CN106645686A - 一种针对伏马毒素b1的灵敏检测方法 - Google Patents

一种针对伏马毒素b1的灵敏检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106645686A
CN106645686A CN201610944743.3A CN201610944743A CN106645686A CN 106645686 A CN106645686 A CN 106645686A CN 201610944743 A CN201610944743 A CN 201610944743A CN 106645686 A CN106645686 A CN 106645686A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fumonisin
quantum dot
detection method
marked
fluorescent microsphere
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610944743.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106645686B (zh
Inventor
熊勇华
周耀峰
黄小林
李响敏
江湖
赖卫华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanchang University
Original Assignee
Nanchang University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanchang University filed Critical Nanchang University
Priority to CN201610944743.3A priority Critical patent/CN106645686B/zh
Publication of CN106645686A publication Critical patent/CN106645686A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106645686B publication Critical patent/CN106645686B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/588—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with semiconductor nanocrystal label, e.g. quantum dots
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/37—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

本发明提供了一种针对伏马毒素B1的灵敏检测方法，该方法利用包埋有量子点的荧光微球替代常规的酶载体与伏马毒素B1偶联，以偶联产物作为竞争抗原执行直接竞争ELISA。在技术路线中，本发明首先依据发光特性选择了适宜的量子点，进一步设计了基于荧光微球技术的量子点包埋方法，在此基础上，将量子点荧光微球经BSA包被后与伏马毒素B1偶联，从而得到了性能更好的竞争性抗原。该技术方案中，荧光微球通过高聚物载体包埋了大量的量子点，因而具有更高的发光强度，可有效地提高检测的灵敏度；而且，由于荧光微球具有较大的粒径，因此可在一定程度上降低竞争抗原与包被抗体之间过高的亲和力，从而提升检测的灵敏度。

Description

一种针对伏马毒素B1的灵敏检测方法
技术领域
本发明涉及抗原检测技术领域，进一步涉及基于荧光免疫学分析的抗原检测技术，具体涉及一种针对伏马毒素B1的灵敏检测方法。
背景技术
伏马毒素是一组主要由串珠镰刀菌在一定温度和湿度条件下繁殖所产生的真菌毒素，是一类由不同的多氢醇和丙三羧酸组成的结构类似的双酯化合物，包括由20个碳原子组成的脂肪链及通过二个酯键连接的亲水性侧链。伏马毒素存在的形式有FA1、FA2、FB1、FB2、FB3、FB4、FC1、FC2、FC3、FC4、FP1等,其中以伏马毒素B1（FB1）最为常见，毒性也最大。伏马毒素可致马大脑白质软化症，猪肺水肿和胸腔积水，还可引起灵长类动物的动脉粥样硬化样改变，诱发大鼠肝癌。在人类当中，伏马毒素主要出现在玉米高消费的一些地区，部分地区的流行病学研究显示，伏马毒素与人类食道癌的发生密切相关。特别需要指出的是，作为世界主要粮食品种之一的玉米最容易感染串珠镰刀菌和伏马毒素，因此建立高灵敏、可靠的检测方式检测伏马毒素B1对人类健康有着非常重要的意义。
基于免疫学的快速筛查方法因具有通量高、检测快速、成本低等优势，近年来得到广泛的推广和应用。其中竞争酶联免疫吸附法在小分子抗原的检测中扮演了重要角色，常规竞争酶联免疫吸附法采用辣根过氧化物酶催化四甲基联苯胺显色作为信号源，这种简单的催化底物显色作为信号导致了常规竞争酶联免疫吸附法检测范围在μg/mL到ng/mL之间，远远满足不了食品污染检测pg/mL的检测要求。目前，用于提高直接竞争免疫学分析方法检测灵敏度的策略主要有两个方面：一是提高检测信号的灵敏度，如等离子共振免疫吸附法、化学发光免疫吸附法、拉曼散射免疫吸附法及荧光免疫吸附法等；二是降低竞争抗原与抗体的亲和力，如化学合成结构类似物及生物合成模拟表位等。
