CN104991070A - 量子点阳离子交换信号放大技术检测真菌毒素的方法 - Google Patents

量子点阳离子交换信号放大技术检测真菌毒素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物工程领域，旨在提供一种量子点阳离子交换信号放大技术检测真菌毒素的方法。该方法是利用羧基修饰的水溶性硒化镉/硫化锌量子点对真菌毒素单克隆抗体进行标记，使量子点上的羧基与抗体氨基在偶联剂的作用下形成稳定的形成量子点标记的真菌毒素单克隆抗体；然后以竞争ELISA模式对真菌毒素进行检测，并采用阳离子交换信号放大技术，最终对反应后的荧光信号进行分析，实现真菌毒素的快速定性检测和定量分析。本发明在提高检测灵敏度和稳定性的同时，缩短了检测的时间，检测真菌毒素时仅需45min。对待检的真菌毒素的检测灵敏度可以达到皮克水平；本发明中使用的量子点合成方便，成本低。具有高效、快捷、灵敏度高、检测信号稳定等优点。

Description

量子点阳离子交换信号放大技术检测真菌毒素的方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种基于量子点阳离子交换和信号放大技术检测真菌毒素的方法。
背景技术
生物毒素又称为天然毒素，是指来源于生物，包括动物、植物、微生物产生的对其它生物物种有毒害作用并不能自身复制的各种化学物质。人类对生物毒素的最早体验源于频发的食物中毒事件，而引起食物中毒的大部分均为生物毒素，并且以微生物毒素最常见。微生物毒素包括蛋白类毒素和真菌毒素，其中真菌毒素是由真菌产生的小分子次级代谢产物，可诱发多种疾病的产生，是粮食和饲料中的重要污染物，常见的黄曲霉毒素B1(AFB1)、赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)等均有致癌、致畸、致突变等作用，因此建立微生物毒素快速准确灵敏的检测方法，日益成为食品安全领域的重要研究内容，受到社会各界的高度重视。
真菌毒素的常规检测手段主要包括仪器分析法和酶联免疫吸附法(Enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)，其中仪器分析法因设备昂贵、操作复杂等缺点无法大面积推广使用。基于抗原抗体反应的ELISA检测方法操作流程相对简单，现阶段已成为实验室诊断的常规手段，但其灵敏度和稳定性容易受到众多因素的干扰，尤其是传统基于辣根过氧化物酶(HRP)的酶催化显色法，在定性和定量检测时常受到酶标试剂、显色时间、酶催化底物信号稳定性等诸多因素的制约，影响了结果的均一性和准确性。同时酶标法检测灵敏度有限，无法做到痕量检测。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种基于量子点阳离子交换和信号放大技术检测真菌毒素的方法。
为解决技术问题，本发明的解决方案是：
提供一种基于量子点阳离子交换和信号放大检测真菌毒素的方法，是利用羧基修饰的水溶性硒化镉/硫化锌量子点(CdSe/ZnS，CdSe为核心，ZnS为壳层，表面由疏水配体包裹，最后包覆一层聚合物达到水溶性状态，经过羧基官能团修饰后，可与特定生物分子进行共价偶联)对真菌毒素单克隆抗体进行标记，使量子点上的羧基与抗体氨基在偶联剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的作用下形成稳定的形成量子点标记的单克隆抗体；然后以竞争ELISA模式对真菌毒素进行检测，并采用阳离子交换信号放大技术对结果进行分析，实现对真菌毒素的定性检测和定量分析。
本发明中，所述的阳离子交换信号放大技术是指：通过阳离子交换方法置换出量子点标记的真菌毒素单克隆抗体中的Cd2+，利用罗丹明(Rhod-5N)对Cd2+极度敏感产生荧光的原理进行信号放大，并通过全波长酶标仪(购自美国Molecular Devices；型号M2)对荧光信号进行检测。
本发明中，所述的偶联剂是1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)。
本发明中，所述真菌毒素是赭曲霉毒素、黄曲霉毒素、伏马毒素、呕吐毒素或玉米赤霉烯酮等中的任意一种。
本发明的实现原理描述：
本发明利用量子点成分CdSe在Ag2+存在的条件下可以和Ag2+发生阳离子交换反应，生成更稳定的AgSe纳米晶体和Cd2+，并利用荧光染料Rhod-5N对Cd2+极其敏感的这一特性，设计了基于量子点阳离子交换技术的检测真菌毒素的方法，其下限可以达到皮克水平。
