CN111089956A - 三重定量检测镰刀菌毒素的荧光微球免疫层析试纸条、其制备方法和应用 - Google Patents

三重定量检测镰刀菌毒素的荧光微球免疫层析试纸条、其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了三重定量检测镰刀菌毒素的荧光微球免疫层析试纸条、其制备方法和应用，包括：将分别包被有ZEN‑BSA、DON‑BSA、FB1‑BSA的检测线和羊抗鼠IgG抗体的控制线的硝酸纤维素膜、喷涂有FB1、DON、ZEN的单克隆抗体‑荧光微球标记物混合物的结合垫、样品垫和吸水垫按顺序依次粘贴于底板上，组装后切小条得到。本发明将三种镰刀菌毒素的检测整合在一个试纸条上，形成的多通道检测效率高，且所得试纸条特异性好、灵敏度高，操作简单，非专业人员也可使用，满足粮食储存销售机构、出入境检疫、海关、生产企业、监督部门等快速准确地判断FB1、DON和ZEN毒素具体含量的要求，便于基层推广和运用。

Description

三重定量检测镰刀菌毒素的荧光微球免疫层析试纸条、其制 备方法和应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，是一种利用量子点组合而成的荧光微球作为信号放大材料且同时检测伏马毒素B1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮的免疫层析试纸条、其制备方法和应用。
背景技术
真菌毒素是真菌生长过程中产生的次级代谢产物，对人和动物都具有一定的危害。常见的真菌毒素主要来源于曲霉菌属(Aspergillus)、青霉菌属(Penicillium)和镰刀菌属(Fusarium)，迄今为止已经发现400多种真菌毒素。而镰刀菌生长过程中会产生多种毒素，其中伏马菌素B1(Fumonisins B1,FB1)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)和玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)均属于常见的镰刀菌属毒素，广泛分布于自然界中，主要污染玉米、小麦、大麦和燕麦等多种农作物及其制品。不同的镰刀菌具有不同的理化性质和毒理作用，但他们均严重危害着人和动物的健康，可引起不同组织器官、免疫、神经、生殖系统的损伤。
镰刀菌毒素对人和动物健康和经济的发展的影响是巨大的，因此国际上各个组织和国家均制定了相关的限量标准，并且研发出许多的检测方法以监控其污染程度，以保证食品的安全。目前，有关镰刀菌素的检测方法主要有两种：色谱法和免疫学方法，色谱法主要包括高效液相色谱法、气相色谱法、液相色谱-质谱联用法等，优点是精确、灵敏度高，但需依靠昂贵的仪器和专业的操作人员，且仅限于实验室检测；免疫学方法则相对较简单，它是基于抗原抗体反应的检测方法，对仪器设备的要求相对较低，但也相对依赖专业人员的操作。免疫学方法种类繁多，但成功用于市场的并不多，其中酶联免疫吸附试剂盒是其中一种，但操作较复杂，耗时较长，依赖专业操作人员和配套的仪器，不适合现场检测。
基于胶体金免疫层析法的试纸条则能克服上述方法的不足，胶体金免疫层析法同样是利用抗原抗体反应的原理，单克隆抗体-胶体金标记物与固定在硝酸纤维素膜上的抗原或抗体形成复合物被截留聚集而显色，不需要特定的酶和底物显色，也不需要抗原抗体之间的较长时间的物理吸附，简单又快速，仅需根据显色与否判定阴阳性结果，安全有效，简单方便，已成功用于临床医学和食品安全领域，如早早孕检测试纸和瘦肉精检测试纸。然而，目前商品化的胶体金免疫层析试纸条绝大多数为单一检测，且灵敏度有限。荧光微球是是由高质量的CdSe/ZnS量子点和生物相容性高分子通过自组装的方式制备得到，通过纳米球包覆将量子点的荧光信号放大，可以明显提高免疫检测灵敏度，也解决量子点不稳定的问题，基于荧光微球的同时检测三种镰刀菌毒素(FB1、DON和ZEN)的免疫层析试纸条尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用量子点组合而成的荧光微球作为信号放大材料且同时检测伏马毒素B1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮的免疫层析试纸条，该试纸条对FB1、DON和ZEN的特异性好，灵敏度高，检测速度快，且简单易操作，非专业人员也可使用，其技术方案是：
