CN103792356A - 检测伏马毒素的elisa试剂盒的制备及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明为检测伏马毒素的ELISA试剂盒的制备及其检测方法，其检测灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的检测。所述试剂盒包括：包被了伏马毒素抗原的酶标板、伏马毒素标准品、伏马毒素抗体工作液、伏马毒素酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩样品稀释液和浓缩洗涤液。伏马素素检测试剂盒的原理是固相间接竞争酶联免疫反应，把提取的样品、酶标二抗工作液和抗体工作液加入对应的酶标孔中，孵育一段时间后，洗板加入底物液A、底物液B，在酶的作用下孔里将会出现蓝色，加入终止液，颜色由蓝色变为黄色。显色的深浅与标准品或样品中伏马毒素的含量成反比例关系。该方法可直接用于检测玉米中的伏马毒素。

Description

检测伏马毒素的ELISA试剂盒的制备及检测方法

技术领域

本发明属于检测技术领域，具体地涉及一种用于定量检测坚果、谷物和谷物产品中的伏马毒素残留量的ELISA试剂盒及检测方法。

背景技术

伏马毒素( Fumonisins)是一组主要由串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)在一定温度和湿度条件下繁殖所产生的真菌毒素。1988 年，Gelderblom 等首次从玉米中分离出伏马毒素B1。伏马毒素在自然界中分布广泛，且危害性大，逐渐引起了国内外学者的高度重视。目前，已发现的伏马毒素结构类似物主要分为A、B、C、P 四类，包括 FA1、FA2、FB1、FB2、FB3、FB4、FC1、FC2、FC3、FC4、FP1等。

伏马毒素（B1，B2，和B3)是由镰孢菌(霉)属念珠菌产生的真菌毒素。在世界范围内都发现了伏马毒素污染玉米的现象。研究表明伏马毒素可以诱发老鼠患肝癌，猪的肺水肿和马的脑脊髓白质病。在一些地区中玉米中伏马毒素含量很高，在这些地区（比如中国和非洲）人的食道癌具有高发性。

研究证实伏马毒素可致马大脑白质软化症( EL-EM )，神经性中毒而表现意识障碍、失明和运动失调等症状, 严重者甚至造成死亡。对猪造成肺水肿综合征 ( PPE )，并能造成肝脏和食道损伤。伏马毒素还可引起灵长类动物的动脉粥样硬化样改变，诱发大鼠肝癌，与人类食道癌的发生也密切相关。国际癌症研究机构与加利福尼亚环境保护机构已宣布伏马毒素为人类潜在的致癌物质(2B级致癌物)。

基于伏马毒素的污染范围较广，毒性作用也较大，许多国家和地区对伏马毒素进行了系统研究。但目前国际上对于食品与饲料中伏马毒素的限量及检测方法尚无统一标准。瑞典规定人类食物中伏马毒素的限量为1 mg/kg，美国食品与药品管理局(FDA)发布了供人类食用的玉米和玉米产品伏马毒素的最高限量指导性公告，规定人类食用玉米中伏马毒素最高限量为 2 mg/kg。同时，FDA 的畜牧医学中心(CVM)也发布了动物饲料中伏马毒素的最高限量指导性公告，规定其限量范围为 1~ 50 mg/kg。在FAO/WHO联合会上关于食品添加剂的会议( 2001年2月)中规定，伏马毒素对人体的安全限量为每天摄入量按人体体重算 FB1、FB2、FB3量不超过2 g/kg。FB1以低于最大限量为最好，对 FB2、FB3的限制相对 较宽。我国对此的相关法规也正在制定中。在出入境检验检疫行业推荐标准中, 液相色谱法对伏马毒素B1 、B2的测定低限均为0.05 mg/kg，而酶联免疫吸附法则推荐检测低限为12 g /kg。这些行业标准和检测方法均可为我国制定国家标准提供一定的依据。