本发明采用量子点取代常规的辣根过氧化物酶(HRP)对抗体进行标记，并根据量子点的化学成分特性，利用阳离子交换技术对最终的检测信号进行放大，使得检测的灵敏度大大提高，同时避免了常规ELISA检测过程中，上述因素对结果造成的影响，相比酶催化显色，本方法的准确性和稳定性大大提高，并且可以对待检样本中的微生物毒素进行定性和定量分析。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明利用新型荧光材料量子点对真菌毒素单克隆抗体进行标记，开发了真菌毒素快速检测新技术，在提高检测灵敏度和稳定性的同时，缩短了检测的时间，检测真菌毒素时仅需45min。
(2)本发明对待检的真菌毒素的检测灵敏度可以达到皮克水平；本发明中使用的量子点合成方便，成本低。
(3)相对于背景技术，本方法具有高效、快捷、灵敏度高、检测信号稳定等优点。
具体实施方式
发明原理介绍：
本发明通过量子点标记真菌毒素单克隆抗体，采用竞争ELISA模式对真菌毒素进行检测，并通过量子点阳离子交换和信号放大技术，最终检测反应后的荧光信号值，即在最终显色时，加入含荧光探针Rhod-5N和Ag2+的底物(0.01M pH＝7.4醋酸盐缓冲液配置)，量子点成分CdSe在Ag2+存在的条件下可以和Ag2+发生阳离子交换反应，生成更稳定的AgSe纳米晶体和Cd2+，荧光染料Rhod-5N对Cd2+浓度极其敏感，通过酶标仪在激发波长和发射波长分别为551/575的条件下测定荧光数值。通过计算(样本孔荧光值-阴性孔荧光值)/(阳性孔荧光值-阴性孔荧光值)进行定性判断，若比值≤0.9，说明该样本中含有待检真菌毒素，判定为阳性样本，此时可通过设置梯度稀释的真菌毒素标准品与对应的荧光比值绘制标准曲线，对样本中真菌毒素含量进行定量分析。
本发明中，羧基修饰的量子点通常使用商品化的产品，具体的反应浓度依据生产商推荐使用浓度来确定，不同生产商推荐数据略有变化。羧基修饰的量子点在偶联剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的作用下与真菌毒素单克隆抗体形成共价键，标记时所用的真菌毒素单克隆抗体为自制或商品化、纯化后的抗体(经聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝染色鉴定，抗体重链轻链清晰，且占总蛋白浓度的90％以上)。
以下的实施例可以使本专业技术领域的技术人员更全面的了解本发明，但不以任何方式限制本发明。本发明中的方法，具体包括以下步骤：
(1)量子点与真菌毒素单克隆抗体的偶联
取纯化后的真菌毒素单克隆抗体(凝胶电泳鉴定，重链轻链清晰，且占总蛋白浓度的90％以上)，溶解于0.01M、pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中(PBS)；取50μl浓度为8μM的羧基修饰的量子点置于2ml EP管中，加入300μg待标记的真菌毒素单克隆抗体，使反应总体系为400μl；加入抗体后若体积不足，则用10mM的硼酸盐缓冲液补齐；持续混匀反应5min后，加入15μl浓度为10mg/ml的偶联剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)；室温震荡反应2h后，离心去除反应过程中产生的团聚物，上清液经超滤管(购自Millipore，货号UFC503096)浓缩后，用尺寸排阻色谱柱纯化；色谱柱填料为Superdex G200(购自GE公司，货号为17-1043-10)，纯化后的量子点标记的真菌毒素单克隆抗体保存于4℃冰箱，备用；
(2)最佳检测条件的确定
采取竞争ELISA检测模式，即包被真菌类毒素偶联抗原，待检样本与量子点标记的真菌毒素单克隆抗体等体积混匀后加入孔中，37℃恒温培养箱作用45min，洗去非特异性结合；通过阳离子交换和信号放大技术，并使用全波长酶标仪对最终的荧光信号进行检测；