三重定量检测镰刀菌毒素的荧光微球免疫层析试纸条，由下到上依次包括底板、硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫和吸水垫；其中：
所述三重定量检测的镰刀菌毒素为FB1、DON和ZEN；
所述硝酸纤维素膜按照水平方向依次喷涂包被有羊抗鼠IgG抗体作为控制线(C线)、和ZEN-BSA、DON-BSA和FB1-BSA的检测线(依次为T1～T3线)；
所述结合垫喷涂有由FB1、DON和ZEN的单克隆抗体-荧光微球标记物按比例混合均匀的混合物，且喷涂量为2.5～3.5μL/cm。
在某些实施方案中，所述结合垫内FB1、DON和ZEN的单克隆抗体-荧光微球标记物的体积比为1:1:1。
在某些实施方案中，所述荧光微球的直径为100nm，其激发波长和发射波长分别为365nm和610nm，紫外灯照射下肉眼观察其荧光颜色是红色，其由CdSe/ZnS量子点和生物相容性高分子聚苯乙烯马来酸酐共聚物通过自组装制备得到，且所述CdSe/ZnS量子点包裹于所述聚苯乙烯马来酸酐共聚物内，所述荧光微球表面带有羧基基团。
在某些实施方案中，所述试纸条的宽度为4mm。
本发明的另一目的还在于提供上述荧光微球免疫层析试纸条的制备方法，将三种毒素的检测整合在一个检测试纸条上，形成多通道检测，只需一次操作即可以同时检测三种毒素，减少使用单一检测方法检测三种毒素带来的人力、物力的损失，提高效率。其技术方案为：
上述荧光微球免疫层析试纸条的制备方法，包括如下步骤：
(1)分别制备FB1、DON和ZEN的单克隆抗体-荧光微球标记物，包括子步骤：
a)分别将0.5～1μgFB1、DON和ZEN的三种单克隆抗体、10μg荧光微球和0.25μg N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)加入至pH值为6的磷酸盐缓冲盐溶液中，混匀，于37℃振荡孵育10～20min；
b)加入10wt.％BSA于上述反应体系中至其终浓度为0.1wt.％，混匀，于37℃振荡孵育10～20min；
c)12000rpm离心10min，弃上清，沉淀重悬于含0.9％氯化钠、1％BSA和0.09％叠氮钠的储存液中，超声20s，于4℃保存；
(2)制备结合垫，包括子步骤：
d)将结合垫于含6％海藻糖、1％BSA、0.5％PvPk30、0.5％Tween20和0.5％Tetronic1307的10mM pH 7.4的PBS缓冲液中浸泡30min，取出，60℃真空干燥2h；
e)将步骤⑴中制备的三种单克隆抗体-荧光微球标记物混匀后喷涂到上述结合垫上，喷涂量为2.5～3.5μL/cm，37℃真空干燥2h，密封；
(3)硝酸纤维素膜上包被抗原，包括：将浓度均为50～500μg/mL的FB1-BSA、DON-BSA、ZEN-BSA和羊抗鼠IgG抗体分别喷涂在硝酸纤维素膜上，喷涂量为0.8μL/cm，于37℃真空干燥过夜，密封；
(4)试纸条组装，包括子步骤：
f)将样品垫于含6％海藻糖、1％BSA、0.05％Tetronic1307、0.5％PvPk30、0.5％Tween20和0.05％叠氮钠的10mM pH7.4的PBS缓冲液中浸泡30min，取出,于60℃真空干燥2h，密封；
g)将喷有FB1-BSA、DON-BSA、ZEN-BSA和羊抗鼠IgG抗体的硝酸纤维素膜、结合垫和吸水垫按顺序粘贴在所述底板上，组装后按照宽度优选为4mm切小条得到。
本发明还提供上述荧光微球免疫层析试纸条同时定量检测镰刀菌毒素FB1、DON和ZEN的方法，包括以下步骤：
(ⅰ)5g待测样品加入20mL甲醇和水体积比为6：4的萃取液内，于摇床中剧烈震荡30min，静置30min，上清液于6000rpm离心10min，所得上清用0.22μm聚四氟乙烯滤膜过滤，并用含5％甲醇、0.5％PvPk30和0.5％Tween20的10mM PBS缓冲液稀释15倍，稀释液于12000rpm离心10min，收集上清，得到样品液；
(ⅱ)取100μL处理后的样品液滴在所述荧光微球免疫层析试纸条的样品垫上，25min后读取所述硝酸纤维素膜上各检测线(T1～T3线)和控制线上的荧光强度；
(ⅲ)根据上述检测线与控制线荧光强度的比值F＝T/C计算F/Fo，再根据F/Fo值和标准曲线得出待测样品中真菌毒素浓度，其中Fo为标准品浓度为0/0/0ng/mL时的T/C值。
