CN103808935A - 一种用于检测赭曲霉毒素的elisa试剂盒的制备 - Google Patents

Abstract

本发明为一种用于检测赭曲霉毒素的ELISA试剂盒的制备，其检测灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的检测。所述试剂盒包括：包被了赭曲霉毒素抗体的酶标板、赭曲霉毒素标准品、酶标赭曲霉毒素工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩样品稀释液和浓缩洗涤液。赭曲霉素素检测试剂盒的原理是固相直接竞争酶联免疫反应，把提取的样品、酶标赭曲霉素素工作液加入对应的酶标孔中，孵育一段时间后，洗板加入底物液A、底物液B，在酶的作用下孔里将会出现蓝色，加入终止液，颜色由蓝色变为黄色。显色的深浅与标准品或样品中赭曲霉毒素的含量成反比例关系。该方法可直接用于检测谷类及谷物制品中的赭曲霉毒素。

Description

一种用于检测赭曲霉毒素的ELISA试剂盒的制备

技术领域

本发明属于检测技术领域，具体地涉及一种用于定量检测谷物和谷物产品中的赭曲霉毒素残留量的ELISA试剂盒。

背景技术

真菌毒素（Mycotoxin）是由真菌产生的有毒次级代谢产物，是粮食和饲料的重要污染物。真菌毒素广泛污染各种农作物主要由产毒真菌的大量繁殖和全球经济贸易一体化共同促成。高温高湿的气候条件、简陋的收割方式、不适宜的存储和运输条件是导致真菌大量繁殖并产生大量真菌毒素的重要原因。根据联合国粮食及农业组织（FAO），全球粮食作物的25%被真菌毒素污染。现今报道的真菌毒素有300多种,其中常见的有赭曲霉毒素A（OchratoxinA，OTA），赭曲霉毒素（vomotoxin，VT）又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynibaleno，DON），黄曲霉毒素B1 （Aflatoxin Bl，AFB1），伏马菌素B1（Fumonin Bl, FB1），玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN），杂色曲霉毒素（Sterigmatocystin，ST）等。真菌毒素可以引起动物的急、慢性中毒，或导致动物情绪狂躁、生长受限、繁殖率下降或产生激素样作用等。人类因食入一次污染的谷物或者二次污染的动物源性食品（奶、肉、蛋）而受到毒素污染的威胁。真菌毒素给人类的生产生活带来严重的经济损失和健康威害。

赭曲霉毒素（Ochratoxins）是由曲霉属（Asperillus）和青霉属（Penicillium）菌株产生的次级代谢产物，主要包括赭曲霉毒素A（OchratoxinA,OTA）、赭曲霉毒素B和赭曲霉毒素C等7种结构类似的化合物，其中OTA的毒性最强，引起人们的广泛重视。赭曲霉毒素A的分子量为403.，化学式结构式C₂₀H₁₈CINO₆，易溶于有机溶剂，如乙醇和二甲基亚砜，微溶于水，物理化学性质稳定，耐热，一般的烹调和加工方法对其只有部分破坏作用。

赭曲霉毒素的毒理作用机制主要包括抑制 ATP 的生成，与苯丙氨酸竞争苯丙氨酸-tRNA 结合位点从而抑制蛋白质的合成，促进细胞膜脂的过氧化。OTA的毒性主要表现为肝毒性、肾毒性、遗传毒性、神经毒性、致畸性、致癌性和免疫毒性。OTA毒性作用的主要靶器官是肾脏和肝脏，可诱发肿瘤。在一些欧洲国家，OTA被认为与巴尔干地区性肾病有关，尤其是保加利亚，罗马尼亚，塞尔维亚等。OTA被世界癌症研究(International Agency for Researeh on Ceancer，IARC)会列为2B类物质，即可能的人类致癌物。

鉴于OTA的广泛污染和剧烈毒性，许多国家推荐或规定OTA的检测方法和限量的法规和条款，其中欧盟制定的残留限量包括谷物原料5ng/g，谷物加工品3 ng/g，葡萄干10 ng/g，速溶咖啡10 ng/g，葡萄酒2 ng/g。2006年我国制定了饲料中OTA的限量标准，规定饲料中OTA限量标准为100μg/kg，应用的测试方法是TLC，随着OTA检测的需求越来越高，TLC受方法本身限制，灵敏度低，操作耗时，已经不能完全满足OTA检测工作的需求。理化分析方法需要昂贵的检测设备、专业的操作人员，以及复杂的样本前处理方法，限制了该方法的广泛应用。随着基于抗原抗体的特异性结合的免疫学检测技术和超微量分析方法的日益发展，能够满足OTA检测的需求，近年来在毒素残留的检测中得到广泛的应用。目前赭曲霉毒素的免疫学检测试剂盒大多来自进口，而国内有关赭曲霉毒素的试剂盒的开发还相对落后。本发明旨在建立一种检测赭曲霉毒素的ELISA试剂盒的制备。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种用于检测赭曲霉毒素的ELISA试剂盒，其检测灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的检测。本发明提供了一种用于检测赭曲霉毒素的ELISA试剂盒的制备。