竞争ELISA的最佳检测条件主要包括抗原最佳包被与量子点标记单克隆抗体的最佳使用浓度，该条件可通过棋盘法来确定：以pH＝9.5的碳酸盐缓冲液梯度稀释真菌毒素偶联抗原，包被于白色不透明96孔板，洗涤封闭后，加入梯度稀释的量子点标记的真菌毒素单克隆抗体，与梯度包被的偶联抗原在37℃恒温培养箱中避光条件下交叉作用45min后，洗涤后置于吸水纸上扣干，加入200μl显色液；显色液以pH＝7.4的0.01M醋酸盐缓冲液配置，分别含5μM/L Rod-5N(购自life technologies，货号R-1420)和300μM/LAg2+(AgNO3，国药集团，货号10018461)；室温放置5min后，全波长酶标仪在激发波长与发射波长分别为551/575的条件下读取荧光数值；
选取不同荧光值所对应的抗原包被与量子点标记抗体作用浓度，分别绘制标准抑制曲线，即白色不透明96孔板包被毒素偶联抗原，洗涤封闭后，取50μl梯度稀释的真菌毒素标准品与50μl稀释后的量子点标记单克隆抗体进行预混后加入孔中，37℃培养箱避光作用45min，并同时设置阴性与阳性对照(阴性对照：50μl真菌毒素标准品稀释液与50μl量子点标记的真菌毒素单克隆抗体稀释液混匀后加入反应孔；阳性对照：50μl真菌毒素标准品稀释液与50μl量子点标记的真菌毒素单克隆抗体混匀后加入反应孔中)，作用后洗涤并置于吸水纸上扣干，加入200μl显色液，室温放置5min后，全波长酶标仪在激发波长与发射波长分别为551/575的条件下读取荧光数值，以真菌毒素标准品浓度对数为横坐标，以对应的荧光比值(标准品孔荧光值-阴性孔荧光值)/(阳性孔荧光值-阴性孔荧光值)为纵坐标绘制标准抑制曲线，对所得的若干标准曲线进行分析，分别计算半数抑制率即荧光比值为0.5(IC50)所对应的真菌毒素标准品浓度，选取最低值所对应的抗原包被与量子点标记单克隆抗体作用浓度作为检测时的最佳浓度；
(3)标准曲线的绘制与实际样本的检测
将偶联抗原用pH＝9.5的碳酸盐缓冲液稀释到确定的最佳包被浓度，加入到96孔板中，100μl/孔，4℃放置过夜，洗涤封闭后，分别取50μl的待检样品、梯度稀释的真菌毒素标准品与50μl最佳浓度的量子点标记单克隆抗体预混，然后加入孔中37℃培养箱避光作用45min，洗涤并置于吸水纸上扣干，加入200μl显色液；室温作用5min后以全波长酶标仪进行荧光检测，激光波长发射波长分别为551nm和575nm；将得到的梯度稀释的标准品对应的荧光比值拟合成标准曲线即以真菌毒素标准品的浓度对数为横坐标，以对应的荧光比值(标准品孔荧光值-阴性孔荧光值)/(阳性孔荧光值-阴性孔荧光值)为纵坐标绘制标准抑制曲线，对待检样品中是否含有目标真菌毒素进行判定；若比值>0.9即抑制率＜10％，判定为阴性；如比值≤0.9即抑制率＞10％，判定为阳性；若为阳性，则根据绘制的标准曲线对样本中真菌毒素含量进行定量分析。
本发明中，所述待检测的真菌毒素是黄曲霉毒素B1(AFB1)、赭曲霉毒素A(OTA)、伏马毒素(FB1)、呕吐毒素(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)等中的任意一种。
以下的实施例可以使本专业技术领域的技术人员更全面的了解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例：采用竞争ELISA对赭曲霉毒素OTA的进行快速检测
以赭曲霉OTA单克隆抗体和量子点(羧基修饰的水溶性量子点，组成成分为CdSe/ZnS，购自武汉珈源量子点技术开发有限公司，货号Q2625)为例，阐述基于量子点阳离子交换技术快速检测赭曲霉毒素OTA的方法：
(1)量子点与赭曲霉毒素A单克隆抗体的偶联
取纯化后的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体(鼠源，饱和硫酸铵纯化后，纯度为90％以上，浓度为1.5mg/ml，溶剂为0.01M磷酸盐缓冲液PBS，pH＝7.4)。取浓度为8μM的羧基修饰的量子点50μl置于2ml EP管中，然后加入10mM的硼酸盐缓冲液135μl后持续混匀，加入200μl上述纯化后的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体，持续混匀，反应5min后，加入15μl浓度为10mg/ml的偶联剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液，室温震荡反应2h后，12000rpm/min离心去除反应中产生的团聚物，上清液经超滤管(购自Millipore，货号UFC503096)浓缩后，用尺寸排阻色谱柱纯化，色谱柱填料为Superdex G200(购自GE公司，货号为17-1043-10)，纯化后的量子点标记的真菌毒素单克隆抗体保存于4℃，备用。