在传统直接竞争酶联免疫吸附法中，竞争抗原的制备是通过将小分子半抗原与载体蛋白（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）偶联。由于载体蛋白的尺寸较小，导致竞争抗原与相应抗体的亲和力较高，无法被目标物所竞争。相对于载体蛋白，纳米颗粒具有更大的尺寸和重量，在相同的温度下，其布朗运动更慢。使用纳米颗粒作为小分子半抗原的载体可以合成出亲和力更低的竞争抗原，从而更容易被目标分析物竞争，进而获得更高的检测灵敏度。此外，使用纳米材料替代蛋白作为竞争抗原的载体，有效地规避了传统化学合成或生物合成抗原类似物的局限性，如操作复杂繁琐、费时费力以及偶然性大等。基于上述技术优势，纳米颗粒的抗原载体受到了广泛的关注，然而在载体的选择方面，既应当考虑分子层面的偶联效果，同时还应当具有良好的发光特性。近年来，量子点以其宽激发、窄发射、斯托克斯位移大和耐光漂白等优良的光学特性在免疫学分析中得到了广泛应用，有研究者尝试利用量子点代替常规载体HRP、ALP，然而实际研究中发现量子点与抗原的结合效果不理想，相应的发光性能难以保证，同时由于量子点本身性质不稳定，因此易受环境影响而发生荧光淬灭，此外，由于量子点的粒径仍相对较小，因此一方面存在分离纯化不方便的问题，另一方面仍会导致竞争抗原和抗体之间亲和力过高的现象。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种针对伏马毒素B1的灵敏检测方法，以解决现有技术中针对伏马毒素B1的检测方法灵敏性较低的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是现有技术中针对伏马毒素B1的直接竞争ELISA法因显色底物发光性能不佳而导致检测灵敏度较低。
本发明要解决的再一技术问题是现有技术中针对伏马毒素B1的直接竞争ELISA法因竞争性抗原与抗体的亲和力过高而导致检测灵敏度较低。
本发明要解决的又一技术问题是以期通过量子点替代酶载体来执行直接竞争ELISA、以检测伏马毒素B1含量的方法中，量子点的发光性能难以得到保证。
本发明要解决的又一技术问题是以期通过量子点替代酶载体来执行直接竞争ELISA、以检测伏马毒素B1含量的方法中，量子点的化学稳定性较低。
本发明要解决的又一技术问题是以期通过量子点微球替代酶载体来执行直接竞争ELISA、以检测伏马毒素B1含量的方法中，量子点微球与伏马毒素B1的偶联效果不佳。
本发明要解决的又一技术问题是以期通过量子点微球替代酶载体来执行直接竞争ELISA、以检测伏马毒素B1含量的方法中，量子点微球与伏马毒素B1偶联后导致伏马毒素B1的抗原抗体结合性能下降。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种针对伏马毒素B1的灵敏检测方法，该方法属于直接竞争ELISA法，其中与伏马毒素B1偶联的载体是标记有羧基修饰的量子点的荧光微球。
作为优选，包括以下步骤：
1）在酶标板上包被抗体；
2）制备标记有羧基修饰的量子点的荧光微球；
3）将步骤2）所得产物与伏马毒素B1偶联，即得到竞争抗原；
4）将待测溶液与所述竞争抗原加入至步骤1）包被有抗体的酶标板中，抗原抗体结合反应，而后检测酶标板的荧光强度。
作为优选，步骤2）所述标记有羧基修饰的量子点的荧光微球是通过以下方法制备的：以氯仿为溶剂，配制油酸基团修饰的量子点浓度为15～25mg/mL、PMMA浓度为25～35mg/mL、PMAO浓度为15～25mg/mL的混合溶液，保持25～35min，而后将取十二烷基磺酸钠水溶液与所述混合溶液混合至其中油酸基团修饰的量子点浓度为3～4mg/mL，混合均匀后去除氯仿，固液分离取固相，即得到标记有羧基修饰的量子点的荧光微球。在此基础上进一步优选的：所述混合均匀可以是在超声震荡条件下实现的；所述固液分离可以是通过离心实现的；固液分离取固相后可以用超纯水洗涤，洗涤次数可以是三次，洗涤后的产物可以在超纯水中于4℃保存。
作为优选，所述量子点是CdSe/ZnS量子点。
作为优选，所述量子点的激发波长为450nm、发射波长为580nm。
作为优选，所述标记有羧基修饰的量子点的荧光微球，其粒径为250nm，其最大荧光发射波长580nm。
作为优选，氯仿的去除是利用旋蒸实现的。
作为优选，步骤3）具体包括以下操作：利用牛血清白蛋白包被标记有羧基修饰的量子点的荧光微球，将包被产物与伏马毒素B1偶联，即得到竞争抗原。
作为优选，所述利用牛血清白蛋白包被标记有羧基修饰的量子点的荧光微球，包括以下步骤：在磷酸盐缓冲液中将标记有羧基修饰的量子点的荧光微球与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、牛血清白蛋白混合，至溶液中牛血清白蛋白的质量体积分数为0.8%～1.2%，于35～39℃反应25～35min，而后补加1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺3～5次，每次补加后于35～39℃反应25～35min，补加全部完成后固液分离取固相，洗涤后溶解于碳酸氢钠溶液中。在以上的优选技术方案中，为了获得高的重复性，牛血清白蛋白采用了饱和标记。在此基础上进一步优选的：补加的次数可以是4次；所述磷酸盐缓冲液的初始浓度可以是0.04～0.06mol/L，其pH可以是5.8～6.2；每次重复补加的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺的量可以相等；取固相后可以用超纯水洗涤，洗涤次数可以是三次（该洗涤步骤用于去除多余的BSA）；所述碳酸氢钠溶液的pH可以是8.2～8.6；溶解于碳酸氢钠溶液中以后可以于4℃保存。
作为优选，步骤3）中的固液分离是以12000～15000rpm的转速离心8～12min。
作为优选，标记有羧基修饰的量子点的荧光微球与伏马毒素B1之间的偶联是利用活泼酯法实现的。
作为优选，经BSA包被的标记有羧基修饰的量子点的荧光微球与伏马毒素B1之间的偶联是利用活泼酯法实现的。