检测赭曲霉毒素的ELISA试剂盒的制备及检测方法，包括酶标板、赭曲霉毒素标准品、酶标赭曲霉毒素工作液、底物液A、底物液B、终止液和浓缩洗涤液。

一种用于检测赭曲霉毒素的ELISA试剂盒的制备，包括以下步骤：酶标板的制备、赭曲霉毒素标准品的制作、酶标赭曲霉毒素工作液的制备、洗涤液的制备、底物液A的制备、底物液B的制备、终止液的制备。

其进一步特征在于：所述酶标板的制备是用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将赭曲霉毒素单克隆抗体稀释成1μg/mL，100 μL/孔，4℃放置过夜，取出酶标板甩掉板内液体，用稀释后的浓缩洗涤液300 μL/孔，洗板2次，30 s/次；然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭，180 μL/孔，37℃放置1.5 h，弃去封闭液，拍干后的酶标板放置恒温间(25℃)晾干；抽检合格后将酶标板真空密封后置4℃下保存。

所述赭曲霉毒素单克隆抗体采用赭曲霉毒素人工抗原免疫小鼠，并通过细胞融合、筛选所得到。

所述赭曲霉毒素标准品浓度分别为0 ng/mL、0.1 ng/mL、0.3 ng/mL、0.9 ng/mL、2.7 ng/mL、8.1 ng/mL。

所述酶标赭曲霉毒素工作液的制备：采用赭曲霉毒素与辣根过氧化物酶偶联得到的，用抗体稀释液稀释成1:500。

所述底物液A为含有0.5 mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液；

所述底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液。

所述终止液为2 mol/L的硫酸。

所述浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，其包含0.5% 吐温-20，0.01mol/L的PBST，pH值范围7.0-7.5之间。

赭曲霉毒素的ELISA试剂盒的检测方法，基于抗原抗体进行间接竞争酶联免疫反应，该方法包括以下步骤：

    (1)样本前处理，并将其复溶于样品稀释液工作液中；

    (2)将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20～25℃）平衡30 min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀；

    (3)取包被有赭曲霉毒素抗体的酶标板，加标准品/样本50 μL/孔到对应的微孔中；

    (4)加入酶标赭曲霉毒素工作液，50 μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温25℃避光环境中反应30 min；

    (5)小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液260 μL/孔，充分洗涤4~5次，每次间隔10 s，用吸水纸拍干；

    (6)加入底物液A 50 μL/孔，底物液B 50 μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15～20min；

    (7)加入终止液50 μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450 nm处或双波长450/630 nm检测，测定每孔吸光度值（请在5 min内读完数据）；

    (8)以标准品测试的吸光度值与标准品的浓度对数值绘制标准曲线，对照标准曲线计算样品中赭曲霉毒素的含量。

其中，所述处理后的样品是经过以下处理的样品：

(1)取粉碎好的样品过20目筛并彻底混合；

 (2)称取5g样品，加入12.5ml提取液（甲醇：水=7：3），剧烈震荡30分钟；

(3)5000rpm离心10min，用滤纸过滤；

(4)取1mL滤液用1mL PBS稀释，备用。

本发明采用酶联免疫吸附试验方法来检测。用于检测赭曲霉毒素的ELISA试剂盒的测定原理：样品中的赭曲霉毒素与酶标赭曲霉毒素竞争性的与酶标板上固定的抗体结合，通过酶催化显色剂显色，根据显色的深浅来判断样品中赭曲霉毒素的含量。如果样品中的赭曲霉毒素含量少，显色深；反之，则显色浅。本发明的试剂盒检测方法操作简便，检测灵敏、准确、快速，适用于大批量样品的检测。

附图说明

图1为赭曲霉毒素标准曲线图。

具体实施方式

检测赭曲霉毒素的ELISA试剂盒，其包括酶标板、赭曲霉毒素标准品、酶标赭曲霉毒素工作液、底物液A、底物液B、终止液和浓缩洗涤液。

下面具体描述本发明中检测赭曲霉毒素的ELISA试剂盒的制备，

赭曲霉毒素蛋白偶联物的制备：

OTA的活化：取1mg OTA溶解于0.25mL DMSO溶液中，分别量取1mg NHS和1.5mg EDC溶于2mL PBS中，两种溶液混合后4度搅拌过夜；

OTA的偶联：取BSA 2mg溶于 1mL Tris-HCL（0.1 mol/L，pH8.0），缓慢滴加于OTA的活化溶液中，室温下避光搅拌过夜，产物用0.01 mol/L，pH7.4的PBS溶液透析72h，测定浓度，分装冻存。