在某些实施方案中，FB1的检测浓度范围为2.295～69.867ng/mL，和
DON的检测浓度范围0.465～16.19ng/mL，和
ZEN的检测浓度范围为0.295～2.575ng/mL。
本发明的再一目的在于提供上述荧光微球免疫层析试纸条的应用，用于谷物中FB1、DON和ZEN毒素含量的检测，满足粮食储存销售机构、出入境检疫、海关、生产企业和监督部门快速准确判断FB1、DON和ZEN毒素含量的要求，便于基层推广和运用。
需要特别说明的是，以上所述百分浓度(％)除特别之处外，均指g/mL。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明的试纸条特异性好，灵敏度高，同时检测FB1、DON和ZEN时，试纸条的各抗原检测线不与其他抗体发生交叉反应，且不与常见的真菌毒素赭曲霉素A和黄曲霉毒素B1反应。
2、检测结果准确、可定量，荧光微球比量子点等荧光材料更稳定，检测样品后可根据荧光值和标准曲线估算出样品中各毒素的含量，并可以和限量标准对比。
3、抗体使用量少，荧光微球是由高质量的CdSe/ZnS量子点和生物相容性高分子通过自组装的方式制备得到，通过纳米球包覆将量子点的荧光信号放大，可以明显提高免疫检测灵敏度；而且微球表面修饰有羧基官能团，偶联抗体简单且快速，一小时内即可完成，节约抗体用量的同时提高灵敏度。
4、本发明将三种毒素的检测整合在一个检测试纸条上，形成多通道检测，检测方法速度快，操作简单，不需经培训的专业人员就可使用本发明方法进行检测，满足粮食储存销售机构、出入境检疫、海关、生产企业、监督部门等快速准确地判断FB1、DON和ZEN毒素具体含量的要求，便于基层推广和运用。
附图说明
图1为本发明中试纸条的结构示意图。
图2为本发明中试纸条同时检测FB1、DON和ZEN的标准曲线图。
具体实施方式
本发明将通过以下实施例作进一步说明。
实施例1制备三重定量检测镰刀菌毒素荧光免疫层析试纸条
1、FB1、DON和ZEN单克隆抗体-荧光微球标记物的制备。分别取10ug荧光微球、0.5～1ug单克隆抗体和一定比例的EDC(荧光微球与EDC的质量比为40：1)加入至400uL磷酸盐缓冲盐溶液中(pH＝6)，然后混匀于37℃振荡孵育10～20min，加入10％BSA至其终浓度为0.1％，混匀后于37℃振荡孵育10～20min；12000rpm离心10min，弃上清，将FB1、DON和ZEN单克隆抗体-荧光微球沉淀重悬于含0.9％氯化钠、1％BSA和0.09％叠氮钠的储存液中，超声20s后于4℃储存备用。
2、金标抗体喷涂至金标垫上。在将金标抗体包被至金标垫上前，需对金标垫进行处理：将结合垫于含6％海藻糖、1％BSA、0.5％PvPk30、0.5％Tween20和0.5％Tetronic1307的10mM PBS缓冲液(pH7.4)中浸泡30min，取出后60℃真空干燥2h。然后将制备的单克隆抗体-荧光微球标记物喷涂到结合垫上，喷涂量为2.5～3.5μL/cm，然后37℃真空干燥2h，密封。
3、硝酸纤维素膜上的抗原包被。将浓度为50μg/mL的FB1-BSA、100μg/mLDON-BSA、300μg/mLZEN-BSA和500μg/mL的羊抗鼠IgG抗体分别喷涂在同一硝酸纤维素膜上，各检测线和控制线之间间隔3.5mm，喷涂量均为0.8μL/cm，37℃真空过夜干燥，密封。
4、组装试纸条。将样品垫于含6％海藻糖、1％BSA、0.05％Tetronic1307、0.5％PvPk30、0.5％Tween20和0.05％叠氮钠的10mM pH7.4的PBS缓冲液中浸泡30min，取出后于60℃真空干燥2h，密封。
如图1所示，试纸条由下到上依次包括底板、硝酸纤维素膜、结合垫(金标垫)、样品垫、吸水垫；其中底板的作用是提供组装平台，硝酸纤维素膜上喷涂羊抗鼠IgG抗体作为C线，FB1-BSA喷涂的是T3线，DON-BSA喷涂的是T2线，ZEN-BSA喷涂的是T1线，结合垫则喷有三种混合均匀的单克隆抗体-荧光微球标记物，样品垫提供待测样品加入的位置。按顺序依次将硝酸纤维素膜、吸水纸、结合垫和样品垫粘贴在底板上，然后切成4mm的宽度，得到三重定量检测镰刀菌毒素荧光微球免疫层析试纸条。
实施例2建立标准曲线