免疫学技术具有敏感、特异、简便的特点，近年来已被应用于伏马毒素残留检测。目前伏马毒素的免疫学检测试剂盒大多来自进口，而国内有关伏马毒素的试剂盒的开发还相对落后。本发明旨在建立一种检测伏马毒素的ELISA试剂盒的制备及检测方法。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供了检测伏马毒素的ELISA试剂盒，其检测灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的检测。本发明提供了检测伏马毒素的ELISA试剂盒的制备及检测方法。

检测伏马毒素的ELISA试剂盒的制备及检测方法，包括酶标板、伏马毒素标准品、伏马毒素抗体工作液、伏马毒素酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液和浓缩洗涤液。

检测伏马毒素的ELISA试剂盒的制备及检测方法，包括以下步骤：酶标板的制备、伏马毒素标准品的制作、伏马毒素单克隆抗体及其工作液的制备、伏马毒素酶标二抗工作液的制备、洗涤液的制备、底物液A的制备、底物液B的制备、终止液的制备。

其进一步特征在于：所述的伏马毒素包被抗原是将伏马毒素半抗原与载体蛋白偶联得到的，该载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)；用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将伏马毒素抗原稀释成1：10000比例，100 μL/孔，37℃放置2 h，取出酶标板甩掉板内液体，用稀释后的浓缩洗涤液300 μL/孔，洗板2次，30 s/次；然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭，180 μL/孔，37℃放置1.5 h，弃去封闭液，拍干后的酶标板放置恒温间(25℃)晾干；抽检合格后将酶标板真空密封后置4℃下保存。

所述的伏马毒素标准品浓度分别为0 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、150 ng/mL。

伏马毒素蛋白质偶联物单克隆抗体工作液的制备：采用伏马毒素人工抗原免疫兔所得到，该抗体工作液用抗体稀释液稀释成1：40000。

所述伏马毒素酶标二抗工作液的制备：用酶标二抗稀释液稀释成1：2000比例；所述底物液A为含有0.5 mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液；所述底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液；所述终止液为2 mol/L的硫酸；所述浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，其包含0.5% 吐温-20，0.01mol/L的PBST，pH值范围7.0-7.5之间。

伏马毒素的ELISA试剂盒的检测方法，基于抗原抗体进行间接竞争酶联免疫反应，该方法包括以下步骤：

    (1)预处理待测样品，即将待测试的样品处理为液体样品，或者用有机溶剂提取待测样品，并将其复溶于样品稀释液工作液中；

    (2)将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20～25℃）平衡30 min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀；

    (3)取包被有伏马毒素抗原的酶标板，加标准品/样本50μL/孔到对应的微孔中；

    (4)加入伏马毒素酶标二抗工作液，50μL/孔，然后加入伏马毒素抗体工作液，50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温25℃避光环境中反应30 min；

    (5)小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液260μL/孔，充分洗涤4~5次，每次间隔10 s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)；

    (6)加入底物液A 50μL/孔，底物液B 50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15～20min；

    (7)加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450 nm处或双波长450/630 nm检测，测定每孔吸光度值（请在5 min内读完数据）；

    (8)以标准品测试的吸光度值与标准品的浓度对数值绘制标准曲线，对照标准曲线计算样品中伏马毒素的含量。

其中，所述处理后的样品是经过以下处理的样品：

(1)配制90%的甲醇溶液（每个样品需要：4 mL蒸馏水+36 mL甲醇）；

(2)研磨代表性样品（使50%的样品可以通过一个20目的滤网）；

(3)称量20 g研磨过滤后的样品加入40 mL 90%的甲醇溶液，样品稀释比为1：2(w/v)；

(4)在密封的容器里混合，震荡涡旋1 min；

(5)静置、用滤纸（Whatman #1）过滤5-10 mL以上处理的液体，收集滤液；

(6)以1：20的比例稀释滤液（取0.1 mL滤液然后加入1.9 mL的蒸馏水或去离子水），混匀待测。

本发明采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法来检测。用于检测伏马毒素的ELISA试剂盒的测定原理：样品中的伏马毒素与酶标板上固定的抗原特异性竞争体，加入酶标二抗，与抗体反应，通过酶催化显色剂显色，根据显色的深浅来判断样品中伏马毒素的含量。如果样品中的伏马毒素含量少，显色深；反之，则显色浅。本发明的试剂盒检测方法操作简便，检测灵敏、准确、快速，适用于大批量样品的检测。