(2)最佳检测条件的确定
采取竞争ELISA检测模式，并通过棋盘法确定最佳抗原包被与量子点标记单克隆抗体的作用浓度。方法：梯度稀释(碳酸盐缓冲液，pH＝9.5)偶联抗原OTA-OVA，包被于白色不透明96孔板(购自于Corning，货号3922)，100μl/孔(偶联抗原浓度依次为：2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625μg/ml)，4℃包被过夜，用含0.05％(v/v)Tween20的0.01M磷酸盐缓冲液(PBST)洗涤后，用含5％(w/v)脱脂奶粉(PBST配置)37℃封闭2h后洗涤置于吸水纸上扣干，加入量子点标记的赭曲霉毒素OTA单克隆抗体梯度稀释，100μl/孔(浓度依次为：10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125μM/L，以量子点浓度计算)与梯度包被的偶联抗原在37℃恒温培养箱中避光交叉作用45min后，洗涤并置于吸水纸上扣干，加入200μl显色液(pH＝7.4的0.01M醋酸盐缓冲液配置，含5μM/LRod-5N和300μM/L Ag2+)室温放置5min后，酶标仪在激发波长与发射波长分别为551/575的条件下读取荧光数值；
选取不同抗原包被浓度与量子点标记抗体作用浓度组合，按照步骤中所述方法分别绘制标准抑制曲线，选取对应半数抑制率(IC50)最低的抗原包被与量子点标记抗体作用浓度作为检测时的最佳抗原包被与抗体作用浓度，本实验中OTA-OVA的最佳包被浓度为0.25μg/ml，量子点标记单克隆抗体的最佳浓度为0.625μM/L，相对应的IC50为0.35ng/ml。
(3)实际样本中赭曲霉毒素A的定性检测与定量分析
将偶联抗原OTA-OVA用碳酸盐缓冲液(pH＝9.5)稀释到0.25μg/ml，加入到96孔板中，100μl/孔，4℃放置过夜。按上述方法洗涤封闭后，取待检样品、梯度稀释的赭曲霉毒素OTA标准品(均为50μl)与稀释后的量子点标记单克隆抗体(50μl，1.25μM/L)预混后加入孔中，每个浓度设置3个平行，37℃培养箱避光作用45min后，加入200μl显色液(pH＝7.4的0.01M醋酸盐缓冲液配置，含5μM/L Rod-5N和300μM/L Ag2+)室温放置5min后进行荧光检测，激光波长发射波长分别为551/575，以梯度稀释的赭曲霉毒素OTA标准品浓度对数为横坐标，相对应的荧光比值为纵坐标绘制标准曲线，对样本中赭曲霉毒素进行定性检测和定量分析.
我们对市场中30份玉米与大豆样本进行了检测，结果显示其中7份样本呈赭曲霉毒素OTA阳性(含量≥1.45μg/kg)，与进口试剂盒(购自德国拜发，货号R1311)符合率为100％，且经过定量检测，含量在1.9μg/kg-7.5μg/kg之间，灵敏度已达到国家标准(5μg/kg)，可用于食品与饲料中赭曲霉毒素A的快速定性检测与定量分析。
特别说明：
虽然本发明的实施例中对量子点阳离子交换信号放大技术运用于真菌毒素的检测列举一例，并没有列举全部生物分子的具体内容，但是，对于真菌毒素及其各自对应的多克隆抗体或单克隆抗体均属于本领域技术人员公知常识。在本发明提供所述的基于量子点阳离子交换信号放大技术检测真菌毒素的方法之后，本领域技术人员能够根据其掌握的技能举一反三，实现检测其他真菌毒素的目的。
以上是结合具体实施例子对本发明所做的进一步描述。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的前提下，本发明及其应用还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (5)

1.量子点阳离子交换信号放大技术检测真菌毒素的方法，其特征在于，是利用羧基修饰的水溶性硒化镉/硫化锌量子点对真菌毒素单克隆抗体进行标记，使量子点上的羧基与抗体氨基在偶联剂的作用下形成稳定的形成量子点标记的真菌毒素单克隆抗体；然后以竞争ELISA模式对真菌毒素进行检测，并采用阳离子交换信号放大技术，最终对反应后的荧光信号进行分析，实现真菌毒素的快速定性检测和定量分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的阳离子交换信号放大技术是指：通过阳离子交换方法置换出量子点-抗体偶联物中的Cd2+，利用罗丹明对Cd2+极度敏感产生荧光的原理进行信号放大，并通过全波长酶标仪对荧光信号进行检测。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的偶联剂是1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述真菌毒素是赭曲霉毒素、黄曲霉毒素、伏马毒素、呕吐毒素或玉米赤霉烯酮等中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)量子点与真菌毒素单克隆抗体的偶联
取纯化后的真菌毒素单克隆抗体，溶解于0.01M、pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中；取50μl浓度为8μM的羧基修饰的量子点置于2ml EP管中，加入300μg待标记的真菌毒素单克隆抗体，使反应总体系为400μl；加入抗体后若体积不足，则用10mM的硼酸盐缓冲液补齐；持续混匀反应5min后，加入15μl浓度为10mg/ml的偶联剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；室温震荡反应2h后，离心去除反应过程中产生的团聚物，上清液经超滤管浓缩后，用尺寸排阻色谱柱纯化；色谱柱填料为Superdex G200，纯化后的量子点标记的真菌毒素单克隆抗体保存于4℃冰箱，备用；
(2)最佳检测条件的确定
采取竞争ELISA检测模式，即包被真菌类毒素偶联抗原，待检样本与量子点标记的真菌毒素单克隆抗体等体积混匀后加入孔中，37℃恒温培养箱作用45min，洗去非特异性结合；通过阳离子交换信号放大技术，全波长酶标仪对荧光信号进行检测；
通过棋盘法确定竞争ELISA的最佳抗原包被与量子点标记单克隆抗体的最佳使用浓度：以pH＝9.5的碳酸盐缓冲液梯度稀释偶联抗原，包被白色不透明96孔板，洗涤封闭后，加入梯度稀释的量子点标记的真菌毒素单克隆抗体，与梯度包被的偶联抗原在37℃恒温培养箱中避光交叉作用45min后洗涤，置于吸水纸上扣干，加入200μl显色液，室温放置5min后，全波长酶标仪在激发波长与发射波长分别为551/575的条件下读取荧光数值；显色液是以0.01M，pH＝7.4的醋酸盐缓冲液配置，含5μM/L Rod-5N和300μM/L Ag2+；
选取不同荧光值所对应的抗原包被与量子点标记单克隆抗体作用浓度，分别绘制标准抑制曲线，即白色不透明96孔板包被毒素偶联抗原，洗涤封闭后，分别取50μl梯度稀释的真菌毒素标准品与50μl稀释后的量子点标记单克隆抗体进行预混后加入到反应孔中，37℃培养箱避光作用45min，并同时设置阴性与阳性对照：阴性对照为50μl真菌毒素标准品稀释液与50μl量子点标记的真菌毒素单克隆抗体稀释液混匀后加入反应孔中，阳性对照为50μl真菌毒素标准品稀释液与50μl量子点标记的真菌毒素单克隆抗体混匀后加入反应孔；作用后洗涤并置于吸水纸上扣干，加入200μl显色液，室温放置5min后，全波长酶标仪在激发波长与发射波长分别为551/575的条件下读取各反应孔荧光数值，以真菌毒素标准品浓度对数为横坐标，以对应的荧光比值(标准品孔荧光值-阴性孔荧光值)/(阳性孔荧光值-阴性孔荧光值)为纵坐标绘制标准抑制曲线，对得到的若干标准曲线进行分析，计算半数抑制率即荧光比值为0.5，即IC50时所对应的真菌毒素标准品浓度，选择最低值所对应的抗原包被与量子点标记抗体作用浓度作为检测时的最佳浓度；
(3)标准曲线的绘制与实际样本的检测
将偶联抗原用pH＝9.5的碳酸盐缓冲液稀释到最佳包被浓度，包被于白色不透明96孔板中，100μl/孔，4℃放置过夜，洗涤封闭后，分别取50μl的待检样品、梯度稀释的真菌毒素标准品与50μl最佳浓度的量子点标记单克隆抗体预混，然后加入孔中，37℃培养箱避光作用45min，洗涤后并置于吸水纸上扣干，加入200μl显色液，室温作用5min后以全波长酶标仪进行荧光检测，激光波长发射波长分别为551nm和575nm；以梯度稀释的标准品浓度对数为横坐标，对应的荧光比值为纵坐标拟合成标准曲线，对待检样品中是否含有目标真菌毒素进行定性判定；若比值>0.9即抑制率＜10％，则判定为阴性样本；如比值≤0.9即抑制率＞10％，判定为阳性样本；若为阳性，则可根据绘制的标准曲线对样本中真菌毒素含量进行定量分析。
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