作为优选，所述偶联包括以下步骤：在无水四氢呋喃环境下，取二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、伏马毒素B1混合活化；收集活化后的伏马毒素B1，按照活化后的伏马毒素B1与所述包被产物上牛血清白蛋白二者摩尔比为1:8～1:12将伏马毒素B1与所述包被产物混合，在pH为8.4～8.8、室温条件下反应10～14h，收集产物，洗涤后溶解于水中。
在以上技术方案中，为获得不同亲和力的竞争性抗原，可以通过控制伏马毒素B1与牛血清白蛋白包被的量子点微球上的牛血清白蛋白的摩尔比来实现，具体用量及操作条件可依据活泼酯法的一般技术常识进行适应性选择；当然，伏马毒素B1与牛血清白蛋白包被的量子点微球上的牛血清白蛋白之间具体标记摩尔可以比分别为5:1、1:1、1:5、1:10、1:20，优选为1:10。
作为优选，所述抗原抗体反应的条件是在35～39℃反应25～35min。
作为优选，步骤4）中竞争性抗原及待测样品的加入量均为40～60μL/孔；更优的是50μL/孔。
作为优选，经抗原抗体反应后，先用含0.05%吐温20的0.01M磷酸盐缓冲液洗涤酶标板三次，再用0.01M的磷酸盐缓冲液洗涤酶标板1次，再检测荧光强度。
在以上技术方案中，检测得到的荧光强度即用于反应待测样品中伏马毒素B1的含量，实际操作中可利用已知浓度且呈梯度分布的伏马毒素B1标准溶液，通过以上方法绘制百分荧光率（百分荧光率(%)＝F/F0×100%，其中F0为第一个标准(0标准)的荧光强度值，F为标准品或样本的荧光强度值的平均值）——伏马毒素B1浓度的标准曲线，再利用待测样品的荧光强度计算出相应的百分荧光率，然后从标准曲线中计算待测样品的伏马毒素B1含量。具体操作方法可依据本技术领域的一般技术常识进行适应性选择。上述梯度分布的伏马毒素B1的标准液，可以分别选择0ng/mL、0.05ng/mL、0.25ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL。
在以上技术方案中，各试剂在使用前可以先于室温平衡30min以上再使用。所述PMAO是马来酸酐/1-十八碳烯交替共聚物，所述PMMA是聚甲基丙烯酸甲酯，二者均可自市面购得。所述油酸基团修饰的量子点可以依据本领域的常规技术制备获得。
本方法适用于伏马毒素B1的定量检测，特别是适合于痕量伏马毒素B1的检测。样品处理可以按照本技术领域相关国标方法执行。
采用本发明技术方案具有如下有益效果：
1、本发明通过微乳液法将单个的荧光量子点包埋至聚合物微球中，制备出了发光强度更高的荧光量子点微球，其发光强度较相应的量子点提高了2800倍；此外，由于量子点包裹在微球的内部，受外界环境（溶剂、热、电、磁等）影响小，在壳结构的保护下性质更稳定，在一定程度上避免了荧光的淬灭以及微球的聚沉。同时，量子点微球的粒径约为几十到几百纳米，分离纯化较量子点简便，低转速（<10000rpm）离心就能实现常规溶液中的微球分离。
2、本发明方法通过使用油溶性量子点制备高发光的量子点荧光微球用于代替量子点直接用于常规免疫学荧光标记，大大地提高了荧光信号输出的强度，有利于提高检测灵敏度。
3、本发明方法通过使用粒径更大的量子点微球替代小的蛋白粒子作为伏马毒素B1的偶联载体，可以获得不同亲和力的竞争抗原，且亲和力变化范围更宽，有助于提高直接竞争免疫学分析的检测灵敏度。
4、本发明技术通过利用高发光的量子点微球替代传统酶催化的化学显色信号，减少了酶催化的步骤，因此操作更简单，检测时间更短。
本发明提供了一种针对伏马毒素B1的灵敏检测方法，该方法利用包埋有量子点的荧光微球（Quantum dot beads,QBs）替代常规的酶载体与伏马毒素B1偶联，以偶联产物作为竞争抗原执行直接竞争ELISA。在技术路线中，本发明首先依据发光特性选择了适宜的量子点，进一步设计了基于荧光微球技术的量子点包埋方法，在此基础上，将量子点荧光微球经BSA包被后与伏马毒素B1偶联，从而得到了性能更好的竞争性抗原。
该技术方案中，荧光微球通过高聚物载体包埋了大量的量子点，因而具有更高的发光强度，可有效地提高检测的灵敏度。此外，由于量子点包裹在微球的内部，受外界环境（溶剂、热、电、磁等）影响小，在壳结构的保护下性质更稳定，在一定程度上避免了荧光的淬灭以及微球的聚沉。同时，量子点微球的粒径约为几十到几百纳米，分离纯化较量子点简便，低转速（<10000rpm）离心就能实现常规溶液中的微球分离；而且，由于荧光微球具有较大的粒径，因此可在一定程度上降低竞争抗原与包被抗体之间过高的亲和力，从而提升检测的灵敏度。
附图说明
图1是本发明方法原理示意图；
图2是本发明实施例1中伏马毒素B1直接酶联免疫吸附法的标准曲线；
图3是本发明实施例1中玉米样本中伏马毒素B1检测直接竞争荧光免疫学分析的标准曲线；
图4是本发明实施例1中小麦样本中伏马毒素B1检测直接竞争荧光免疫学分析的标准曲线；
图5是本发明实施例1中大米样本中伏马毒素B1检测直接竞争荧光免疫学分析的标准曲线。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十（10%）的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。
除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的%，如无特别说明，均为质量百分含量。
在以下试验中，磷酸盐缓冲液（PBS，0.05M，pH 7.4）的配置方法如下：NaCl 40g，Na2HPO4 13.5g，KH2PO4 1.0g，KCl 1.0g溶于1L超纯水中。用0.1M NaOH调pH值至8.0～9.0。
试验中所涉及的鼠源性IgG类单克隆抗体抗伏马毒素B1单克隆抗体，由无锡中德伯尔生物技术有限公司提供，本实验所涉及的伏马毒素B1及其他试剂均购买自Sigma公司。
实施例1
1、羧基修饰的量子点荧光微球