附图说明

图1为伏马毒素标准曲线图。

具体实施方式

检测伏马毒素的ELISA试剂盒，其包括酶标板、伏马毒素标准品、伏马毒素抗体工作液、伏马毒素酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液和浓缩洗涤液。

下面具体描述本发明中检测伏马毒素的ELISA试剂盒的制备。

伏马毒素蛋白质偶联物的制备：

将伏马毒素半抗原与载体蛋白BSA按12：1的结合比混合在0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐缓冲液(CBS)中，然后加入入碳二亚胺，搅拌l～2h，置室温反应24 h，最后用0.2 mol/L pH 7.6的PBS透析两天，除去未反应的半抗原，即可得到伏马毒素蛋白质偶联物。

伏马毒素抗体的制备：

选用3月龄健康大白兔，通过三次免疫，每次伏马毒素蛋白质偶联物免疫原用量为50μg/0.05 mL，每次免疫间隔时间为2周。初次免疫分别将免疫抗原与费氏佐剂及不安全佐剂等量混合，劲部皮下多点注射，二次、三次免疫直接注入腹腔。融合前3天每只腹腔注入25 μg伏马毒素蛋白质偶联物进行加强免疫，免疫后第6 d耳静脉取血，采用间接竞争ELISA法测定效价。取得较高效价后用半抗原直接在大腿肌肉注射，8 d后颈动脉采全血，分离抗血清，采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，制成冻干粉后于-20℃保存备用。

酶标伏马毒素的制备：

将25%戊二醛用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐缓冲液(CBS)稀释至5%，称取5 mg HRP溶于0.5 mL 5%的戊二醛，37℃水浴结合2 h；加入0.15 mol/L NaCl 1.0 mL，充分混匀后，置4℃预冷10 min；加入无水乙醇2.4 mL，颠倒混合，立即1000 r/min 离心10 min；弃掉上清，沉淀用冷的75%乙醇洗一次，将离心管倒置，风干；加入0.05 mol/L pH 9.6的CBS 0.5 mL溶解沉淀物；将5 mg PEA抗体溶于0.5 mL 0.15 mol/LNaCl，再与醛化HRP溶液混合；加入1.0 mol/L pH 9.6的CBS溶液，调节pH至9.0~9.5，于4℃下，电磁搅拌结合24 h；加入0.1 mL 0.15 mol/L 赖氨酸，以封闭残留的醛基，终止反应，放置于4℃下2 h；将反应物通过Sephadex G-200凝胶柱，用PBS洗脱，收集第一洗脱峰；或将反应物装入透析袋，用0.01 mol/L pH7.2 PBS，4℃透析过夜并收集；即为酶标记抗体(HRP-伏马毒素)。

制备包被有伏马毒素包被抗原的酶标板：

酶标板包被伏马毒素抗原，包被抗原是将伏马毒素半抗原与载体蛋白偶联得到的，该载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)；用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将伏马毒素抗原稀释成1：10000比例，100μL/孔，37℃放置2 h，取出酶标板甩掉板内液体，用稀释后的浓缩洗涤液300μL/孔，洗板2次，30 s/次；然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭，180μL/孔，37℃放置1.5 h，弃去封闭液，拍干后的酶标板放置恒温间(25℃)晾干；抽检合格后将酶标板真空密封后置4℃下保存。

所述的伏马毒素标准品配制浓度分别为0 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、150 ng/mL。