赭曲霉毒素抗体的制备：

选用16～18g BABL/c小鼠，免疫剂量为每只小鼠每次100μg，共免疫五次。首次采用免疫原与弗氏完全佐剂等量混匀，于颈部皮下多点注射；第二、三、四次免疫采用免疫原与弗氏不完全佐剂等量混匀，于背部皮下多点注射；第五次免疫，在融合前三天，采用免疫原直接注射腹腔。取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞融合，有限稀释法克隆细胞株，ELISA检测细胞株特性，包括效价、特异性、灵敏度等。将灵敏度高、特异性好的细胞株扩大培养，并冻存；同时腹腔注射小鼠，获得腹水，采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，透析后，测定浓度，分装冻存。

赭曲霉毒素酶标物的制备：

取1mg OTA溶解于0.25mL DMSO溶液中，取2mg EDC溶于2mL PBS中，两种溶液混合后缓慢滴加辣根过氧化物酶溶液（1mg HRP 溶于0.5mL PBS），室温下避光搅拌过夜。产物用0.01 mol/L，pH7.4的PBS溶液透析72h，测定浓度，分装冻存。

制备包被有赭曲霉毒素抗体的酶标板：

用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将赭曲霉毒素抗体稀释成1μg/mL，100 μL/孔，4℃放置过夜，取出酶标板甩掉板内液体，用稀释后的浓缩洗涤液300 μL/孔，洗板2次，30 s/次；然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭，180 μL/孔，37℃放置1.5 h，弃去封闭液，拍干后的酶标板放置恒温间(25℃)晾干；抽检合格后将酶标板真空密封后置4℃下保存。

所述的赭曲霉毒素标准品配制浓度分别为0 ng/mL、0.1 ng/mL、0.3 ng/mL、0.9 ng/mL、2.7 ng/mL、8.1 ng/mL。

所述酶标赭曲霉毒素工作液的制备：采用赭曲霉毒素与辣根过氧化物酶偶联得到的，用抗体稀释液稀释成1:500。

所述底物液A为含有0.5 mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液。

所述底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液。

所述终止液为2 mol/L的硫酸。

所述浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，其包含0.5% 吐温-20，0.01mol/L的PBST，pH值范围7.0-7.5之间。

基于上述制备的试剂，本发明用于检测赭曲霉毒素的ELISA试剂盒包括如下材料：

(1)96孔酶标板×1块(包被有偶联抗原)；

(2)标准液×6瓶：(1mL/瓶) 0 ng/mL、0.1 ng/mL、0.3 ng/mL、0.9 ng/mL、2.7 ng/mL、8.1 ng/mL；

 (3)酶标赭曲霉毒素工作液   8 mL；

 (4)底物液A         7 mL；

(5)底物液B         7 mL；

(6)终止液           7 mL；

(7)10×浓缩洗涤液  20 mL。

使用本试剂盒时的注意事项：

(1)室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温(20～25℃)会导致所有标准的OD值偏低；

(2)在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作；

(3)每加一种试剂前需将其摇匀；

(4)反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤；

(5)不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂；

(6)储存条件：保存试剂盒于2～8℃，不要冷冻，将不用的酶标板微孔板放进自封袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下；

(7)试剂变质的迹象：发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。0标准的吸光度(450/630 nm)值小于0.5(A450 nm<0.5)时，表示试剂可能变质，请勿使用；

(8)该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

本发明赭曲霉毒素的ELISA试剂盒在检测谷物和谷物产品中的赭曲霉毒素残留量中的应用：

本发明的试剂盒用于检测谷物和谷物产品中的赭曲霉毒素残留量时，通过以下步骤实施：样品前处理、用本发明试剂盒进行检测、分析结果。

(1)样品前处理

取粉碎好的样品过20目筛，并彻底混合；称取5g样品，加入12.5ml提取液（甲醇：水=7：3），剧烈震荡30分钟；5000rpm离心10min，用滤纸过滤；取1mL滤液用1mL PBS稀释，备用。

用本发明试剂盒进行检测上述样品中赭曲霉毒素残留量

取包被有赭曲霉毒素抗体的酶标板，加标准品/样本50 μL/孔到对应的微孔中；加入酶标赭曲霉毒素工作液，50 μL/孔，用盖板膜盖板后置室温25℃避光环境中反应30 min；小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液260 μL/孔，充分洗涤4~5次，每次间隔10 s，用吸水纸拍干；加入底物液A 50 μL/孔，底物液B 50 μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15～20min；加入终止液50 μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450 nm处或双波长450/630 nm检测，测定每孔吸光度值（请在5 min内读完数据）；对比待测样品与标准品的吸光度值大小，定量分析待测样品中的赭曲霉毒素的残留量。