10mg油酸基团修饰后的量子点（该量子点的激发波长为450nm，发射波长为580nm）溶解在0.5mL的氯仿中，再加入15mg的甲基丙烯酸甲酯和10mg的1-马来酸酐聚合物，半小时后该混合液重新溶解在2.5mL的磺酸钠水溶液中最终浓度约3.3mg/mL，该混合液在超声条件下混匀，混匀后用旋蒸的方法除去氯仿这个非极性有机溶剂后得到水溶性羧基修饰的量子点荧光微球通过离心的方式将量子点荧光微球分离下来，分离后的量子点荧光微球用超纯水洗涤三次。洗涤后的量子点荧光微球重新溶解在超纯水中4℃保存。
2、牛血清白蛋白包被的量子点微球的制备
将水溶性羧基修饰的量子点荧光微球溶解于pH 6.0，0.05mol/L磷酸盐缓冲液中，加入适量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺后，加入质量体积分数为1%的牛血清白蛋白，37℃反应半小时，半小时后继续加入等量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，重复补加四次，该牛血清白蛋白饱和包被的量子点荧光微球在14000rpm下离心10min，去掉上清后用超纯水洗涤三次去除多余的血清白蛋白，离心后的量子点荧光微球复溶在pH8.4的碳酸氢钠溶液中，4℃保存。
3、以辣根过氧化物酶为标记酶、以3,3’,5,5’四甲基联苯胺显色液作为显色底物的伏马毒素B1直接竞争酶联免疫吸附法
传统酶联免疫吸附法试剂盒用于检测玉米和玉米产品中的伏马毒素B1残留量时，通过以下步骤实施：样品前处理、用传统试剂盒进行检测、分析结果。
(1)样品前处理
样品前处理按国标进行。
(2)用传统酶联免疫吸附法试剂盒进行检测上述样品中伏马毒素B1残留量
取包被有抗伏马毒素B1单克隆抗体的酶标板，加标准品/样本50μL/孔到对应的微孔中；加入辣根过氧化物酶标记伏马毒素B1工作液，50μL/孔，用盖板膜盖板后置室温37℃避光环境中反应45min；小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液340μL/孔，充分洗涤4～5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干；加入3,3’,5,5’四甲基联苯胺显色液，100μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应15min；加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处检测，测定每孔吸光度值（请在5min内读完数据）；对比待测样品与标准品的吸光度值大小，定量分析待测样品中的伏马毒素B1的残留量。
(3)分析结果
用传统酶联免疫吸附法试剂盒中的8个伏马毒素B1标准品浓度0ng/mL、0.05ng/mL、0.25ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL。在450nm处测量吸光度值。
百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的吸光度值，再乘以100%，即百分吸光度值(%)＝B/B0×100%其中B为标准溶液或样本溶液的平均吸光度值，B0为0ng/mL标准溶液的平均吸光度值。
以标准品百分吸光率为纵坐标，以伏马毒素B1标准品浓度(ng/mL)的半对数为横坐标绘制标准曲线，求出直线方程。标准曲线为y=-18.78ln(x)+49.62，R2=0.9692，见附图2。该方法的IC50被定义为百分吸光率为50%时所对应的伏马毒素B1的浓度。通过该标准曲线计算得IC50为0.65ng/mL。当进行实际样本检测时，将样本的百分吸光率（B/B0×100%）值代入标准曲线中，从标准曲线上读出所对应样本的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中伏马毒素B1的实际浓度。
4、本发明在检测玉米、小麦及大米等样品中伏马毒素B1的含量的应用
直接竞争荧光免疫吸附法用于检测玉米、小麦及大米等样品中的伏马毒素B1残留量时，通过以下步骤实施：样品前处理、用直接竞争荧光免疫吸附法进行检测、分析结果。
(1)样品前处理
样品前处理按国标进行。
(2)用直接竞争荧光免疫吸附法进行检测上述样品中伏马毒素B1残留量
取包被有抗伏马毒素B1单克隆抗体的酶标板，加标准品/样本50μL/孔到对应的微孔中；加入量子点荧光微球标记伏马毒素B1工作液，50μL/孔，用盖板膜盖板后置室温37℃避光环境中反应45min；小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液340μL/孔，充分洗涤4～5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干；设定多功能酶标仪激发为435nm，发射为580nm处检测，测定每孔荧光强度值值；对比待测样品与标准品的荧光强度值大小，定量分析待测样品中的伏马毒素B1的残留量。
(3)分析结果
用直接竞争荧光免疫吸附法中的8标准品浓度4.2pg/mL、2.1pg/mL、1.05pg/mL、0.52pg/mL、0.26pg/mL、0.13pg/mL、0.065pg/mL、0pg/mL在435激发580发射处测量
百分荧光率的计算，标准品或样本的百分荧光率等于标准品或样本的百分荧光值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的荧光值，再乘以100%，即百分荧光值(%)＝F/F0×100%其中F为标准溶液或样本溶液的平均荧光值，F0为0pg/mL标准溶液的平均荧光值。