所述的伏马毒素蛋白质偶联物单克隆抗体工作液的制备：采用伏马毒素人工抗原免疫兔所得到，该抗体工作液用抗体稀释液稀释成1：40000。

所述伏马毒素酶标二抗工作液的制备：用酶标二抗稀释液稀释成1：2000比例；所述底物液A为含有0.5 mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液；所述底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液；所述终止液为2 mol/L的硫酸；所述浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，其包含0.5% 吐温-20，0.01mol/L的PBST，pH值范围7.0-7.5之间。

基于上述制备的试剂，本发明用于检测伏马毒素的ELISA试剂盒包括如下材料：

(1)96孔酶标板×1块(包被有偶联抗原)；

(2)标准液×6瓶：(1mL/瓶)0 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、150 ng/mL；

(3)酶标二抗工作液   7 mL；

(4)抗体工作液          7 mL；

(5)底物液A             7 mL；

(6)底物液B             7 mL；

(7)终止液                7 mL；

(8)10×浓缩洗涤液  20 mL；

使用本试剂盒时的注意事项：

(1)室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温(20～25℃)会导致所有标准的OD值偏低；

(2)在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作；

(3)每加一种试剂前需将其摇匀；

(4)反应终止液为2M盐酸，避免接触皮肤；

(5)不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂；

(6)储存条件：保存试剂盒于2～8℃，不要冷冻，将不用的酶标板微孔板放进自封袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下；

(7)试剂变质的迹象：发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。0标准的吸光度(450/630 nm)值小于0.5(A₄₅₀ nm<0.5)时，表示试剂可能变质，请勿使用；

(8)该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

本发明伏马毒素的ELISA试剂盒在检测坚果、谷物和谷物产品中的伏马毒素残留量中的应用：

本发明的试剂盒用于检测坚果、谷物和谷物产品中的伏马毒素残留量时，通过以下步骤实施：样品预处理、用本发明试剂盒进行检测、分析结果。

(1)样品预处理

配制90%的甲醇溶液（每个样品需要：4 mL蒸馏水+36 mL甲醇）；研磨代表性样品（使50%的样品可以通过一个20目的滤网）；称量20 g研磨过滤后的样品加入40 mL 90%的甲醇溶液，样品稀释比为1：2(w/v)；在密封的容器里混合，震荡涡旋1 min；静置、用滤纸（Whatman #1）过滤5-10 mL以上处理的液体，收集滤液；以1：20的比例稀释滤液（取0.1 mL滤液然后加入1.9 mL的蒸馏水或去离子水），混匀待测。

(2)用本发明试剂盒进行检测上述样品中伏马毒素残留量

 取包被有伏马毒素抗原的酶标板，加标准品/样本50μL/孔到对应的微孔中；加入伏马毒素酶标二抗工作液，50μL/孔，然后加入伏马毒素抗体工作液，50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温25℃避光环境中反应30 min；小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液260μL/孔，充分洗涤4~5次，每次间隔10 s，用吸水纸拍干；加入底物液A 50μL/孔，底物液B 50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15～20min；加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450 nm处或双波长450/630 nm检测，测定每孔吸光度值（请在5 min内读完数据）；对比待测样品与标准品的吸光度值大小，定量分析待测样品中的伏马毒素的残留量。

(3)分析结果

用上述制备的试剂盒中的6个伏马毒素标准品浓度0 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、150 ng/mL，在450/630 nm处测量吸光度值。

百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的吸光度值，再乘以100%，即

百分吸光度值(%) ＝B/B₀×100%

其中B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值，B₀—0 ppb标准溶液的平均吸光度值。

以标准品百分吸光率为纵坐标，以伏马毒素标准品浓度(ppb)的半对数为横坐标绘制标准曲线，求出直线方程。标准曲线见附图1。Y=－19.495X+101.84，R2=0.9989。将样本的B/B₀值代入标准曲线中，从标准曲线上读出所对应样本的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中伏马毒素的实际浓度。

Claims (8)