(2)分析结果

用上述制备的试剂盒中的6个赭曲霉毒素标准品浓度0 ng/mL、0.1 ng/mL、0.3 ng/mL、0.9 ng/mL、2.7 ng/mL、8.1 ng/mL，在450/630 nm处测量吸光度值。

百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的吸光度值，再乘以100%，即

百分吸光度值(%) ＝B/B₀×100% 

其中B为标准溶液或样本溶液的平均吸光度值，B₀为0 ppb标准溶液的平均吸光度值。

以标准品百分吸光率为纵坐标，以赭曲霉毒素标准品浓度(ppb)的半对数为横坐标绘制标准曲线，求出直线方程。标准曲线见附图1。Y=A+B×X，其中A=49.98743，B=-39.61257，R=-0.99161。将样本的B/B₀值代入标准曲线中，从标准曲线上读出所对应样本的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中赭曲霉毒素的实际浓度。

Claims (8)

1.检测赭曲霉毒素的ELISA试剂盒的制备及检测方法，包括酶标板、赭曲霉毒素标准品、酶标赭曲霉毒素工作液、底物液A、底物液B、终止液和浓缩洗涤液，检测赭曲霉毒素的ELISA试剂盒的制备，包括以下步骤：酶标板的制备、赭曲霉毒素标准品的制作、酶标赭曲霉毒素工作液的制备、洗涤液的制备、底物液A的制备、底物液B的制备、终止液的制备。

2.根据权利要求2所述酶标板的制备是用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将赭曲霉毒素单克隆抗体稀释成1 μg/mL，100 μL/孔，37℃放置2 h，取出酶标板甩掉板内液体，用稀释后的浓缩洗涤液300 μL/孔，洗板2次，30 s/次；然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭，180 μL/孔，37℃放置1.5 h，弃去封闭液，拍干后的酶标板放置恒温间(25℃)晾干；抽检合格后将酶标板真空密封后置4℃下保存。

3.根据权利要求2所述赭曲霉毒素的检测赭曲霉毒素的ELISA试剂盒的制备及检测方法，其特征在于：所述的赭曲霉毒素标准品浓度分别为0 ng/mL、0.1 ng/mL、0.3 ng/mL、0.9 ng/mL、2.7 ng/mL、8.1 ng/mL。

4.根据权利要求2所述赭曲霉毒素的检测赭曲霉毒素的ELISA试剂盒的制备及检测方法，其特征在于：所述的赭曲霉毒素单克隆抗体是采用赭曲霉毒素人工抗原免疫小鼠，并通过细胞融合、筛选所得到。

5.根据权利要求2所述酶标赭曲霉毒素通过以下方式获得：取1mg OTA溶解于0.25mL DMSO溶液中，取2mg EDC溶于2mL PBS中，两种溶液混合后缓慢滴加辣根过氧化物酶溶液（1mg HRP 溶于0.5mL PBS），室温下避光搅拌过夜，产物用0.01 mol/L，pH7.4的PBS溶液透析72h，测定浓度，分装冻存。

6.根据权利要求2所述底物液A为含有0.5 mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液；所述底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液；所述终止液为2 mol/L的硫酸；所述浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，其包含0.5% 吐温-20，0.01mol/L的PBST，pH值范围7.0-7.5之间。

7.权利要求2所述的检测赭曲霉毒素的ELISA试剂盒的制备及检测方法，基于抗原抗体进行直接竞争酶联免疫反应，该方法包括以下步骤：

(1)预处理待测样品，并将其复溶于样品稀释液工作液中；

(2)将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20～25℃）平衡30 min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀；

(3)取包被有赭曲霉毒素抗原的酶标板，加标准品/样本50 μL/孔到对应的微孔中；

(4)加入酶标赭曲霉毒素工作液，50 μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温25℃避光环境中反应30 min；

(5)小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液260 μL/孔，充分洗涤4~5次，每次间隔10 s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)；

(6)加入底物液A 50 μL/孔，底物液B 50 μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15～20min；

(7)加入终止液50 μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450 nm处或双波长450/630 nm检测，测定每孔吸光度值（请在5 min内读完数据）；

(8)以标准品测试的吸光度值与标准品的浓度对数值绘制标准曲线，对照标准曲线计算样品中赭曲霉毒素的含量。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述处理后的样品是经过以下处理的样品：

(1)取粉碎好的样品过20目筛并彻底混合；

 (2)称取5g样品，加入12.5ml提取液（甲醇：水=7：3），剧烈震荡30分钟；

(3)5000rpm离心10min，用滤纸过滤；

(4)取1mL滤液用1mL PBS稀释，备用 。

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