以标准品百分荧光率为纵坐标，以伏马毒素B1标准品浓度(pg/mL)的半对数为横坐标绘制标准曲线，求出直线方程。该方法的IC50被定义为百分荧光率为50%时所对应的伏马毒素B1的浓度。当进行实际样本检测时，将样本的百分荧光率（F/F0×100%）值代入标准曲线中，从标准曲线上读出所对应样本的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中伏马毒素B1的实际浓度。
4.1玉米样本中伏马毒素B1的检测
取包被有抗伏马毒素B1单克隆抗体的酶标板，加标准品/样本50μL/孔到对应的微孔中；加入量子点荧光微球标记伏马毒素B1工作液，50μL/孔，用盖板膜盖板后置室温37℃避光环境中反应45min；小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液340μL/孔，充分洗涤4～5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干；设定多功能酶标仪激发为435nm，发射为580nm处检测，测定每孔荧光强度值值；对比待测样品与标准品的荧光强度值大小，定量分析待测样品中的伏马毒素B1的残留量。具体实验结果如下：线性标准曲线为y=17.8ln(x)+25.654，R2=0.9843，见附图3。通过标准曲线计算得该方法的半数抑制浓度IC50（即F/F0×100%=50%）为0.25pg/mL。
4.2小麦样本中伏马毒素B1的检测
取包被有抗伏马毒素B1单克隆抗体的酶标板，加标准品/样本50μL/孔到对应的微孔中；加入量子点荧光微球标记伏马毒素B1工作液，50μL/孔，用盖板膜盖板后置室温37℃避光环境中反应45min；小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液340μL/孔，充分洗涤4～5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干；设定多功能酶标仪激发为435nm，发射为580nm处检测，测定每孔荧光强度值值；对比待测样品与标准品的荧光强度值大小，定量分析待测样品中的伏马毒素B1的残留量。具体实验结果如下：线性标准曲线为y=-18.66ln(x)+31.546，R2=0.992，见附图4。通过标准曲线计算得该方法的半数抑制浓度IC50（即F/F0×100%=50%）为0.37pg/mL。
4.3大米样本中伏马毒素B1的检测
取包被有抗伏马毒素B1单克隆抗体的酶标板，加标准品/样本50μL/孔到对应的微孔中；加入量子点荧光微球标记伏马毒素B1工作液，50μL/孔，用盖板膜盖板后置室温37℃避光环境中反应45min；小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液340μL/孔，充分洗涤4～5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干；设定多功能酶标仪激发为435nm，发射为580nm处检测，测定每孔荧光强度值值；对比待测样品与标准品的荧光强度值大小，定量分析待测样品中的伏马毒素B1的残留量。具体实验结果如下：线性标准曲线为y=-19.74ln(x)+35.59，R2=0.9814，见附图5。通过标准曲线计算得该方法的半数抑制浓度IC50（即F/F0×100%=50%）为0.48pg/mL。
结论：结合以上第3节和第4节可以发现本发明中所提到的新方法对伏马毒素B1残留量的检测灵敏度（IC50=(0.25+0.37+0.48)/3pg/mL=0.37pg/mL）比常规直接竞争酶联免疫法（IC50=0.65ng/mL）提高了约1756（(0.65ng/mL)/(0.37pg/mL)=1756）倍，并且本发明方法在酶联免疫吸附试验过程中步骤简便，耗时较短，体现出用于检测的便捷性，更适合用于快速检测。
实施例2
一种针对伏马毒素B1的灵敏检测方法，该方法包括以下步骤：
1）在酶标板上包被抗体；
2）制备标记有羧基修饰的量子点的荧光微球；
3）将步骤2）所得产物与伏马毒素B1偶联，即得到竞争抗原；
4）将待测溶液与所述竞争抗原加入至步骤1）包被有抗体的酶标板中，抗原抗体结合反应，而后检测酶标板的荧光强度。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
步骤2）所述标记有羧基修饰的量子点的荧光微球是通过以下方法制备的：以氯仿为溶剂，配制油酸基团修饰的量子点浓度为15mg/mL、PMMA浓度为25mg/mL、PMAO浓度为15mg/mL的混合溶液，保持25min，而后将取十二烷基磺酸钠水溶液与所述混合溶液混合至其中油酸基团修饰的量子点浓度为3mg/mL，混合均匀后去除氯仿，固液分离取固相，即得到标记有羧基修饰的量子点的荧光微球。
所述量子点是CdSe/ZnS量子点。
所述量子点的激发波长为450nm、发射波长为580nm。
所述标记有羧基修饰的量子点的荧光微球，其粒径为250nm，其最大荧光发射波长580nm。
氯仿的去除是利用旋蒸实现的。
步骤3）具体包括以下操作：利用牛血清白蛋白包被标记有羧基修饰的量子点的荧光微球，将包被产物与伏马毒素B1偶联，即得到竞争抗原。
所述利用牛血清白蛋白包被标记有羧基修饰的量子点的荧光微球，包括以下步骤：在磷酸盐缓冲液中将标记有羧基修饰的量子点的荧光微球与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、牛血清白蛋白混合，至溶液中牛血清白蛋白的质量体积分数为0.8%，于35℃反应25min，而后补加1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺3次，每次补加后于35℃反应25min，补加全部完成后固液分离取固相，洗涤后溶解于碳酸氢钠溶液中。