1.检测伏马毒素的ELISA试剂盒的制备及检测方法，包括酶标板、伏马毒素标准品、伏马毒素抗体工作液、伏马毒素酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液和浓缩洗涤液。

2.检测伏马毒素的ELISA试剂盒的制备及检测方法，包括以下步骤：酶标板的制备、伏马毒素标准品的制作、伏马毒素单克隆抗体及其工作液的制备、伏马毒素酶标二抗工作液的制备、洗涤液的制备、底物液A的制备、底物液B的制备、终止液的制备。

3.根据权利要求2所述伏马毒素的检测伏马毒素的ELISA试剂盒的制备及检测方法，其特征在于：所述的伏马毒素包被抗原是将伏马毒素半抗原与载体蛋白偶联得到的，该载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)；用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将伏马毒素抗原稀释成1：10000比例，100 μL/孔，37℃放置2 h，取出酶标板甩掉板内液体，用稀释后的浓缩洗涤液300 μL/孔，洗板2次，30 s/次；然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭，180 μL/孔，37℃放置1.5 h，弃去封闭液，拍干后的酶标板放置恒温间(25℃)晾干；抽检合格后将酶标板真空密封后置4℃下保存。

4.根据权利要求2所述伏马毒素的检测伏马毒素的ELISA试剂盒的制备及检测方法，其特征在于：所述的伏马毒素标准品浓度分别为0 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、150 ng/mL。

5.根据权利要求2所述伏马毒素的检测伏马毒素的ELISA试剂盒的制备及检测方法，其特征在于：所述的伏马毒素蛋白质偶联物单克隆抗体是采用伏马毒素人工抗原免疫兔所得，该抗体工作液用抗体稀释液稀释成1：40000。

6.根据权利要求2所述伏马毒素的检测伏马毒素的ELISA试剂盒的制备及检测方法，其特征在于：所述的伏马毒素酶标二抗工作液用酶标二抗稀释液稀释成1：2000比例；所述底物液A为含有0.5 mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液；所述底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液；所述终止液为2 mol/L的硫酸；所述浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，其包含0.5% 吐温-20，0.01 mol/L的PBST，pH值范围7.0-7.5之间。

7.权利要求2所述的检测伏马毒素的ELISA试剂盒的制备及检测方法，基于抗原抗体进行间接竞争酶联免疫反应，该方法包括以下步骤：

(1)预处理待测样品，即将待测试的样品处理为液体样品，或者用有机溶剂提取待测样品，并将其复溶于样品稀释液工作液中；

(2)将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20～25℃）平衡30 min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀；

(3)取包被有伏马毒素抗原的酶标板，加标准品/样本50 μL/孔到对应的微孔中；

(4)加入伏马毒素酶标二抗工作液，50 μL/孔，然后加入伏马毒素抗体工作液，50 μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温25℃避光环境中反应30 min；

(5)小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液260 μL/孔，充分洗涤4~5次，每次间隔10 s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)；

(6)加入底物液A 50 μL/孔，底物液B 50 μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15～20 min；

(7)加入终止液50 μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450 nm处或双波长450/630 nm检测，测定每孔吸光度值（请在5 min内读完数据）；

(8)以标准品测试的吸光度值与标准品的浓度对数值绘制标准曲线，对照标准曲线计算样品中伏马毒素的含量。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述处理后的样品是经过以下处理的样品：

(1)配制90%的甲醇溶液（每个样品需要：4 mL蒸馏水+36 mL甲醇）；

(2)研磨代表性样品（使50%的样品可以通过一个20目的滤网）；

(3)称量20 g研磨过滤后的样品加入40 mL 90%的甲醇溶液，样品稀释比为1：2(w/v)；

(4)在密封的容器里混合，震荡涡旋1 min；

(5)静置、用滤纸（Whatman #1）过滤5-10 mL以上处理的液体，收集滤液；

(6)以1：20的比例稀释滤液（取0.1 mL滤液然后加入1.9 mL的蒸馏水或去离子水），混匀待测 。

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