配制一系列浓度(0/0/0、0.47/0.195/0.094、0.94/0.39/0.188、1.875/0.78/0.375、3.75/1.56/0.75、7.5/3.12/1.25、15/6.25/2.5、30/12.5/5、60/25/10、120/50/20、240/100/40ng/mL)的FB1、DON和ZEN标准品，配制的溶液为含5％甲醇、0.5％Tween20、0.5％PvP k30的10mM PBS溶液。取100μL标准溶液滴在实施例1制备的试纸条样品垫上，25min后测量试纸条上各检测线和控制线上的荧光值，得到检测线和控制线上荧光强度比值(F＝T/C)，然后以标准系列浓度值的自然对数(LogC)为横坐标和荧光强度值百分比(F/Fo)为纵坐标建立相应的标准曲线，如图2所示，其中Fo为标准品浓度为0/0/0ng/mL时的T/C值。
实施例3样品检测和结果分析
5g样品加入20mL萃取液(甲醇：水＝60：40，v/v)，摇床中剧烈震荡30min。静置30min后，将上清液在6000rpm离心10min，然后将上清用0.22μm聚四氟乙烯滤膜过滤，并用含0.5％PvPk30、0.5％Tween20的10mM PBS稀释15倍，最后将稀释后的样品再次于12000rpm离心10min，收集上清。取100μL处理后的样品溶液滴在试纸条样品垫上，25min后测量试纸条上个检测线和控制线上的荧光值，根据对应的荧光值和标准曲线计算出样品中各个毒素的含量，如图2所示。
结果表明，上述试纸条同时检测FB1、DON和ZEN的IC50值分别为12.66ng/mL(FB1)、2.79ng/mL(DON)和0.87ng/mL(ZEN)，相应的检测浓度范围分别为2.295～69.867ng/mL(137.7～4192μg/kg)、0.465～16.19ng/mL(27.9～971.4μg/kg)和0.295～2.575ng/mL(17.1～154.5μg/kg)，且可直接检测样品中的FB1、DON和ZEN，不需要专业培训，操作方便、简单、快速，25min即可获得结果。
实施例4特异性分析实验
按照实施例2中的方法，将赭曲霉毒素A和黄曲霉毒素B1应用于实施例制备的试纸条检测中，结果均出现红色的荧光条带，表明试纸条特异性良好，试纸条的各抗原检测线与赭曲霉毒素A和黄曲霉毒素B1无交叉反应。
综上所述，本发明的方法特异性好，灵敏度高，可同时定量检测，所需时间短，只需25min，不需经培训的专业人员就可使用本发明方法来检测，满足粮食储存销售机构、出入境、海关等检验部门快速、准确地检测出样品中FB1、DON和ZEN毒素含量的要求。本发明的方法只需一次操作即可以同时定量检测三种镰刀菌毒素，减少了使用三种检测方法检测三种毒素带来的人力、物力的损失，便于基层推广和运用。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的产品和制备方法，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.三重定量检测镰刀菌毒素的荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于，由下到上依次包括底板、硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫和吸水垫；其中：
所述三重定量检测的镰刀菌毒素为伏马菌素B1(FB1)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和玉米赤霉烯酮(ZEN)；
所述硝酸纤维素膜按水平方向依次喷涂包被有羊抗鼠IgG抗体作为控制线和ZEN-BSA、DON-BSA和FB1-BSA的各条检测线；
所述结合垫喷涂有由FB1、DON和ZEN的单克隆抗体-荧光微球标记物按比例混合均匀后的混合物，且喷涂量为2.5～3.5μL/cm。
2.根据权利要求1所述的荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于，所述荧光微球的直径为100nm，其激发波长和发射波长分别为365nm和610nm，紫外灯照射下肉眼观察其荧光颜色是红色，其由CdSe/ZnS量子点和生物相容性高分子聚苯乙烯马来酸酐共聚物通过自组装制备得到，且所述CdSe/ZnS量子点包裹于所述聚苯乙烯马来酸酐共聚物内，所述荧光微球表面带有羧基基团。
