入500μL不同稀释度的双酚A单克隆抗体稀释液，充分混匀，室温下孵育10min，用荧光偏振仪检测偏振光强度值，确定选取1:200稀释度作为抗体的工作浓度；

5)竞争试验

双酚A用10％PBS缓冲液稀释成0、3、10、30、100、300、1000、3000、10000ng/mL系列浓度，分别加入不同的试管中，每管20μL，然后向每管加入500μL稀释度为1:12500的AMF荧光标记物工作液，最后向每管分别加入500μL稀释为1:200的双酚A单克隆抗体工作液，充分混匀，于室温孵育10min，用荧光偏振仪检测偏振光强度值；

6)双酚A标准抑制曲线的绘制：

以抑制率mP/mPo为纵坐标，以双酚A浓度对数值为横坐标，作图建立双酚A的标准抑制对数曲线；

7)实际样品的检测：

以实际样品按照步骤5)的方法进行检测，测得的偏振光强度值为双酚A的标准抑制对数曲线对照，确定样品的双酚A残留量。

更进一步的，上述的基于AMF为荧光素标记物的双酚A荧光偏振免疫分析检测方法，所述薄层层析分离时的展开液为体积比4:1:0.1的CHCl₃-CH₃OH-CH₃COOH。

与现有的技术相比较，本发明提供的技术方案中AMF具有快速偶联半抗原，且荧光素不需要改性，本身含有的氨基具有与半抗原上已活化的羧基结合的能力，反应快速而有效。偶联得到的荧光标记物与抗体结合能力更强，具有较高的荧光信号，比普通的FITC衍生物偶联制备的BVA-EDF和BVA-lysFITC的荧光信号更强。

附图说明

图1是不同荧光标记物与双酚A单克隆抗体结合的能力；

图2是荧光偏振免疫分析法检测双酚A标准工作曲线；

图3是荧光偏振免疫分析法检测双酚A竞争抑制曲线；

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的权利要求做进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求范围内所做的有限次修改，仍在本发明的权利要求范围内。

实施例1

1、AMF荧光素标记物的制备

称量10.9mg双酚酸，10.4mgN-羟基琥珀酰亚胺NHS，18mg二环己基碳二亚胺DCC，溶解于1mL的N-N二甲基甲酰胺DMF中，室温避光搅拌过夜；

接着向以上反应液中加入1mgAMF荧光素，室温搅拌反应3小时，制得BVA-AMF荧光标记物。

2、AMF荧光标记物的纯化：

以CHCl₃：CH₃OH：CH₃COOH＝4:1:0.1为展开液，室温下进行薄层层析分离，分离纯化得到AMF荧光标记物，在紫外透射仪下观察，选择Rf＝0.99的橙黄色条带，用200μL甲醇洗脱萃取。

3、AMF荧光标记物工作浓度的确定：

用0.025M、pH8.0的硼酸盐缓冲液稀释不同浓度的AMF标记物，取1mL稀释液放在试管中，充分混匀，用荧光偏振仪检测偏振光强度，以10倍空白溶液的偏振光强度作为其工作浓度，确定选取1：12500稀释度作为工作浓度，空白溶液选用0.025M、pH8.0的硼酸盐缓冲液。

4、双酚A单克隆抗体工作浓度的确定：

首先在每个试管中加入500μL1：12500稀释度的AMF荧光标记物工作液，再分别于每个试管加入500μL不同稀释度的双酚A单克隆抗体稀释液，充分混匀，室温下孵育10min，用荧光偏振仪检测偏振光强度值，确定选取1:200稀释度作为抗体的工作浓度。

5、竞争试验：

双酚A用10％PBS缓冲液稀释成0,3,10,30,100,300,1000,3000,10000ng/mL系列浓度，分别加入不同的试管中，每管20μL，然后向每管加入500μL稀释度为1:12500的AMF荧光标记物工作液，最后向每管分别加入500μL稀释度为1:200的双酚A单克隆抗体工作液，充分混匀，于室温孵育10min，用荧光偏振仪检测偏振光强度值，参阅图1。

6、双酚A标准抑制曲线的绘制及检测限的确定：

以抑制率mP/mPo为纵坐标，双酚A浓度(ng/mL)为横坐标做标准曲线，其IC₅₀为140ng/mL,最低检测限为5.6ng/mL，参考图2。

7、双酚A荧光偏振免疫分析方法特异性的测定：

采用荧光偏振免疫分析方法测定双酚A结构类似物(双酚酸、苯酚、酚酞、对苯二酚、苯)与抗体做交叉反应，将0,3,10,30,100,300,1000,3000,10000ng/mL系列浓度类似物分别与抗体反应。利用单克隆抗体对双酚A的IC₅₀值与单克隆抗体对各类似物的IC₅₀值的比值得到交叉反应率(CR％)。结果表明，除了双酚酸半抗原外，几乎对各类似物无交叉反应，说明单克隆抗体对双酚A具有很高的特异性。

8、实际样品的检测：

以实际样品按照步骤(5)的方法进行检测，测得的偏振光强度值为双酚A的标准抑制对数曲线对照，确定样品的双酚A残留量。

本发明可用于珠江水、湖水、自来水和饮用水等双酚A残留的检测，向珠江水、湖水、自来水水样中添加10ng/mL，50ng/mL和100ng/mL的双酚A，重复三次，每次做三个平行，采用荧光偏振免疫分析方法测定mP/mPo，计算回收率，回收率在87.91％-114.28％之间，参阅图3。

Claims (3)

1.一种基于AMF为荧光素标记物的双酚A荧光偏振免疫分析检测方法，其特征在于，该方法是利用双酚酸BVA作为半抗原偶联AMF荧光素合成得到荧光标记物，并以双酚A为标准品，用双酚A单克隆抗体作为抗体，建立双酚A的荧光偏振免疫分析检测方法。

2.根据权利要求1所述的基于AMF为荧光素标记物的双酚A荧光偏振免疫分析检测方法，其特征在于，该方法依次包括下述步骤：

1)AMF荧光素标记物的制备：

取双酚酸，N-羟基琥珀酰亚胺，二环己基碳二亚胺，溶解于N-N二甲基甲酰胺中，室温避光搅拌过夜；

向以上反应液中加入AMF荧光素，室温避光搅拌反应3小时，制得BVA-AMF荧光标记物；

其中：双酚酸、N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺与AMF荧光素质量比为：8-12﹕9-12﹕16-20﹕0.8-1.2；

2)AMF荧光标记物的纯化：

室温下进行薄层层析分离，分离纯化得到AMF荧光标记物，紫外透射仪下观察，选择二次分离纯化的R_f＝0.99的橙黄色条带，用甲醇洗脱萃取；

3)AMF荧光标记物工作浓度的确定

用0.025M、pH8.0的硼酸盐缓冲液稀释不同浓度的AMF标记物，取1mL稀释液放在试管中，充分混匀，用荧光偏振仪检测偏振光强度，以10倍空白溶液的偏振光强度作为其工作浓度，确定选取1﹕12500稀释度作为工作浓度，空白溶液选用0.025M、pH8.0的硼酸盐缓冲液；

4)双酚A单克隆抗体工作浓度的确定

首先在每个试管中加入500μL1﹕12500稀释度的AMF荧光标记物工作液，再分别于每个试管加入500μL不同稀释度的双酚A单克隆抗体稀释液，充分混匀，室温下孵育10min，用荧光偏振仪检测偏振光强度值，确定选取1:200稀释度作为抗体的工作浓度；

5)竞争试验

双酚A用10％PBS缓冲液稀释成0、3、10、30、100、300、1000、3000、10000ng/mL系列浓度，分别加入不同的试管中，每管20μL，然后向每管加入500μL稀释度为1:12500的AMF荧光标记物工作液，最后向每管分别加入500μL稀释为1:200的双酚A单克隆抗体工作液，充分混匀，于室温孵育10min，用荧光偏振仪检测偏振光强度值；

6)双酚A标准抑制曲线的绘制：

以抑制率mP/mPo为纵坐标，以双酚A浓度对数值为横坐标，作图建立双酚A的标准抑制对数曲线；

7)实际样品的检测：

以实际样品按照步骤5)的方法进行检测，测得的偏振光强度值为双酚A的标准抑制对数曲线对照，确定样品的双酚A残留量。

3.根据权利要求1所述的基于AMF为荧光素标记物的双酚A荧光偏振免疫分析检测方法，其特征在于，所述薄层层析分离时的展开液为体积比4:1:0.1的CHCl₃-CH₃OH-CH₃COOH。