所述偶联包括以下步骤：在无水四氢呋喃环境下，取二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、伏马毒素B1混合活化；收集活化后的伏马毒素B1，按照活化后的伏马毒素B1与所述包被产物上牛血清白蛋白二者摩尔比为1:8将伏马毒素B1与所述包被产物混合，在pH为8.4、室温条件下反应10h，收集产物，洗涤后溶解于水中。
实施例3
一种针对伏马毒素B1的灵敏检测方法，该方法包括以下步骤：
1）在酶标板上包被抗体；
2）制备标记有羧基修饰的量子点的荧光微球；
3）将步骤2）所得产物与伏马毒素B1偶联，即得到竞争抗原；
4）将待测溶液与所述竞争抗原加入至步骤1）包被有抗体的酶标板中，抗原抗体结合反应，而后检测酶标板的荧光强度。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
步骤2）所述标记有羧基修饰的量子点的荧光微球是通过以下方法制备的：以氯仿为溶剂，配制油酸基团修饰的量子点浓度为25mg/mL、PMMA浓度为35mg/mL、PMAO浓度为25mg/mL的混合溶液，保持35min，而后将取十二烷基磺酸钠水溶液与所述混合溶液混合至其中油酸基团修饰的量子点浓度为4mg/mL，混合均匀后去除氯仿，固液分离取固相，即得到标记有羧基修饰的量子点的荧光微球。
步骤3）具体包括以下操作：利用牛血清白蛋白包被标记有羧基修饰的量子点的荧光微球，将包被产物与伏马毒素B1偶联，即得到竞争抗原。
所述利用牛血清白蛋白包被标记有羧基修饰的量子点的荧光微球，包括以下步骤：在磷酸盐缓冲液中将标记有羧基修饰的量子点的荧光微球与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、牛血清白蛋白混合，至溶液中牛血清白蛋白的质量体积分数为1.2%，于39℃反应35min，而后补加1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺5次，每次补加后于39℃反应35min，补加全部完成后固液分离取固相，洗涤后溶解于碳酸氢钠溶液中。
所述偶联包括以下步骤：在无水四氢呋喃环境下，取二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、伏马毒素B1混合活化；收集活化后的伏马毒素B1，按照活化后的伏马毒素B1与所述包被产物上牛血清白蛋白二者摩尔比为1:12将伏马毒素B1与所述包被产物混合，在pH为8.8、室温条件下反应14h，收集产物，洗涤后溶解于水中。
实施例4
一种针对伏马毒素B1的灵敏检测方法，该方法包括以下步骤：
1）在酶标板上包被抗体；
2）制备标记有羧基修饰的量子点的荧光微球；
3）将步骤2）所得产物与伏马毒素B1偶联，即得到竞争抗原；
4）将待测溶液与所述竞争抗原加入至步骤1）包被有抗体的酶标板中，抗原抗体结合反应，而后检测酶标板的荧光强度。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
所述量子点是CdSe/ZnS量子点。
所述量子点的激发波长为450nm、发射波长为580nm。
所述标记有羧基修饰的量子点的荧光微球，其粒径为250nm，其最大荧光发射波长580nm。
步骤3）具体包括以下操作：利用牛血清白蛋白包被标记有羧基修饰的量子点的荧光微球，将包被产物与伏马毒素B1偶联，即得到竞争抗原。
所述抗原抗体反应的条件是在39℃反应35min。
实施例5
一种针对伏马毒素B1的灵敏检测方法，该方法属于直接竞争ELISA法，其中与伏马毒素B1偶联的载体是标记有羧基修饰的量子点的荧光微球。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种针对伏马毒素B1的灵敏检测方法，其特征在于该方法属于直接竞争ELISA法，其中与伏马毒素B1偶联的载体是标记有羧基修饰的量子点的荧光微球。
2.根据权利要求1所述的一种针对伏马毒素B1的灵敏检测方法，其特征在于包括以下步骤：
1)在酶标板上包被抗体；
2)制备标记有羧基修饰的量子点的荧光微球；
3)将步骤2)所得产物与伏马毒素B1偶联，即得到竞争抗原；
4)将待测溶液与所述竞争抗原加入至步骤1)包被有抗体的酶标板中，抗原抗体结合反应，而后检测酶标板的荧光强度。
3.根据权利要求2所述的一种针对伏马毒素B1的灵敏检测方法，其特征在于步骤2)所述标记有羧基修饰的量子点的荧光微球是通过以下方法制备的：以氯仿为溶剂，配制油酸基团修饰的量子点浓度为15～25mg/mL、PMMA浓度为25～35mg/mL、PMAO浓度为15～25mg/mL的混合溶液，保持25～35min，而后将取十二烷基磺酸钠水溶液与所述混合溶液混合至其中油酸基团修饰的量子点浓度为3～4mg/mL，混合均匀后去除氯仿，固液分离取固相，即得到标记有羧基修饰的量子点的荧光微球。
4.根据权利要求3所述的一种针对伏马毒素B1的灵敏检测方法，其特征在于所述量子点是CdSe/ZnS量子点。
5.根据权利要求3所述的一种针对伏马毒素B1的灵敏检测方法，其特征在于所述量子点的激发波长为450nm、发射波长为580nm。
6.根据权利要求3所述的一种针对伏马毒素B1的灵敏检测方法，其特征在于所述标记有羧基修饰的量子点的荧光微球，其粒径为250nm，其最大荧光发射波长580nm。
7.根据权利要求3所述的一种针对伏马毒素B1的灵敏检测方法，其特征在于氯仿的去除是利用旋蒸实现的。
8.根据权利要求2所述的一种针对伏马毒素B1的灵敏检测方法，其特征在于步骤3)具体包括以下操作：利用牛血清白蛋白包被标记有羧基修饰的量子点的荧光微球，将包被产物与伏马毒素B1偶联，即得到竞争抗原。
