CN108362882A - 一种用于检测赭曲霉毒素的荧光偏振免疫分析方法 - Google Patents

一种用于检测赭曲霉毒素的荧光偏振免疫分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测赭曲霉毒素的荧光偏振免疫分析方法，包括以下步骤：S1、将一系列已知浓度的赭曲霉毒素标准品的溶液分别与荧光标记物溶液、赭曲霉毒素单克隆抗体溶液混合，孵育进行竞争反应，测定所得体系的荧光偏振值；S2、以测定的荧光偏振值为纵坐标，一系列已知浓度的赭曲霉毒素标准品的浓度为横坐标，绘制标准曲线；S3、以待测样品代替步骤S1中的赭曲霉毒素标准品，将待测样品与荧光标记物溶液以及赭曲霉毒素单克隆抗体溶液混合，孵育进行竞争反应，测定所得体系的荧光偏振值；S4、根据步骤S2中的标准曲线，计算出待测样品中赭曲霉毒素的浓度。本发明整个检测过程只需要一步竞争反应，操作简单、快速。

Description

一种用于检测赭曲霉毒素的荧光偏振免疫分析方法
技术领域
本发明涉及免疫分析技术和真菌毒素检测领域，具体涉及一种用于检测赭曲霉毒素的荧光偏振免疫分析方法。
背景技术
赭曲霉毒素(ochratoxin)主要是由赭曲霉属(Aspergillus ochraceus)和青霉属(Pecillium)真菌产生，主要分为赭曲霉毒素A、B、C三种类型。其中，赭曲霉毒素A毒性最大，广泛污染农产品和食品。因此其在动物体内容易蓄积，具有肾脏毒性、肝脏毒性、免疫毒性、细胞毒性、致畸、致癌等，被OARC列为2B类致癌物。GB2761-2011食品安全国家标准食品中明确规定了OTA在谷物及其制品中的最大残留限量(Maximum Residue Limit，MRL)为5ng/mL，豆类及其制品中为5ng/mL。
目前，赭曲霉毒素残留的检测方法主要有生物鉴定法、化学分析法和仪器分析法。其中仪器分析法主要为高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、高效液相色谱-质谱联用法等，由于其准确度高、重现性好多为国标所采用。但是需要依赖于昂贵的仪器设备，分析成本高且对检测环境和操作人员均有较高要求，难以满足现场快速检测需求。
发明内容
针对植物蛋白中赭曲霉毒素免疫检测技术中，假阳性高、灵敏度低等缺点，本发明提供了一种用于检测赭曲霉毒素的荧光偏振免疫分析方法，整个检测过程只需要一步竞争反应，操作简单、快速。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种用于检测赭曲霉毒素的荧光偏振免疫分析方法，包括以下步骤：
S1、将一系列已知浓度的赭曲霉毒素标准品的溶液分别与荧光标记物溶液以及赭曲霉毒素单克隆抗体溶液混合，孵育进行竞争反应，测定所得体系的荧光偏振值；
S2、以测定的荧光偏振值为纵坐标，所述一系列已知浓度的赭曲霉毒素标准品的浓度为横坐标，绘制标准曲线；
S3、以待测样品代替步骤S1中的赭曲霉毒素标准品，将所述待测样品与所述荧光标记物溶液以及所述赭曲霉毒素单克隆抗体溶液混合，孵育进行竞争反应，测定所得体系的荧光偏振值；
S4、根据步骤S2中的标准曲线，计算出所述待测样品中赭曲霉毒素的浓度。
优选地，所述步骤S21中的荧光标记物为改造后赭曲霉毒素半抗原(6-[[(1-naphthyloxy)carbonyl]amino]hexanoic acid，CNH)与荧光素的偶联物。
优选地，所述荧光素选自下述任意一种：4-氨甲基荧光素(AMF)，异硫氰酸荧光素乙二胺(EDF)，异硫氰酸荧光素丁二胺(BDF)，异硫氰酸荧光素己二胺(HDF)。
优选地，步骤S1中所述一系列已知浓度的赭曲霉毒素标准品的溶液的溶质为赭曲霉毒素标准品，浓度分别为0，0.01，0.03，0.1，0.3，1，10ng/mL，溶剂为含10％甲醇的硼酸盐缓冲液。
该硼酸盐缓冲液的pH值为8.5，通过以下步骤制备所得：
称取0.47mg Na2B4O7，0.05mg NaN3溶解于0.5mL高纯水中，即得。
其中，步骤S1中的荧光标记物的浓度为工作浓度，该工作浓度为标记物的荧光值是背景值(缓冲溶液)10倍时对应的浓度，为1∶100000；所述赭曲霉毒素单克隆抗体溶液的浓度为工作浓度，该工作浓度为与荧光标记物有70％结合时的抗体稀释倍数作为抗体的工作浓度，为1∶36000。
其中，所述步骤S1和S3中的赭曲霉毒素标准品的溶液、荧光标记物溶液和赭曲霉毒素单克隆抗体溶液体积分别为50μL，500μL和500μL。
其中，所述步骤S1和S3中的竞争反应的温度为20-25℃优选为25℃；时间为5-10min，优选为10min。
其中，所述步骤S1和S3中的荧光偏振值的测定条件为：激发波长为485nm，发射波长为530nm，cutoff值为515nm。
其中，步骤S1中的标准曲线的绘制依据OriginPro 9.0软件中的四参数方程进行。步骤S3中的待测样品可为饮料，具体可为蛋白饮料。
本发明现有的赭曲霉毒素检测技术操作繁琐耗时，不能满足高通量快速检测的要求，而且其他免疫分析方法大多为非均相反应，需要多步孵育和洗涤步骤，耗时长，操作复杂。针对这些不足，本发明提供了一种均相的、快速的赭曲霉毒素荧光偏振免疫检测方法。方法只需要加样，无需分离和洗涤操作，十分钟内就可获得检测结果。本发明建立了高效、灵敏的赭曲霉毒素荧光偏振免疫分析方法。该方法快速、简便高通量，而且能够满足赭曲霉毒素的残留检测限量要求，非常适合蛋白饮料样品中赭曲霉毒素的检测需求。
本发明所应用的荧光偏振免疫分析技术(Fluorescence PolarizationImmunoassay，FPIA)是一种不需要分离和洗涤的均相免疫分析方法。由于操作简单、快速，更适用于自动化的高通量筛选等优点，逐渐成为临床、食品和环境等领域中小分子分析的常用技术。而且，基于该种荧光素标记的蛋白饮料样品中赭曲霉毒素残留的FPIA快速检测技术还未见报道。
附图说明
图1为本发明实施例中的硼酸盐缓冲液中赭曲霉毒素荧光偏振免疫检测的标准曲线。
图2为本发明实施例中四种荧光标记物与抗体结合的信号强度。
图3为本发明实施例中的荧光标记物的结构示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法：下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特设说明，均可从商业途径得到。所使用的OTA-AMF合成方法如下：
将250μL(80μmol/mL)DCC和250μL(80μmol/mL)NHS，溶解在0.2ml of DMF中，混合均匀后加入2mg OTA，室温振摇反应2h，静置过夜。接着加入0.5mg(1μmol)AMF至上述活化的OTA溶液中，继续室温避光反应10h。取50μL反应液用薄层色谱法(TLC)分离，展开剂为：三氯甲烷/甲醇(v：v，，6：1)。刮取硅胶板上Rf＝0.9的黄色条带，甲醇洗脱，检测备用。
实施例
最佳荧光标记物的筛选
步骤一：首先将各荧光标记物的工作浓度均设定为荧光强度为缓冲溶液背景荧光强度的10倍时对应的荧光标记物的浓度(5nM)，将抗体用硼酸盐缓冲溶液稀释，绘制抗体结合曲线，获得信号强度变化的最大值δmP(δmP＝mPmax-mPmin)，其中CNH-AMF的信号变化值最大。实验结果如图2所示：
步骤二：首先将各荧光标记物的工作浓度均设定为荧光强度为BB缓冲溶液背景荧光强度的10倍时对应的荧光标记物的浓度，在与荧光标记物有70％结合时的抗体稀释度条件下，建立不同标记物的赭曲霉毒素检测标准曲线并计算IC50，根据各标准曲线的IC50值选出最佳荧光标记物。
由图2可知，最佳的荧光标记物为CNH-AMF。具体地，所述荧光标记物具有图3所示的结构。
FPIA方法的建立
步骤一：竞争FPIA；利用含10％甲醇的硼酸盐缓冲液分别配置赭曲霉毒素标准品，在反应试管中分别加入50μL赭曲霉毒素标准品、500μL工作浓度的荧光标记物以及500μL工作浓度的赭曲霉毒素单克隆抗体溶液，室温避光孵育10min后测定荧光偏振值；测定条件为激发波长485nm，发射波长530nm，cutoff值515nm。
步骤二：绘制标准曲线：竞争反应结束后，以测定的荧光偏振值为纵坐标，赭曲霉毒素标准品的浓度为横坐标，利用Origin 9.0的四参数模型拟合标准曲线。其所绘制的硼酸盐缓冲溶液中的赭曲霉毒素荧光偏振标准曲线见附图1。所建立的标准曲线的灵敏度为0.33ng/mL。能够很好的满足检测灵敏度的需要。
样品检测
步骤一：用样品基质溶液分别配置不同浓度赭曲霉毒素标准品。依次加入50μL赭曲霉毒素基质加标溶液，500μL荧光标记物溶液和500μL赭曲霉毒素单克隆抗体溶液，25℃孵育5min后进行FPIA检测。
步骤二：添加回收率测定；空白基质中加入赭曲霉毒素标准品，每个浓度三个平行，按照上述样品处理方法处理并检测，按照如下公式计算添加回收率。
添加回收率(％)＝(测定值/添加值)×100％
利用计算获得的检测回收率来评价本发明所建立的赭曲霉毒素荧光偏振免疫检测方法的准确度；实验结果见表1所示：
表1蛋白饮料中添加回收结果(n＝3)
由表1可见，赭曲霉毒素在蛋白饮料中的平均添加回收率76.5-108％；表明本发明建立的赭曲霉毒素荧光偏振免疫检测方法可满足蛋白饮料中赭曲霉毒素的残留检测要求；而且本发明快速高效、反应灵敏，解决了传统免疫方法操作复杂、耗时长的缺点能够很好地用于赭曲霉毒素的快速、高灵敏检测。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于检测赭曲霉毒素的荧光偏振免疫分析方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、将一系列已知浓度的赭曲霉毒素标准品的溶液分别与荧光标记物溶液以及赭曲霉毒素单克隆抗体溶液混合，孵育进行竞争反应，测定所得体系的荧光偏振值；
S2、以测定的荧光偏振值为纵坐标，所述一系列已知浓度的赭曲霉毒素标准品的浓度为横坐标，绘制标准曲线；
S3、以待测样品代替步骤S1中的赭曲霉毒素标准品，将所述待测样品与所述荧光标记物溶液以及所述赭曲霉毒素单克隆抗体溶液混合，孵育进行竞争反应，测定所得体系的荧光偏振值；
S4、根据步骤S2中的标准曲线，计算出所述待测样品中赭曲霉毒素的浓度。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测赭曲霉毒素的荧光偏振免疫分析方法，其特征在于：所述步骤S21中的荧光标记物为改造后赭曲霉毒素半抗原与荧光素的偶联物。
3.根据权利要求2所述的一种用于检测赭曲霉毒素的荧光偏振免疫分析方法，其特征在于：所述荧光素选自下述任意一种：4-氨甲基荧光素(AMF)，异硫氰酸荧光素乙二胺(EDF)，异硫氰酸荧光素丁二胺(BDF)，异硫氰酸荧光素己二胺(HDF)。
4.根据权利要求1中所述的一种用于检测赭曲霉毒素的荧光偏振免疫分析方法，其特征在于：步骤S1中所述一系列已知浓度的赭曲霉毒素标准品的溶液的溶质为赭曲霉毒素标准品，浓度分别为0，0.01，0.03，0.1，0.3，1，10ng/mL，溶剂为含10％甲醇的硼酸盐缓冲液；
该硼酸盐缓冲液的pH值为8.5，通过以下步骤制备所得：
称取0.47mg Na2B4O7，0.05mg NaN3溶解于0.5mL高纯水中，即得。
5.根据权利要求1中所述的一种用于检测赭曲霉毒素的荧光偏振免疫分析方法，其特征在于：步骤S1中的荧光标记物的浓度为工作浓度，该工作浓度为标记物的荧光值是缓冲溶液10倍时对应的浓度，为1∶100000；所述赭曲霉毒素单克隆抗体溶液的浓度为工作浓度，该工作浓度为与荧光标记物有70％结合时的抗体稀释倍数作为抗体的工作浓度，为1∶36000。
6.根据权利要求1中所述的一种用于检测赭曲霉毒素的荧光偏振免疫分析方法，其特征在于：所述步骤S1和S3中的赭曲霉毒素标准品的溶液、荧光标记物溶液和赭曲霉毒素单克隆抗体溶液体积分别为50μL，500μL和500μL。
7.根据权利要求1中所述的一种用于检测赭曲霉毒素的荧光偏振免疫分析方法，其特征在于：所述步骤S1和S3中的竞争反应的温度为20-25℃，时间为5-10min。
8.根据权利要求1中所述的一种用于检测赭曲霉毒素的荧光偏振免疫分析方法，其特征在于：所述步骤S1和S3中的荧光偏振值的测定条件为：激发波长为485nm，发射波长为530nm。
9.根据权利要求1中所述的一种用于检测赭曲霉毒素的荧光偏振免疫分析方法，其特征在于：步骤S1中的标准曲线的绘制依据OriginPro 9.0软件中的四参数方程进行。
10.根据权利要求1中所述的一种用于检测赭曲霉毒素的荧光偏振免疫分析方法，其特征在于：步骤S3中的待测样品为饮料。
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