3.根据权利要求1所述的荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于，所述试纸条的宽度为4mm。
4.权利要求1至3任一项所述荧光微球免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
⑴分别制备FB1、DON和ZEN的单克隆抗体-荧光微球标记物；
⑵预处理样品垫和结合垫，将步骤⑴中制备的三种单克隆抗体-荧光微球标记物按比例混匀后喷涂于所述结合垫上；
⑶在硝酸纤维素膜上分别喷涂包被ZEN-BSA、DON-BSA、FB1-BSA的检测线和羊抗鼠IgG抗体的控制线，于37℃真空干燥；
⑷将步骤(3)干燥后的硝酸纤维素膜、步骤(2)制备的结合垫、处理后的样品垫和吸水垫按顺序依次粘贴于所述底板上，组装后切小条得到。
5.根据权利要求4所述荧光微球免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述FB1、DON和ZEN三种单克隆抗体-荧光微球标记物的制备方法为：
a)分别将0.5～1μgFB1、DON或ZEN的单克隆抗体、10μg荧光微球和0.25μg N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)加入至pH 6的磷酸盐缓冲盐溶液中，混匀，于37℃振荡孵育10～20min；
b)加入10wt.％BSA于上述反应体系中至其终浓度为0.1wt.％，混匀，于37℃振荡孵育10～20min；
c)12000rpm离心10min，弃上清，沉淀重悬于含0.9wt.％氯化钠、1wt.％BSA和0.09wt.％叠氮钠的储存液中，超声20s，于4℃保存。
6.根据权利要求4所述荧光微球免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述结合垫的预处理方法为：将结合垫于含质量浓度分别为6％海藻糖、1％BSA、0.5％PvPk30、0.5％Tween20和0.5％Tetronic1307的10mM pH7.4的PBS缓冲液中浸泡30min，取出，60℃真空干燥2h；
所述样品垫的预处理方法为：将样品垫于含质量浓度分别为6％海藻糖、1％BSA、0.05％Tetronic1307、0.5％PvP k30、0.5％Tween20和0.05％叠氮钠的10mM pH7.4的PBS缓冲液中浸泡30min，取出，60℃真空干燥2h。
7.根据权利要求4所述荧光微球免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述FB1-BSA、DON-BSA、ZEN-BSA和羊抗鼠IgG抗体的浓度均为50～500μg/mL，喷涂量为0.8μL/cm。
8.权利要求1至3任一项所述荧光微球免疫层析试纸条同时定量检测镰刀菌毒素FB1、DON和ZEN的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(ⅰ)5g待测样品加入20mL甲醇和水体积比为6：4的萃取液内，于摇床中剧烈震荡30min，静置30min，上清液于6000rpm离心10min，所得上清用0.22μm聚四氟乙烯滤膜过滤，用含质量浓度分别为5％甲醇、0.5％PvPk30和0.5％Tween20的10mM PBS缓冲液稀释15倍，稀释液于12000rpm离心10min，收集上清，得到样品液；
(ⅱ)取100μL处理后的样品液滴在权利要求1至3任一项所述荧光微球免疫层析试纸条的样品垫上，25min后用荧光免疫层析仪读取所述硝酸纤维素膜上控制线和各检测线的荧光强度；
(ⅲ)根据上述检测线与控制线荧光强度的比值F＝T/C计算F/Fo，再根据F/Fo值和标准曲线得出待测样品中真菌毒素浓度，其中：
Fo为标准品浓度为0时的T/C值。
9.根据权利要求8所述的同时定量检测镰刀菌毒素的方法，其特征在于，
FB1的检测浓度范围为2.295～69.867ng/mL，和
DON的检测浓度范围0.465～16.19ng/mL，和
ZEN的检测浓度范围为0.295～2.575ng/mL。
10.权利要求1至3任一项所述荧光微球免疫层析试纸条同时定量检测谷物中镰刀菌毒素FB1、DON和ZEN的应用。
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