9.根据权利要求8所述的一种针对伏马毒素B1的灵敏检测方法，其特征在于所述利用牛血清白蛋白包被标记有羧基修饰的量子点的荧光微球，包括以下步骤：在磷酸盐缓冲液中将标记有羧基修饰的量子点的荧光微球与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、牛血清白蛋白混合，至溶液中牛血清白蛋白的质量体积分数为0.8％～1.2％，于35～39℃反应25～35min，而后补加1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺3～5次，每次补加后于35～39℃反应25～35min，补加全部完成后固液分离取固相，洗涤后溶解于碳酸氢钠溶液中。
10.根据权利要求8所述的一种针对伏马毒素B1的灵敏检测方法，其特征在于所述偶联包括以下步骤：在无水四氢呋喃环境下，取二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、伏马毒素B1混合活化；收集活化后的伏马毒素B1，按照活化后的伏马毒素B1与所述包被产物上牛血清白蛋白二者摩尔比为1:8～1:12将伏马毒素B1与所述包被产物混合，在pH为8.4～8.8、室温条件下反应10～14h，收集产物，洗涤后溶解于水中。
CN201610944743.3A 2016-11-02 2016-11-02 一种针对伏马毒素b1的灵敏检测方法 Active CN106645686B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610944743.3A CN106645686B (zh) 2016-11-02 2016-11-02 一种针对伏马毒素b1的灵敏检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610944743.3A CN106645686B (zh) 2016-11-02 2016-11-02 一种针对伏马毒素b1的灵敏检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106645686A true CN106645686A (zh) 2017-05-10
CN106645686B CN106645686B (zh) 2018-08-17

Family

ID=58820532

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610944743.3A Active CN106645686B (zh) 2016-11-02 2016-11-02 一种针对伏马毒素b1的灵敏检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106645686B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109633144A (zh) * 2018-12-28 2019-04-16 南昌大学 一种以聚集诱导发光荧光微球为信标载体制备的荧光免疫层析试纸条
CN111607575A (zh) * 2020-04-07 2020-09-01 天津科技大学 一种转氨酶phta、制备方法和应用
CN118226046A (zh) * 2024-05-24 2024-06-21 广州瑞辉生物科技股份有限公司 一种肌钙蛋白i检测试剂盒及制备方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009068195A2 (en) * 2007-11-29 2009-06-04 Bayer Cropscience Ag Method for reducing mycotoxin contamination in maize
CN101661043A (zh) * 2009-09-27 2010-03-03 上海交通大学 用胶体金免疫层析试验检测伏马毒素的方法
CN102455356A (zh) * 2010-10-29 2012-05-16 中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所 一种葡萄球菌肠毒素和伏马菌素的免疫芯片检测方法
CN102879570A (zh) * 2012-09-25 2013-01-16 南京师范大学 一种用光子晶体微球流式芯片检测真菌毒素的方法
CN103792356A (zh) * 2012-11-04 2014-05-14 江苏维赛科技生物发展有限公司 检测伏马毒素的elisa试剂盒的制备及检测方法
CN104693304A (zh) * 2015-02-13 2015-06-10 深圳雅臣生物科技有限公司 抑灭霉菌毒素的基因工程重组高纯度抗霉菌毒素单抗和复合单抗制备方法及其组合制剂
CN104991070A (zh) * 2015-06-25 2015-10-21 浙江大学 量子点阳离子交换信号放大技术检测真菌毒素的方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009068195A2 (en) * 2007-11-29 2009-06-04 Bayer Cropscience Ag Method for reducing mycotoxin contamination in maize
CN101661043A (zh) * 2009-09-27 2010-03-03 上海交通大学 用胶体金免疫层析试验检测伏马毒素的方法
CN102455356A (zh) * 2010-10-29 2012-05-16 中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所 一种葡萄球菌肠毒素和伏马菌素的免疫芯片检测方法
CN102879570A (zh) * 2012-09-25 2013-01-16 南京师范大学 一种用光子晶体微球流式芯片检测真菌毒素的方法
CN103792356A (zh) * 2012-11-04 2014-05-14 江苏维赛科技生物发展有限公司 检测伏马毒素的elisa试剂盒的制备及检测方法
CN104693304A (zh) * 2015-02-13 2015-06-10 深圳雅臣生物科技有限公司 抑灭霉菌毒素的基因工程重组高纯度抗霉菌毒素单抗和复合单抗制备方法及其组合制剂
CN104991070A (zh) * 2015-06-25 2015-10-21 浙江大学 量子点阳离子交换信号放大技术检测真菌毒素的方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MOHAN,S等: "Green synthesis of yellow emitting PMMA-CdSe/ZnS quantum dots nanophosphors", 《MATERIALS SCIENCE IN SEMICONDUCTOR PROCESSING》 *
刘富华等: "量子点制备与表面修饰", 《化学通报》 *
周耀峰等: "量子点荧光微球免疫层析试纸条定量检测玉米中赭曲霉毒素A", 《分析化学》 *
周长华灯: "相转移方法制备水溶性CdSe/ZnS荧光微球", 《2011中国材料研讨会论文摘要集》 *
董春红等: "双亲性高分子PMAO超声乳化法改性量子点的制备", 《天津市生物医学工程学会第三十三届学术年会论文集》 *
金丽等: "无机/有机掺杂CdTe/PMMA的合成", 《吉林化工学院院报》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109633144A (zh) * 2018-12-28 2019-04-16 南昌大学 一种以聚集诱导发光荧光微球为信标载体制备的荧光免疫层析试纸条
CN109633144B (zh) * 2018-12-28 2020-07-14 南昌大学 一种以聚集诱导发光荧光微球为信标载体制备的荧光免疫层析试纸条
CN111607575A (zh) * 2020-04-07 2020-09-01 天津科技大学 一种转氨酶phta、制备方法和应用
CN111607575B (zh) * 2020-04-07 2022-10-04 天津科技大学 一种转氨酶phta、制备方法和应用
CN118226046A (zh) * 2024-05-24 2024-06-21 广州瑞辉生物科技股份有限公司 一种肌钙蛋白i检测试剂盒及制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN106645686B (zh) 2018-08-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106546748B (zh) 一种以量子点荧光微球为竞争抗原载体的黄曲霉毒素b1检测方法
WO2022104534A1 (zh) 一种用于化学发光免疫法的试剂盒及其制备方法和应用
FI114826B (fi) Sidontamääritys, jossa käytetään häntäryhmiä sisältäviä sidonta-aineita
CN104897901B (zh) 一种基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测he4的方法
CA2217818C (en) Chemiluminescent immunoassay for antibody detection
CN104105965A (zh) 侧向流和相关免疫测定中的信号放大
CN105717033B (zh) 一种流式细胞仪定量检测蛋白质浓度的方法
CN106568967B (zh) 一种针对赭曲霉毒素a的灵敏检测方法
Li et al. Comparison of monomeric and polymeric horseradish peroxidase as labels in competitive ELISA for small molecule detection
JPS6188155A (ja) フイコビリタンパク質による螢光エネルギ−転位
CN102411050A (zh) 多种小分子化合物的同步量子点荧光免疫检测法及试剂盒
CN106645686B (zh) 一种针对伏马毒素b1的灵敏检测方法
CN112362867A (zh) 一种使用聚集诱导发光联合免疫磁珠的检测方法及其试剂盒
WO2002090961A2 (en) Systems and methods for detection of analytes in biological fluids
CN109164255A (zh) 一种超灵敏检测小分子物质的方法
CN106443003A (zh) 基于适配体特异识别的荧光淬灭试纸条及制备方法与应用
CN106568949A (zh) 一种基于直接竞争荧光免疫分析的小分子半抗原检测方法
CN111474340B (zh) 一种用于新型冠状病毒检测的酶标记的抗原、制备方法及试剂盒与应用
CN107589249A (zh) 用于通过免疫复合物转移法检测被检物质的抗体试剂及其制造方法、以及该抗体试剂的用途
CN103026230B (zh) 共偶联以控制免疫测定中试剂的反应性
CN107561268A (zh) 一种基于智能型纳米发光微粒标记放大的化学发光免疫分析法及其应用
JPH06207937A (ja) 多価リガンドを使用した高感度凝集アッセイ
JPH0614046B2 (ja) 生物学的流体の螢光イムノアツセイ用基材
CN111504959B (zh) C肽稀土荧光微球试剂盒及其检测卡和制备方法
CN106568752B (zh) 一种灵敏检测玉米赤霉烯酮的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant