CN114594262B

CN114594262B - 基于双功能融合蛋白的真菌毒素磁化学发光免疫分析试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN114594262B
Application number: CN202210155141.5A
Authority: CN
Inventors: 王松雪; 刘洪美; 叶金; 倪保霞; 陈金男
Original assignee: Academy of National Food and Strategic Reserves Administration
Current assignee: Academy of National Food and Strategic Reserves Administration
Priority date: 2022-02-21
Filing date: 2022-02-21
Publication date: 2022-11-01
Anticipated expiration: 2042-02-21
Also published as: WO2023155876A1; CN114594262A

Abstract

本发明公开了一种基于双功能融合蛋白的真菌毒素磁化学发光免疫分析试剂盒及其应用。该试剂盒包括链霉亲和素磁微粒、生物素标记的真菌毒素抗原、真菌毒素标准品溶液、真菌毒素纳米抗体‑碱性磷酸酶双功能融合蛋白、样本稀释液、洗涤液、底物液。本发明试剂盒将化学发光、磁微粒分离和基因工程技术汇聚在一起，可实现真菌毒素的快速、准确、全自动化检测，食用油可直接加样检测，无需提取、离心等操作，减少检测人员的操作误差，降低对检测人员的能力要求，显著提高基层大批量样品的检测效率，为真菌毒素检测、监测提供有力的手段。

Description

基于双功能融合蛋白的真菌毒素磁化学发光免疫分析试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于食品安全检测技术领域，涉及一种基于双功能融合蛋白的真菌毒素磁化学发光免疫分析试剂盒及其应用。

背景技术

真菌毒素(Mycotoxins)是产毒真菌在一定环境条件下产生的次级代谢产物，广泛污染农产品、食品、中药材及饲料等植物源性产品。在农产品、食品和饲料中比较常见的真菌毒素有：脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，又称呕吐毒素，DON)、黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)、黄曲霉毒素G2(AFG2)、赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)、伏马毒素B1(fumonisin B1，FB1)、伏马毒素B2(FB1)、玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)、T-2毒素(T-2toxin)、HT-2毒素(HT-2toxin)或黄曲霉毒素M1(aflatoxin M1，AFM1)、展青霉素(patμLin)等。真菌毒素可以引起人类和动物的急性或慢性中毒，可损害机体的肝脏、肾脏、神经组织、造血组织及皮肤组织等，对人类和动物健康可产生严重的影响。鉴于真菌毒素的危害，世界各国对其含量进行了严格的限定。开展真菌毒素残留污染研究，开发高灵敏、低成本、可靠的自动化检测技术对保证农产品、食品、中药和饲料等的质量和安全，打破国外的技术壁垒，保护我国在国际贸易中的经济利益，增加出口创汇具有重要意义。

目前真菌毒素的检测方法有薄层色谱法，高效液相色谱法、酶联免疫吸附法，毛细管电泳法、液质联用法等。其中薄层色谱法是最早使用的检测真菌毒素的方法，其优点是适合于没有经过专门培训的人员操作，且成本低、无需价格昂贵的仪器。但是，薄层色谱法的样品处理繁琐，实验过程复杂，所需检测周期较长，容易受到杂质的干扰。测定时用目测半定量，存在主观影响较大，灵敏度不高等缺点，已远远不能满足现代检测要求。酶联免疫吸附法具有检测特异性好、灵敏度高、并且检测成本较低的优点，适用于基层机构大量样品的筛选和普查，可以大大节省时间和费用。酶联免疫吸附法的主要问题是容易造成假阳性。因此，主要用于基层的筛查检测。高效液相色谱法、毛细管电泳法和液质联用法等仪器分析方法具有准确度高、灵敏性强、可微量测定等优点，是目前常用的食品中毒素检测的方法。但因其对样品纯度要求较高，需要经过一些前处理过程，导致检测成本高、周期长，无法满足大批量样品快速筛选的要求。磁微粒具有超顺磁微粒性，在磁微粒场下具有磁微粒场响应性，将磁微粒应作免疫检测的固相载体，将大大提高反应的表面积，更容易进行固相、液相分离，可提高检测的灵敏度。采用微小的磁微粒作为固相可增加包被表面积，从而增加抗原或抗体的吸附量，既加快了反应速度，也使清洗和分离更简便。目前免疫酶标试剂制备方式是采用化学标记方法，如使用双功能试剂，戊二醛，过碘酸盐，SMCC试剂{4(N马来酰亚胺基甲基)环己烷1羧酸琥珀酰亚胺酯等)}，2IT试剂(亚氨基噻吩盐酸盐)等，将抗体与酶偶联，但是化学偶联方法操作复杂，偶联效率低，由于偶联位点不固定且条件剧烈，易导致抗体或酶活性降低，抗体与酶的结合物不均一，需要分离去除未结合的酶和抗体，且去除未结合的抗体至关重要，因为游离的抗体会与酶标记抗体竞争相应的抗原，减低结合到固相上的酶标抗体量，因而降低了检测的灵敏度。

由于真菌毒素危害较大，因而寻找一种简单、快速、准确、自动化的检测方法，对于研究真菌毒素的检测和污染控制具有重要意义。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种真菌毒素磁化学发光免疫分析试剂盒，该试剂盒将化学发光、磁微粒分离和基因工程技术汇聚在一起，具有良好的准确性、灵敏度和重复性。

本发明的第二个目的在于提供上述试剂盒在检测真菌毒素中的应用。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

第一方面，本发明提供一种真菌毒素磁化学发光免疫分析试剂盒，该试剂盒包括链霉亲和素磁微粒、生物素标记的真菌毒素抗原、真菌毒素标准品溶液、真菌毒素纳米抗体-碱性磷酸酶(ScFV-AP)双功能融合蛋白、样本稀释液、洗涤液、底物液。

本发明以微米级磁微粒为载体，利用表面有机物提供的羧基活性基团与链霉亲和素氨基共价结合，采用生物素-链霉亲和素进行“搭桥”形成磁微粒——链霉亲和素——生物素——真菌毒素——ScFV-AP双功能融合蛋白复合物。该技术的新颖之处在于：(1)利用磁微粒为固相载体，增加抗原、抗体的接触面积及底物发光面积，提高反应的灵敏度，并采用旋转磁微粒场使磁微粒起搅拌作用及分离磁微粒——链霉亲和素——生物素——真菌毒素——ScFV-AP双功能融合蛋白复合物和真菌毒素——scFV-AP双功能融合蛋白复合物的作用。(2)scFV-AP双功能融合蛋白提高了反应的特异性及稳定性。(3)食用油可直接加样检测，无需提取、离心等操作，大幅提高检测效率。

进一步的，所述scFV-AP双功能融合蛋白是以碱性磷酸酶(AP)作为生物发光的催化剂，将真菌毒素纳米抗体(scFv)与碱性磷酸酶(AP)融合表达获得。

优选的，真菌毒素纳米抗体(scFV)选自骆驼科或鲨鱼科动物的重链抗体。

进一步的，本发明所述真菌毒素纳米抗体-碱性磷酸酶双功能融合蛋白的氨基酸序列可以是如以下中的任一种或多种：

黄曲霉毒素B1纳米抗体-碱性磷酸酶双功能融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

脱氧雪腐镰刀菌烯醇纳米抗体-碱性磷酸酶双功能融合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO:2所示；

玉米赤霉烯酮纳米抗体-碱性磷酸酶双功能融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

T-2毒素纳米抗体-碱性磷酸酶双功能融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；

伏马毒素B1纳米抗体-碱性磷酸酶双功能融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；

赭曲霉毒素A纳米抗体-碱性磷酸酶双功能融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

根据本申请的具体实施方式，依据要检测的毒素种类，选择相应的生物素标记的真菌毒素抗原、真菌毒素标准品溶液、以及真菌毒素纳米抗体-碱性磷酸酶双功能融合蛋白。例如，当检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇时，本申请的试剂盒中，应包括生物素标记的脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗原，脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准品溶液，以及脱氧雪腐镰刀菌烯醇纳米抗体-碱性磷酸酶双功能融合蛋白。

进一步的，所述的scFv-AP双功能融合蛋白可以根据上述提供的氨基酸序列进行合成，也可以通过下述方法制备获得：

(1)真菌毒素纳米抗体基因的设计与合成：根据真菌毒素纳米抗体的氨基酸序列，通过优化基因的结构实现基因在大肠杆菌中的高效表达，包括使用大肠杆菌偏爱密码子，消除可能存在的二级结构，使GC/AT均衡，设计并合成真菌毒素纳米抗体基因的核苷酸片段；

(2)真菌毒素纳米抗体-碱性磷酸酶双功能融合表达载体的构建：将步骤(1)合成的真菌毒素纳米抗体基因与碱性磷酸酶基因克隆到原核表达载体中，构建真菌毒素纳米抗体-碱性磷酸酶双功能融合表达载体；

(3)真菌毒素纳米抗体-碱性磷酸酶双功能融合蛋白的表达：将双功能融合表达载体转化至表达菌株E.coli BL21或Rosetta DE3的感受态细胞中，诱导表达，收集菌体细胞，加入菌体蛋白提取试剂，离心收集含有可溶性蛋白的上清液；

(4)双功能融合蛋白的纯化：采用Ni²⁺-NTA亲和层析柱进行融合蛋白的纯化。

本发明将真菌毒素纳米抗体与碱性磷酸酶融合表达，既能克服化学标记方法的各种缺陷，又可获取高比活酶标抗体。所制备的融合蛋白可应用于免疫诊断领域，如化学发光免疫法，酶联免疫吸附法或酶促荧光免疫法等作检测试剂用。相比较传统的化学偶联碱性磷酸酶方式，ScFV-AP双功能融合蛋白，具有如下优势：(1)传统化学偶联方式，工艺流程长，偶联工艺复杂，条件剧烈，导致工艺不稳定，偶联产物得率低且批次之间稳定性不佳。真菌毒素纳米抗体与碱性磷酸酶融合表达简单且工艺稳定，避免了繁琐且低效率的酶与蛋白质的化学交联。(2)传统化学偶联方式，为了获取较佳的偶联产物，通常需要对目标偶联产物进行纯化，从而去除未连接的酶与抗体分子，纯化不完全，在检测时会产生假阳性结果。真菌毒素纳米抗体与碱性磷酸酶融合表达方法则克服了这一缺点。(3)传统化学偶联方式，偶联后的酶与抗体复合物不均一，而真菌毒素纳米抗体与碱性磷酸酶融合表达产物中真菌毒素纳米抗体与单体碱性磷酸酶分子比例为1:1或1:2，且在镍柱纯化时可分离开，保证酶与抗体复合物均一。(4)传统化学偶联方式，由于偶联化学活性试剂结合位置不固定，可能会结合到抗体可变区，从而影响抗体与目标抗原结合；或者偶联化学活性试剂结合到碱性磷酸酶活性位点附近，影响碱性磷酸酶与底物结合；这两种情况均可导致偶联复合物活性下降，在检测时易得到假阴性的结果。而真菌毒素纳米抗体与碱性磷酸酶融合表达方式，不影响真菌毒素纳米抗体与碱性磷酸酶活性。(5)本发明提供的scFvAP融合蛋白，该融合蛋白具有较好特异性和信号放大作用，采用scFvAP融合蛋白建立超敏的生物发光免疫分析试剂盒，用于检测粮油、食品、饲料和中草药等基质中真菌毒素的含量，具有良好的应用价值及前景。(6)纳米抗体相较于单链抗体，在抗体稳定性，批间重复性、效价等方面有较大优势，除本发明所示意的，其他所有抗体分子均可通过这种方式生产碱性磷酸酶偶联分子。

进一步的，所述磁微粒是以四氧化三铁或三氧化二铁超顺磁性材料为内核，外围包覆聚苯乙烯或葡聚糖，通过物理或化学的方法活化使磁微粒表面产生氨基(NH2-)、甲苯磺酰基(Tosyl)、羧基(COOH-)或环氧基(—CH(O))基团，粒径为1-2μm。

进一步的，所述链霉亲和素磁微粒是将链霉亲和素与磁微粒偶联。

进一步的，所述生物素标记的真菌毒素抗原是先将真菌毒素和牛血清白蛋白偶联，再将得到的牛血清白蛋白-真菌毒素复合物和生物素偶联。

进一步的，所述真菌毒素标准品溶液是将真菌毒素标准品溶于甲醇-水混合溶液中配制而成。根据本发明的具体实施方式，试剂盒中的真菌毒素标准品溶液可以是一定浓度的母液，使用时根据需要稀释成不同浓度的标准品工作液，用于标准曲线的绘制；也可以在试剂盒中直接分装放置一系列浓度的真菌毒素标准品溶液，用于标准曲线的绘制。

优选的，所述甲醇-水混合溶液中，甲醇与水的体积比为50:50。

进一步的，所述底物液是浓度为0.5-2mmol/L的(4-氯苯巯基)(10-甲基-9,10-二氢化吖啶亚甲基)磷酸二钠盐溶液。

优选的，所述样本稀释液由0.01M磷酸盐缓冲液、0.1％吐温20和0.5％牛血清白蛋白组成。

优选的，所述洗涤液由0.01MTris-HCl缓冲液和0.1％吐温20组成。

进一步的，所述试剂盒还包括反应管；优选的，所述反应管的材料为透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。

第二方面，本发明还要求保护上述试剂盒在真菌毒素检测中的应用，特别是在检测粮油、食品、饲料或中草药中真菌毒素的应用。

进一步的，所述食用油包括花生油、玉米油、大豆油、菜籽油、葵花籽油、油菜籽油、芝麻油、橄榄油中的一种。

进一步的，所述真菌毒素包括黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、伏马毒素、赭曲霉毒素A、T-2毒素中的一种或多种。

本发明采用间接竞争的原理测定食品、农产品及饲料中的真菌毒素，在链霉亲和素磁微粒悬浮液中加入生物素标记的真菌毒素抗原工作液、scFV-AP双功能融合蛋白和待测样本。样本中的真菌毒素与生物素标记的真菌毒素抗原竞争数量有限的ScFV-AP双功能融合蛋白，通过链霉亲和素和生物素的亲和反应以及抗原抗体反应，分别形成磁微粒-链霉亲和素-生物素-真菌毒素-scFV-AP双功能融合蛋白复合物和真菌毒素-scFV-AP双功能融合蛋白复合物，磁微粒在外加磁微粒场中直接沉淀，用磁微粒场将复合物吸附在试剂管底部，清洗掉游离的成分，加入底物液，碱性磷酸酶催化底物的磷酸根水解后，立即发生分解反应释放出475nm的光子，于5min内测定各加样孔的发光值(RLU)。样本的RLU与样本中真菌毒素的浓度呈负相关。样本中的真菌毒素浓度依据由真菌毒素标准品浓度和对应的RLU建立的四参数数学模型进行定量，从而检测样本中的真菌毒素含量。

进一步，上述检测可以使用全自动化学发光免疫分析仪，从而实现真菌毒素全自动化检测。每个试剂盒互不干扰，可即时多样本同时检测，高度切合了真菌毒素现场快速检测的发展需求。此外，使用本发明试剂盒检测真菌毒素还具有以下优点：(1)检测速度快、稳定、无放射性污染，在没有磁微粒场存在的情况下，磁微粒悬浮在液体中，使得抗原-抗体反应类似于均相反应；磁微粒在外加磁微粒场的作用下可方便地分离、洗涤快速，可在24分钟内判断检测结果。(2)灵敏度高。(3)特异性强。(4)精密度良好。(5)链霉亲和素与生物素级联放大体系，链霉亲和素磁微粒，生物素标记的真菌毒素抗原，较磁微粒直接联真菌毒素抗原，大大提高了反应效率，操作简单，同时增加了试剂盒的有效期，经37℃加速稳定性及2-8℃真实稳定性试验证实，本产品在37℃可存放7天以上，在2-8℃可存放1年。(6)成本低，与市场上同类产品比较，本试剂盒性能良好，成本低，具有实际应用价值。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1为基于双功能融合蛋白的真菌毒素磁化学发光免疫分析原理图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂供应商购买得到。

实施例1制备黄曲霉毒素B1纳米抗体-碱性磷酸酶双功能融合蛋白

AFB1-scFV-AP双功能融合蛋白是以碱性磷酸酶作为生物发光的催化剂，将黄曲霉毒素B1纳米抗体(AFB1 scFv)与碱性磷酸酶(AP)融合表达获得的。

AFB1-scFV-AP双功能融合蛋白是通过下述方法制备的：

(1)AFB1纳米抗体基因的设计与合成：根据AFB1纳米抗体的氨基酸序列SEQ IDNO:7，通过优化基因的结构实现基因在大肠杆菌中的高效表达，包括使用大肠杆菌偏爱密码子，消除可能存在的二级结构，使GC/AT均衡等，设计并合成AFB1纳米抗体基因的核苷酸片段(核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示)。

(2)AFB1-scFV-AP表达载体的构建：将步骤(1)合成的黄曲霉毒素B1纳米抗体基因克隆到原核表达载体pET25b(+)中，得到pET25b(+)-scFV；然后用限制性内切酶XhoI和NotI双酶切碱性磷酸酶表达载体pET25b(+)-AP(由苏州泓迅生物科技股份有限公司提供)，得到碱性磷酸酶基因片段；琼脂糖凝胶回收后，利用T4 DNA连接酶按摩尔比1：3将碱性磷酸酶基因片段连接到经限制性内切酶XhoI和NotI双酶切的pET25b(+)-scFV表达载体上，通过热击法(42℃，45s)将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，将转化的细菌接种到含有100μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB平板上，37℃过夜培养。采用菌落聚合酶链式反应(PCR)和双酶切验证进行克隆初步筛选，将筛选的阳性克隆进行测序，最终得到双功能融合表达载体AFB1-scFV-AP。

(3)AFB1 scFv AP双功能融合蛋白的表达：将双功能融合表达载体热击转化至表达菌株E.coli BL21(Rosetta，DE3)的感受态细胞中，均匀涂布于含有100μg/mL Amp和34μg/mL氯霉素(CAP)的LB平板上，37℃倒置培养12h。挑取单菌落接入5mL LB/Amp/CAP液体培养基中，37℃220rpm摇振培养12h；按1％接种量将上述培养物转接至200mL LB/Amp/CAP液体培养基中，37℃，220rpm摇振培养至OD600为0.4～0.6；加入IPTG进行诱导培养，移取1mL诱导后培养物离心收集菌体细胞并于-20℃冻存备用，5000g离心10min收集剩余菌体；在上述每克剩余菌体中加入4mL菌体蛋白提取试剂(Bacterical Protein ExtractionReagent,B-PER)，且每毫升B-PER中含有2μL溶菌酶和2μL核酸内切酶DNase I，充分重悬菌体后室温静置10-15min；15000g离心5min，收集含有可溶性蛋白的上清液，采用SDS-PAGE和Western blot分析目的蛋白的表达情况。通过改变IPTG的终浓度(0mmol/L～1mmol/L，诱导温度为16℃)和诱导温度(16℃，20℃，30℃，37℃，IPTG终浓度为0.5mmol/L)对原核表达条件进行优化，探究融合蛋白的最佳表达条件。

(4)双功能融合蛋白的纯化与表征：将最佳表达条件下的上清液经0.45μm无菌过滤器除菌后上样到Ni²⁺-NTA亲和层析柱中，用十倍柱床体积的结合缓冲液(TBS缓冲液，pH8.0)洗涤后，用含不同浓度(20mmol/L、50mmol/L、100mmol/L、200mmol/L)咪唑的结合缓冲液洗脱，收集各洗脱组分。利用12％SDS-PAGE表征表达产物及双功能融合蛋白的纯化情况，使用Image J软件调节凝胶图片的灰度，对洗脱后的蛋白质条带进行灰度分析，确定纯化后融合蛋白的纯度。

通过上述方法，最终得到纯化后的AFB1-scFV-AP双功能融合蛋白，其氨基酸序列如SED ID NO.1所示。

(5)双功能融合蛋白的活性分析：

双功能融合蛋白的碱性磷酸酶活性测定：对硝基苯磷酸二钠法。在酶标板中，分别加入20μL稀释50，100，200，400，800，1000倍的双功能融合蛋白和AP，再向孔中添加100μLPNPP试剂(2mg/mL，溶于含有2mM MgCl₂的0.1M二乙醇胺缓冲液，pH9.8)，混匀后，置于37℃下孵育10min，最后加入50μL 4M NaOH溶液终止反应，利用微孔板酶标仪测定405nm处的吸光度，分别计算对硝基苯酚的浓度(mM)。酶活力(U/mL)＝对硝基苯酚浓度/反应时间*样品稀释倍数，酶的比活力(U/mg)＝酶活力(U/mL)/蛋白浓度(mg/mL)。通过比较双功能融合蛋白和AP的比活力大小，评估双功能融合蛋白的碱性磷酸酶活性。

双功能融合蛋白的抗体亲和力测定：生物膜干涉技术。用PBS缓冲液平衡传感器60s后，加入生物素标记的目标真菌毒素进行固定，用PBST缓冲液(含0.02％Tween-20的PBS缓冲液，pH 7.4)封闭180s。在30℃的恒温条件下观察不同梯度下双功能融合蛋白及特异性纳米抗体与目标真菌毒素的结合和解离情况，并通过Octet RED96e数据处理程序计算双功能融合蛋白和特异性纳米抗体与目标真菌毒素的Kon值、Koff值和KD值(Kon值/Koff值)，通过比较KD值的大小表征双功能融合蛋白的抗体亲和力情况。Kon表示抗原抗体复合物的形成速率，Kon值越大，抗原抗体结合越快；Koff反映了形成的复合物的稳定性，Koff值越大，复合物解离越快；KD则可以反映抗原与抗体相互作用的结合能力的大小，当KD值达到10^- ⁸mol/L时，表明抗原抗体之间具有很高的亲和性。

实施例2制备脱氧雪腐镰刀菌烯醇纳米抗体-碱性磷酸酶双功能融合蛋白

使用实施例1的方法，制备DON-scFV-AP双功能融合蛋白，其氨基酸序列如SED IDNO:2所示。

实施例3制备玉米赤霉烯酮纳米抗体-碱性磷酸酶双功能融合蛋白

使用实施例1的方法，制备ZEN-scFV-AP双功能融合蛋白，其氨基酸序列如SED IDNO:3所示。

实施例4制备T-2毒素纳米抗体-碱性磷酸酶双功能融合蛋白

使用实施例1的方法，制备T-2-scFV-AP双功能融合蛋白，其氨基酸序列如SED IDNO:4所示。

实施例5制备伏马毒素B1纳米抗体-碱性磷酸酶双功能融合蛋白

使用实施例1的方法，制备FB1-scFV-AP双功能融合蛋白，其氨基酸序列如SED IDNO:5所示。

实施例6制备赭曲霉毒素A纳米抗体-碱性磷酸酶双功能融合蛋白

使用实施例1的方法，制备OTA-scFV-AP双功能融合蛋白，其氨基酸序列如SED IDNO:6所示。

实施例7制备AFB1磁化学发光免疫分析试剂盒

1.链霉亲和素磁微粒制备：

(1)磁微粒的分散：将10mg磁微粒用10mL 0.1M 2-吗啉乙磺酸溶液(MES缓冲液)分散，使磁微粒的终浓度为1mg/mL；

(2)磁微粒的清洗：用3倍磁微粒溶液体积的MES缓冲液清洗磁微粒后，再用MES缓冲液重新分散，使磁微粒的终浓度为1mg/mL；

(3)磁微粒的活化与链接：将3mg链霉亲和素和3.5μL 10mg/mL碳二亚胺盐酸盐溶液依次加入步骤(2)所得的磁微粒分散液中，室温下搅拌反应2小时；

(4)磁微粒的封闭：步骤(3)中将磁微粒与反应体系分离后，用MES缓冲液洗涤磁微粒2次，再用MES缓冲液重新分散磁微粒，磁微粒的终浓度为2-30mg/mL；然后加入2％甘氨酸封闭液，室温下搅拌反应2小时；

(5)磁微粒的清洗：将步骤(4)的磁微粒与反应体系分离，用pH7.4的磷酸盐缓冲液清洗磁微粒珠两次，获得链霉亲和素磁微粒；

(6)使用时，将链霉亲和素磁微粒配置成链霉亲和素磁微粒工作液：将步骤(5)中的链霉亲和素磁微粒分散于0.5g/mL酪蛋白、1g/mL PEG200、0.2％吐温20、0.5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，pH值为7-8，磁微粒的终浓度为1mg/mL，即得。

2.生物素标记的AFB1抗原制备：

(1)将AFB1与羧甲基羟氨半盐酸盐置于吡啶中，室温避光搅拌反应24小时，得到第一反应液；

(2)将所述第一反应液冷冻干燥，得到固体干燥物；

(3)将固体干燥物用纯水溶解后，并用盐酸调节pH为3.0，用乙酸乙酯抽提沉淀物，真空干燥后得到AFB1肟；

(4)将AFB1肟溶解于KOH的吡啶溶液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，在70℃的温度下反应12小时，得到第二反应液；

(5)向第二反应液中加入N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌反应2小时，得到第三反应液；将所述第三反应液；

(6)将阳离子牛血清白蛋白用蒸馏水溶解后，加入至第三反应液中，避光室温搅拌下反应24小时，得到第四反应液；

(7)将第四反应液在0.01摩尔/升的磷酸盐缓冲液中透析3天，将透析液冷冻干燥得到AFB1-牛血清白蛋白复合物；

(8)将AFB1-牛血清白蛋白复合物与PBS缓冲液混合，加入活化生物素标记2h，而后透析得到所述生物素标记的AFB1抗原；

(9)使用时，将生物素标记的AFB1抗原用0.01M磷酸盐缓冲液和0.5％牛血清白蛋白溶液按1：15000比例稀释得到生物素标记的AFB1抗原工作液。

3.AFB1-scFV-AP双功能融合蛋白工作液的制备

将实施例1制备的AFB1-scFV-AP双功能融合蛋白用0.01M Tris盐缓冲液和0.5％牛血清白蛋白溶液按1：20000比例稀释得到AFB1-scFV-AP双功能融合蛋白工作液。

4.样品稀释液的配制：

样品稀释液由0.01M磷酸盐缓冲液、0.1％吐温20和0.5％牛血清白蛋白组成。

5.洗涤液的配制

洗涤液由0.01M Tris-HCl缓冲液和0.1％吐温20组成。

6.AFB1标准品溶液的配制

将AFB1标准品用甲醇-水(50：50)溶液稀释至工作浓度，分别为0.25ng/mL，0.5ng/mL，1ng/mL，2.5ng/mL，5ng/mL，10ng/mL，20ng/mL，即为各标准品点浓度。

7.底物液的制备：

将(4-氯苯巯基)(10-甲基-9,10-二氢化吖啶亚甲基)磷酸二钠盐用0.01M PBS稀释成1mmol/L得到底物液。

8.组装：将上述试剂组装成盒，2-8℃储存。

基于双功能融合蛋白的AFB1磁化学发光免疫分析原理图如图1所示。

实施例8黄曲霉毒素B1磁化学发光免疫分析试剂盒检测黄曲霉毒素B1的方法学考察

对实施例7制备的AFB1磁化学发光免疫分析试剂盒进行检测黄曲霉毒素B1的方法学考察试验。

(1)稳定性实验：采用先进的稳定剂(0.01M磷酸盐缓冲液、0.1％牛血清白蛋白溶液、0.1％proclin300和1％海藻糖)处理，处理后37℃保存进行加速稳定性试验测试，测得稳定性结果见表1，根据经验在37℃下保存1天相当于4℃保存2个月，即本试剂盒在4℃保存12个月，不影响使用。

(2)灵敏度分析

通过对20个独立的玉米阴性样品进行测定，该方法检出限LOD以阴性样品20次测定结果的均值加3倍标准偏差计算，结果为0.2μg/kg，定量限LOQ以阴性样品20次测定结果的均值加10倍标准偏差计算，结果为1.0μg/kg。

(3)线性关系考察

①标准曲线的绘制：根据黄曲霉毒素B1标准品溶液的浓度发光值系列数值进行四参数拟合，获得基于的浓度发光值标准曲线。

②样本浓度的计算：在一定范围内发光值与黄曲霉毒素B1抗原浓度呈反比，根据拟合的黄曲霉毒素B1的浓度发光值标准曲线计算待测样本的黄曲霉毒素B1含量。

(4)黄曲霉毒素B1磁化学发光免疫分析试剂盒特异性考察

将黄曲霉毒素B1磁化学发光免疫分析试剂用于检测结构类似物(AFB1，AFB2，AFG1和AFG2)和其他常见真菌毒素(脱氧雪腐镰刀菌烯醇，DON；伏马毒素B1，FB1；；伏马毒素B1，FB2；伏马毒素B1，FB3；玉米赤霉烯酮，ZEN；T-2毒素，T-2；赭曲霉毒素A，OTA；3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇，3-ADON；15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇，15-ADON；脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷，DON-3G；雪腐镰刀菌烯醇，NIV)，结果如表1所示，仅AFB2和AFG1存在较为明显的交叉反应，交叉反应率分别为26.3％和23.8％，其他毒素无交叉(交叉反应率小于1％)，表明黄曲霉毒素B1磁化学发光免疫分析试剂盒特异性良好。

表1.黄曲霉毒素B1磁化学发光免疫分析试剂盒特异性考察

实施例9黄曲霉毒素B1磁化学发光免疫分析试剂盒的使用

(1)待测样品前处理：称取5.0g粉碎后的待测样品于50mL离心管中，加入25.0mL甲醇/水(70：30)溶液，置于多管涡旋混匀仪上2500rpm涡旋5min(或使用高速均质器上11000rpm均质3min，或摇床上200rpm振荡40min)在检测管中加入20μL待测样品提取液，然后7000rpm离心5min，得到待测样品提取液；

(2)黄曲霉毒素B1磁化学发光免疫分析试剂盒(实施例7制备)的使用步骤：

①物理检查：液体组分应澄清，无沉淀或絮状物；其他组分应无包装破损。

②将试剂盒在室温(2-8℃)下平衡30min；

③样本测定：将40-200μL待测样品提取液加入样本孔中，放置于全自动化学发光免疫分析仪中，点击运行后，仪器依据预先设置好的运行程序依次加入50μL待测样品提取液或黄曲霉毒素B1标准品溶液，50μL链霉亲和素磁微粒工作液，50μL黄曲霉毒素B1纳米抗体-碱性磷酸酶双功能融合蛋白以及400μL稀释液，混匀，37℃温育5min；依次洗涤3次后，测度发光值，并根据内置的四参数拟合曲线进行结果分析，可20min内完成8个样本的测定，并出具检测报告。

(3)黄曲霉毒素B1毒素磁化学发光免疫分析试剂盒的准确性和重复性

分别称取5g阴性糙米、大米、玉米、花生酱、小麦、和花生油样品，并加入不同量的黄曲霉毒素B1标准品，7个平行，用黄曲霉毒素B1磁化学发光免疫分析试剂盒加标后的样品提取液进行测定，7个平行的回收率、均值及RSD如表2、表3、表4、表5、表6和表7所示，回收率在79.1％-120％之间，RSD小于10％。

表2.黄曲霉毒素B1磁化学发光免疫分析试剂盒测定糙米中AFB1的回收率和重复性

表3.黄曲霉毒素B1磁化学发光免疫分析试剂盒测定大米的回收率和重复性

表4.黄曲霉毒素B1磁化学发光免疫分析试剂盒测定玉米的回收率和重复性

表5.黄曲霉毒素B1磁化学发光免疫分析试剂盒测定花生酱的回收率和重复性

表6.黄曲霉毒素B1磁化学发光免疫分析试剂盒测定小麦的回收率和重复性

表7.黄曲霉毒素B1磁化学发光免疫分析试剂盒测定花生油的回收率和重复性

实施例10脱氧雪腐镰刀菌烯醇磁化学发光免疫分析试剂盒检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇的方法学考察

参考实施例7制备脱氧雪腐镰刀菌烯醇磁化学发光免疫分析试剂盒并进行检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇的方法学考察。

(2)灵敏度分析

通过对20个独立的玉米阴性样品进行测定，该方法检出限LOD以阴性样品20次测定结果的均值加3倍标准偏差计算，结果为77.0μg/kg，定量限LOQ以阴性样品20次测定结果的均值加10倍标准偏差计算，结果为222.8μg/kg。

(3)线性关系考察

①标准曲线的绘制：根据脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准品溶液的浓度发光值系列数值进行四参数拟合，获得基于的浓度发光值标准曲线。

②样本浓度的计算：在一定范围内发光值与脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗原浓度呈反比，根据拟合的脱氧雪腐镰刀菌烯醇的浓度发光值标准曲线计算待测样本的脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量。

(4)脱氧雪腐镰刀菌烯醇磁化学发光免疫分析试剂盒特异性考察

将脱氧雪腐镰刀菌烯醇磁化学发光免疫分析试剂用于检测结构类似物(3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-ADON)，15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-ADON)和雪腐镰刀菌烯醇，NIV)和其他常见真菌毒素(黄曲霉毒素B1，DON玉米赤霉烯酮，ZEN；T-2毒素，T-2和赭曲霉毒素A，OTA)，结果如表8所示，仅3-ADON存在较为明显的交叉反应，其他毒素无交叉，表明脱氧雪腐镰刀菌烯醇磁化学发光免疫分析试剂盒特异性良好。

表8.脱氧雪腐镰刀菌烯醇磁化学发光免疫分析试剂盒的特异性

实施例11脱氧雪腐镰刀菌烯醇磁化学发光免疫分析试剂盒的使用

(1)待测样品前处理：称取5.0g粉碎后的待测样品于50mL离心管中，加入25.0mL水，置于多管涡旋混匀仪上2500rpm涡旋5min(或使用高速均质器上11000rpm均质3min，或摇床上200rpm振荡40min)在检测管中加入20μL待测样品提取液，然后7000rpm离心5min，得到待测样品提取液；

(2)脱氧雪腐镰刀菌烯醇磁化学发光免疫分析试剂盒的使用步骤

②将待测试剂盒在室温(2-8℃)下平衡30min；

③样本测定：将40-200μL待测样品提取液加入样本孔中，放置于全自动化学发光免疫分析仪中，点击运行后，仪器依据预先设置好的运行程序依次加入50μL待测样品提取液或脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准品溶液，50μL链霉亲和素磁微粒工作液，50μLDON-scFV-AP双功能融合蛋白以及400μL稀释液，混匀，37℃温育5min；依次洗涤3次后，测度发光值，并根据内置的四参数拟合曲线进行结果分析，可20min内完成8个样本的测定，并出具检测报告。

(3)脱氧雪腐镰刀菌烯醇磁化学发光免疫分析试剂盒的准确性和重复性

分别称取5g阴性玉米、小麦和面粉样品，并加入不同量的脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准品，7个平行，用脱氧雪腐镰刀菌烯醇磁化学发光免疫分析试剂盒加标后的样品提取液进行测定，7个平行的回收率、均值及RSD如表9、表10和表11所示，回收率在80％-120％之间，RSD小于9％。。

表9.脱氧雪腐镰刀菌烯醇磁化学发光免疫分析试剂盒测定玉米中DON的准确性和重复性

表10.脱氧雪腐镰刀菌烯醇磁化学发光免疫分析试剂盒测定小麦中DON的准确性和重复性

表11.脱氧雪腐镰刀菌烯醇磁化学发光免疫分析试剂盒测定面粉中DON的准确性和重复性

实施例12玉米赤霉烯酮磁化学发光免疫分析试剂盒的使用

参考实施例7制备玉米赤霉烯酮磁化学发光免疫分析试剂盒。

(1)待测样品前处理：称取5.0g粉碎后的待测样品于50mL离心管中，加入25.0mL80％乙腈水溶液，置于多管涡旋混匀仪上2500rpm涡旋5min(或使用高速均质器上11000rpm均质3min，或摇床上200rpm振荡40min)在检测管中加入20μL待测样品提取液，然后7000rpm离心5min，得到待测样品提取液；

(2)玉米赤霉烯酮磁化学发光免疫分析试剂盒的使用步骤

②将待测试剂盒在室温(2-8℃)下平衡30min；

③样本测定：将40-200μL待测样品提取液加入样本孔中，放置于全自动化学发光免疫分析仪中，点击运行后，仪器依据预先设置好的运行程序依次加入50μL待测样品提取液或玉米赤霉烯酮标准品溶液，50μL链霉亲和素磁微粒工作液，50μLZEN-scFV-AP双功能融合蛋白以及400μL稀释液，混匀，37℃温育5min；依次洗涤3次后，测度发光值，并根据内置的四参数拟合曲线进行结果分析，可20min内完成8个样本的测定，并出具检测报告。

(3)玉米赤霉烯酮磁化学发光免疫分析试剂盒的灵敏度分析

通过对20个独立的玉米阴性样品进行测定，该方法检出限LOD以阴性样品20次测定结果的均值加3倍标准偏差计算，结果为3.9939μg/kg，定量限LOQ以阴性样品20次测定结果的均值加10倍标准偏差计算，结果为9.4483μg/kg。

(4)玉米赤霉烯酮磁化学发光免疫分析试剂盒的准确性和重复性

分别称取5g阴性玉米、小麦、糙米和面粉样品，并加入不同量的玉米赤霉烯酮标准品，7个平行，用玉米赤霉烯酮磁化学发光免疫分析试剂盒加标后的样品提取液进行测定，7个平行的回收率、均值及RSD如表12、表13、表14和表15所示，回收率在80％-120％之间，RSD小于10％。

表12.玉米赤霉烯酮磁化学发光免疫分析试剂盒测定玉米中ZEN的准确性和重复性

表13.玉米赤霉烯酮磁化学发光免疫分析试剂盒测定小麦中ZEN的准确性和重复性

表14.玉米赤霉烯酮磁化学发光免疫分析试剂盒测定糙米中ZEN的准确性和重复性

表15.玉米赤霉烯酮磁化学发光免疫分析试剂盒测定面粉中ZEN的准确性和重复性

实施例13T-2毒素磁化学发光免疫分析试剂盒的使用

参考实施例7制备T-2毒素磁化学发光免疫分析试剂盒。

(1)待测样品前处理：称取5.0g粉碎后的玉米阴性样品于50mL离心管中，分别加入不同量的T-2毒素标准品，最终加标水平分别为47.8μg/Kg和108μg/Kg，7个平行，加入25.0mL80％乙腈水溶液，置于多管涡旋混匀仪上2500rpm涡旋5min(或使用高速均质器上11000rpm均质3min，或摇床上200rpm振荡40min)在检测管中加入20μL待测样品提取液，然后7000rpm离心5min，得到待测样品提取液；

(2)T-2毒素磁化学发光免疫分析试剂盒的使用步骤

②将待测试剂盒在室温(2-8℃)下平衡30min；

③样本测定：将40-200μL待测样品提取液加入样本孔中，放置于全自动化学发光免疫分析仪中，点击运行后，仪器依据预先设置好的运行程序依次加入50μL待测样品提取液或T-2毒素标准品溶液，50μL链霉亲和素磁微粒工作液，50μLT-2-scFV-AP双功能融合蛋白以及400μL稀释液，混匀，37℃温育5min；依次洗涤3次后，测度发光值，并根据内置的四参数拟合曲线进行结果分析，可20min内完成8个样本的测定，并出具检测报告。

(3)T-2毒素磁化学发光免疫分析试剂盒的准确性和重复性

用T-2毒素磁化学发光免疫分析试剂盒对步骤(1)得到的待测样品提取液进行测定，7个平行的回收率、均值及RSD如表16所示，回收率在89.0％-107.5％之间，RSD小于3％。

表16.T-2毒素磁化学发光免疫分析试剂盒的准确性和重复性

实施例14伏马毒素B1磁化学发光免疫分析试剂盒的使用

参考实施例7制备伏马毒素B1磁化学发光免疫分析试剂盒。

(1)待测样品前处理：称取5.0g粉碎后的玉米阴性样品于50mL离心管中，分别加入不同量的FB1标准品，最终加标水平分别为47.8μg/Kg和108μg/Kg，7个平行，加入25.0mL80％乙腈水溶液，置于多管涡旋混匀仪上2500rpm涡旋5min(或使用高速均质器上11000rpm均质3min，或摇床上200rpm振荡40min)在检测管中加入20μL待测样品提取液，然后7000rpm离心5min，得到待测样品提取液；

(2)伏马毒素B1毒素磁化学发光免疫分析试剂盒的使用步骤

②将待测试剂盒在室温(2-8℃)下平衡30min；

③样本测定：将40-200μL待测样品提取液加入样本孔中，放置于全自动化学发光免疫分析仪中，点击运行后，仪器依据预先设置好的运行程序依次加入50μL待测样品提取液或伏马毒素B1毒素标准品溶液，50μL链霉亲和素磁微粒工作液，50μLFB1-scFV-AP双功能融合蛋白以及400μL稀释液，混匀，37℃温育5min；依次洗涤3次后，测度发光值，并根据内置的四参数拟合曲线进行结果分析，可20min内完成8个样本的测定，并出具检测报告。

(3)FB1毒素磁化学发光免疫分析试剂盒的准确性和重复性

用FB1毒素磁化学发光免疫分析试剂盒对步骤(1)得到的待测样品提取液进行测定，7个平行的回收率、均值及RSD如表17所示，回收率在89.2％-111.3％之间，RSD小于6％。

表17.FB1毒素磁化学发光免疫分析试剂盒的准确性和重复性

实施例15赭曲霉毒素A磁化学发光免疫分析试剂盒的使用

参考实施例7制备赭曲霉毒素A磁化学发光免疫分析试剂盒。

(1)待测样品前处理：称取5.0g粉碎后的样品于50mL离心管中，加入25.0mL80％乙腈水溶液，置于多管涡旋混匀仪上2500rpm涡旋5min(或使用高速均质器上11000rpm均质3min，或摇床上200rpm振荡40min)在检测管中加入20μL待测样品提取液，然后7000rpm离心5min，得到待测样品提取液；

(2)赭曲霉毒素A磁化学发光免疫分析试剂盒的使用步骤

②将待测试剂盒在室温(2-8℃)下平衡30min；

③样本测定：将40-200μL待测样品提取液加入样本孔中，放置于全自动化学发光免疫分析仪中，点击运行后，仪器依据预先设置好的运行程序依次加入50μL待测样品提取液或赭曲霉毒素A标准品溶液，50μL链霉亲和素磁微粒工作液，50μLOTA-scFV-AP双功能融合蛋白以及400μL稀释液，混匀，37℃温育5min；依次洗涤3次后，测度发光值，并根据内置的四参数拟合曲线进行结果分析，可20min内完成8个样本的测定，并出具检测报告。

(3)赭曲霉毒素A磁化学发光免疫分析试剂盒的灵敏度

过对20个独立的小麦阴性样品进行测定，该方法检出限LOD以阴性样品20次测定结果的均值加3倍标准偏差计算，结果为2.0610μg/kg，定量限LOQ以阴性样品20次测定结果的均值加10倍标准偏差计算，结果为4.5105μg/kg。

(4)赭曲霉毒素A磁化学发光免疫分析试剂盒的准确性和重复性

分别称取5g阴性玉米、小麦和糙米样品，并加入不同量的赭曲霉毒素A标准品，7个平行，用赭曲霉毒素A磁化学发光免疫分析试剂盒加标后的样品提取液进行测定，7个平行的回收率、均值及RSD如表18、表19和表20所示，回收率在80％-120％之间，RSD小于8％。

表18.赭曲霉毒素A磁化学发光免疫分析试剂盒测定玉米中OTA的准确性和重复性

表19.赭曲霉毒素A磁化学发光免疫分析试剂盒测定小麦中OTA的准确性和重复性

表20.赭曲霉毒素A磁化学发光免疫分析试剂盒测定糙米中OTA的准确性和重复性

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

SEQUENCE LISTING

<110> 国家粮食和物资储备局科学研究院

<120> 基于双功能融合蛋白的真菌毒素磁化学发光免疫分析试剂盒及其应用

<130> JLP22I0028

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 581

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser

20 25 30

Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe

35 40 45

Val Ala Val Val Asn Trp Ser Gly Arg Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Asn

85 90 95

Cys Ala Ala Gly Lys Trp Asp Gly Ser Tyr Tyr Gly Ala Pro Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Leu Glu His His His

115 120 125

His His His Asn Thr Pro Glu Met Pro Val Leu Glu Asn Arg Ala Ala

130 135 140

Gln Gly Asn Ile Thr Ala Pro Gly Gly Ala Arg Arg Leu Thr Gly Asp

145 150 155 160

Gln Thr Ala Ala Leu Arg Asn Ser Leu Ser Asp Lys Pro Ala Lys Asn

165 170 175

Ile Ile Leu Leu Ile Gly Asp Gly Met Gly Asp Ser Glu Ile Thr Ala

180 185 190

Ala Arg Asn Tyr Ala Glu Gly Ala Gly Gly Phe Phe Lys Gly Ile Asp

195 200 205

Ala Leu Pro Leu Thr Gly Gln Tyr Thr His Tyr Ala Leu Asn Lys Lys

210 215 220

Thr Gly Lys Pro Asp Tyr Val Thr Asp Ser Ala Ala Ser Ala Thr Ala

225 230 235 240

Trp Ser Thr Gly Val Lys Thr Tyr Asn Gly Ala Leu Gly Val Asp Ile

245 250 255

His Glu Lys Asp His Pro Thr Ile Leu Glu Met Ala Lys Ala Ala Gly

260 265 270

Leu Ala Thr Gly Asn Val Ser Thr Ala Glu Leu Gln Asp Ala Thr Pro

275 280 285

Ala Ala Leu Val Ala His Val Thr Ser Arg Lys Cys Tyr Gly Pro Ser

290 295 300

Ala Thr Ser Gln Lys Cys Pro Gly Asn Ala Leu Glu Lys Gly Gly Lys

305 310 315 320

Gly Ser Ile Thr Glu Gln Leu Leu Asn Ala Arg Ala Asp Val Thr Leu

325 330 335

Gly Gly Gly Ala Lys Thr Phe Ala Glu Thr Ala Thr Ala Gly Glu Trp

340 345 350

Gln Gly Lys Thr Leu Arg Glu Glu Ala Glu Ala Arg Gly Tyr Gln Leu

355 360 365

Val Ser Asp Ala Ala Ser Leu Asn Ser Val Thr Glu Ala Asn Gln Gln

370 375 380

Lys Pro Leu Leu Gly Leu Phe Ala Asp Gly Asn Met Pro Val Arg Trp

385 390 395 400

Leu Gly Pro Lys Ala Thr Tyr His Gly Asn Ile Asp Lys Pro Ala Val

405 410 415

Thr Cys Thr Pro Asn Pro Gln Arg Asn Asp Ser Val Pro Thr Leu Ala

420 425 430

Gln Met Thr Asp Lys Ala Ile Glu Leu Leu Ser Lys Asn Glu Lys Gly

435 440 445

Phe Phe Leu Gln Val Glu Gly Ala Ser Ile Asp Lys Gln Asn His Ala

450 455 460

Ala Asn Pro Cys Gly Gln Ile Gly Glu Thr Val Asp Leu Asp Glu Ala

465 470 475 480

Val Gln Arg Ala Leu Glu Phe Ala Lys Lys Glu Gly Asn Thr Leu Val

485 490 495

Ile Val Thr Ala Asp His Ala His Ala Ser Gln Ile Val Ala Pro Asp

500 505 510

Thr Lys Ala Pro Gly Leu Thr Gln Ala Leu Asn Thr Lys Asp Gly Ala

515 520 525

Val Met Val Met Ser Tyr Gly Asn Ser Glu Glu Asp Ser Gln Glu His

530 535 540

Thr Gly Ser Gln Leu Arg Ile Ala Ala Tyr Gly Pro His Ala Ala Asn

545 550 555 560

Val Val Gly Leu Thr Asp Gln Thr Asp Leu Phe Tyr Thr Met Lys Ala

565 570 575

Ala Leu Gly Leu Lys

580

<210> 2

<211> 570

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Glu Val Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

1 5 10 15

Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Ser Leu Gly Asn

20 25 30

Ser Gly Ala Trp Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Lys Leu Thr

35 40 45

Ala Val Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr Thr Arg Glu Asp Tyr Tyr Gly

50 55 60

Gln Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

65 70 75 80

Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro

85 90 95

Gly Thr Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Asp Tyr Thr Phe Thr

100 105 110

Asn Cys Trp Ile His Trp Ile Lys Gln Thr Pro Glu Met Pro Val Leu

115 120 125

Glu Asn Arg Ala Ala Gln Gly Asn Ile Thr Ala Pro Gly Gly Ala Arg

130 135 140

Arg Leu Thr Gly Asp Gln Thr Ala Ala Leu Arg Asn Ser Leu Ser Asp

145 150 155 160

Lys Pro Ala Lys Asn Ile Ile Leu Leu Ile Gly Asp Gly Met Gly Asp

165 170 175

Ser Glu Ile Thr Ala Ala Arg Asn Tyr Ala Glu Gly Ala Gly Gly Phe

180 185 190

Phe Lys Gly Ile Asp Ala Leu Pro Leu Thr Gly Gln Tyr Thr His Tyr

195 200 205

Ala Leu Asn Lys Lys Thr Gly Lys Pro Asp Tyr Val Thr Asp Ser Ala

210 215 220

Ala Ser Ala Thr Ala Trp Ser Thr Gly Val Lys Thr Tyr Asn Gly Ala

225 230 235 240

Leu Gly Val Asp Ile His Glu Lys Asp His Pro Thr Ile Leu Glu Met

245 250 255

Ala Lys Ala Ala Gly Leu Ala Thr Gly Asn Val Ser Thr Ala Glu Leu

260 265 270

Gln Asp Ala Thr Pro Ala Ala Leu Val Ala His Val Thr Ser Arg Lys

275 280 285

Cys Tyr Gly Pro Ser Ala Thr Ser Gln Lys Cys Pro Gly Asn Ala Leu

290 295 300

Glu Lys Gly Gly Lys Gly Ser Ile Thr Glu Gln Leu Leu Asn Ala Arg

305 310 315 320

Ala Asp Val Thr Leu Gly Gly Gly Ala Lys Thr Phe Ala Glu Thr Ala

325 330 335

Thr Ala Gly Glu Trp Gln Gly Lys Thr Leu Arg Glu Glu Ala Glu Ala

340 345 350

Arg Gly Tyr Gln Leu Val Ser Asp Ala Ala Ser Leu Asn Ser Val Thr

355 360 365

Glu Ala Asn Gln Gln Lys Pro Leu Leu Gly Leu Phe Ala Asp Gly Asn

370 375 380

Met Pro Val Arg Trp Leu Gly Pro Lys Ala Thr Tyr His Gly Asn Ile

385 390 395 400

Asp Lys Pro Ala Val Thr Cys Thr Pro Asn Pro Gln Arg Asn Asp Ser

405 410 415

Val Pro Thr Leu Ala Gln Met Thr Asp Lys Ala Ile Glu Leu Leu Ser

420 425 430

Lys Asn Glu Lys Gly Phe Phe Leu Gln Val Glu Gly Ala Ser Ile Asp

435 440 445

Lys Gln Asn His Ala Ala Asn Pro Cys Gly Gln Ile Gly Glu Thr Val

450 455 460

Asp Leu Asp Glu Ala Val Gln Arg Ala Leu Glu Phe Ala Lys Lys Glu

465 470 475 480

Gly Asn Thr Leu Val Ile Val Thr Ala Asp His Ala His Ala Ser Gln

485 490 495

Ile Val Ala Pro Asp Thr Lys Ala Pro Gly Leu Thr Gln Ala Leu Asn

500 505 510

Thr Lys Asp Gly Ala Val Met Val Met Ser Tyr Gly Asn Ser Glu Glu

515 520 525

Asp Ser Gln Glu His Thr Gly Ser Gln Leu Arg Ile Ala Ala Tyr Gly

530 535 540

Pro His Ala Ala Asn Val Val Gly Leu Thr Asp Gln Thr Asp Leu Phe

545 550 555 560

Tyr Thr Met Lys Ala Ala Leu Gly Leu Lys

565 570

<210> 3

<211> 566

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gly Thr Glu Val Val Lys Pro Gly Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Gln

1 5 10 15

Val Lys Leu Gln Gln Ser Ala Ser Gly Tyr Ile Trp Ile Gly Trp Ile

20 25 30

Phe Pro Gly Glu Gly Ser Thr Glu Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg

35 40 45

Ala Thr Leu Ser Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Phe Thr Ser Tyr Asp

50 55 60

Ile Asp Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Gln Gly Leu Glu Ala Tyr Met

65 70 75 80

Glu Leu Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val

85 90 95

Ser Ser Thr Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala

100 105 110

Arg Gly Asp Tyr Tyr Thr Pro Glu Met Pro Val Leu Glu Asn Arg Ala

115 120 125

Ala Gln Gly Asn Ile Thr Ala Pro Gly Gly Ala Arg Arg Leu Thr Gly

130 135 140

Asp Gln Thr Ala Ala Leu Arg Asn Ser Leu Ser Asp Lys Pro Ala Lys

145 150 155 160

Asn Ile Ile Leu Leu Ile Gly Asp Gly Met Gly Asp Ser Glu Ile Thr

165 170 175

Ala Ala Arg Asn Tyr Ala Glu Gly Ala Gly Gly Phe Phe Lys Gly Ile

180 185 190

Asp Ala Leu Pro Leu Thr Gly Gln Tyr Thr His Tyr Ala Leu Asn Lys

195 200 205

Lys Thr Gly Lys Pro Asp Tyr Val Thr Asp Ser Ala Ala Ser Ala Thr

210 215 220

Ala Trp Ser Thr Gly Val Lys Thr Tyr Asn Gly Ala Leu Gly Val Asp

225 230 235 240

Ile His Glu Lys Asp His Pro Thr Ile Leu Glu Met Ala Lys Ala Ala

245 250 255

Gly Leu Ala Thr Gly Asn Val Ser Thr Ala Glu Leu Gln Asp Ala Thr

260 265 270

Pro Ala Ala Leu Val Ala His Val Thr Ser Arg Lys Cys Tyr Gly Pro

275 280 285

Ser Ala Thr Ser Gln Lys Cys Pro Gly Asn Ala Leu Glu Lys Gly Gly

290 295 300

Lys Gly Ser Ile Thr Glu Gln Leu Leu Asn Ala Arg Ala Asp Val Thr

305 310 315 320

Leu Gly Gly Gly Ala Lys Thr Phe Ala Glu Thr Ala Thr Ala Gly Glu

325 330 335

Trp Gln Gly Lys Thr Leu Arg Glu Glu Ala Glu Ala Arg Gly Tyr Gln

340 345 350

Leu Val Ser Asp Ala Ala Ser Leu Asn Ser Val Thr Glu Ala Asn Gln

355 360 365

Gln Lys Pro Leu Leu Gly Leu Phe Ala Asp Gly Asn Met Pro Val Arg

370 375 380

Trp Leu Gly Pro Lys Ala Thr Tyr His Gly Asn Ile Asp Lys Pro Ala

385 390 395 400

Val Thr Cys Thr Pro Asn Pro Gln Arg Asn Asp Ser Val Pro Thr Leu

405 410 415

Ala Gln Met Thr Asp Lys Ala Ile Glu Leu Leu Ser Lys Asn Glu Lys

420 425 430

Gly Phe Phe Leu Gln Val Glu Gly Ala Ser Ile Asp Lys Gln Asn His

435 440 445

Ala Ala Asn Pro Cys Gly Gln Ile Gly Glu Thr Val Asp Leu Asp Glu

450 455 460

Ala Val Gln Arg Ala Leu Glu Phe Ala Lys Lys Glu Gly Asn Thr Leu

465 470 475 480

Val Ile Val Thr Ala Asp His Ala His Ala Ser Gln Ile Val Ala Pro

485 490 495

Asp Thr Lys Ala Pro Gly Leu Thr Gln Ala Leu Asn Thr Lys Asp Gly

500 505 510

Ala Val Met Val Met Ser Tyr Gly Asn Ser Glu Glu Asp Ser Gln Glu

515 520 525

His Thr Gly Ser Gln Leu Arg Ile Ala Ala Tyr Gly Pro His Ala Ala

530 535 540

Asn Val Val Gly Leu Thr Asp Gln Thr Asp Leu Phe Tyr Thr Met Lys

545 550 555 560

Ala Ala Leu Gly Leu Lys

565

<210> 4

<211> 602

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Val Gln Ala

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys

20 25 30

Pro Glu Asp Arg Glu Phe Val Ala Val Val Asn Trp Ser Gly Arg Arg

35 40 45

Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp

50 55 60

Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Asn Cys Ala Ala Gly Lys Gln Val Lys

65 70 75 80

Leu Gln Gln Ser Ala Ser Gly Tyr Ile Trp Ile Gly Trp Lys Trp Asp

85 90 95

Gly Ser Tyr Tyr Gly Ala Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val

100 105 110

Thr Ser Val Thr Ala Val Tyr Ala Ser Gly Arg Ala Pro Gly Lys Glu

115 120 125

Lys Leu Ser Cys Lys Ser Val Lys Leu Ser Cys Gln Val Lys Leu Gln

130 135 140

Gln Ser Ala Ser Gly Tyr Ile Trp Ile Thr Pro Glu Met Pro Val Leu

145 150 155 160

Glu Asn Arg Ala Ala Gln Gly Asn Ile Thr Ala Pro Gly Gly Ala Arg

165 170 175

Arg Leu Thr Gly Asp Gln Thr Ala Ala Leu Arg Asn Ser Leu Ser Asp

180 185 190

Lys Pro Ala Lys Asn Ile Ile Leu Leu Ile Gly Asp Gly Met Gly Asp

195 200 205

Ser Glu Ile Thr Ala Ala Arg Asn Tyr Ala Glu Gly Ala Gly Gly Phe

210 215 220

Phe Lys Gly Ile Asp Ala Leu Pro Leu Thr Gly Gln Tyr Thr His Tyr

225 230 235 240

Ala Leu Asn Lys Lys Thr Gly Lys Pro Asp Tyr Val Thr Asp Ser Ala

245 250 255

Ala Ser Ala Thr Ala Trp Ser Thr Gly Val Lys Thr Tyr Asn Gly Ala

260 265 270

Leu Gly Val Asp Ile His Glu Lys Asp His Pro Thr Ile Leu Glu Met

275 280 285

Ala Lys Ala Ala Gly Leu Ala Thr Gly Asn Val Ser Thr Ala Glu Leu

290 295 300

Gln Asp Ala Thr Pro Ala Ala Leu Val Ala His Val Thr Ser Arg Lys

305 310 315 320

Cys Tyr Gly Pro Ser Ala Thr Ser Gln Lys Cys Pro Gly Asn Ala Leu

325 330 335

Glu Lys Gly Gly Lys Gly Ser Ile Thr Glu Gln Leu Leu Asn Ala Arg

340 345 350

Ala Asp Val Thr Leu Gly Gly Gly Ala Lys Thr Phe Ala Glu Thr Ala

355 360 365

Thr Ala Gly Glu Trp Gln Gly Lys Thr Leu Arg Glu Glu Ala Glu Ala

370 375 380

Arg Gly Tyr Gln Leu Val Ser Asp Ala Ala Ser Leu Asn Ser Val Thr

385 390 395 400

Glu Ala Asn Gln Gln Lys Pro Leu Leu Gly Leu Phe Ala Asp Gly Asn

405 410 415

Met Pro Val Arg Trp Leu Gly Pro Lys Ala Thr Tyr His Gly Asn Ile

420 425 430

Asp Lys Pro Ala Val Thr Cys Thr Pro Asn Pro Gln Arg Asn Asp Ser

435 440 445

Val Pro Thr Leu Ala Gln Met Thr Asp Lys Ala Ile Glu Leu Leu Ser

450 455 460

Lys Asn Glu Lys Gly Phe Phe Leu Gln Val Glu Gly Ala Ser Ile Asp

465 470 475 480

Lys Gln Asn His Ala Ala Asn Pro Cys Gly Gln Ile Gly Glu Thr Val

485 490 495

Asp Leu Asp Glu Ala Val Gln Arg Ala Leu Glu Phe Ala Lys Lys Glu

500 505 510

Gly Asn Thr Leu Val Ile Val Thr Ala Asp His Ala His Ala Ser Gln

515 520 525

Ile Val Ala Pro Asp Thr Lys Ala Pro Gly Leu Thr Gln Ala Leu Asn

530 535 540

Thr Lys Asp Gly Ala Val Met Val Met Ser Tyr Gly Asn Ser Glu Glu

545 550 555 560

Asp Ser Gln Glu His Thr Gly Ser Gln Leu Arg Ile Ala Ala Tyr Gly

565 570 575

Pro His Ala Ala Asn Val Val Gly Leu Thr Asp Gln Thr Asp Leu Phe

580 585 590

Tyr Thr Met Lys Ala Ala Leu Gly Leu Lys

595 600

<210> 5

<211> 581

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Thr Ser Tyr Asp Ile Asp Trp Val Arg Gln Leu Lys Gly Lys Trp Asp

1 5 10 15

Gly Thr Pro Glu Gln Gly Leu Thr Asn Glu Asp Ser Pro Glu Asp Thr

20 25 30

Ala Ala Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

35 40 45

Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Gly Gly Ala Lys Asn Thr Val

50 55 60

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Ser Tyr Tyr Gly Ala Trp Phe Arg Gln Ala

65 70 75 80

Pro Gly Lys Glu Ala Val Tyr Tyr Cys Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu

85 90 95

Trp Ile Gln Leu Arg Glu Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Pro

100 105 110

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Phe Val Ala Val Val Asn Trp

115 120 125

Ser Gly Arg Thr Thr Pro Glu Met Pro Val Leu Glu Asn Arg Ala Ala

130 135 140

Gln Gly Asn Ile Thr Ala Pro Gly Gly Ala Arg Arg Leu Thr Gly Asp

145 150 155 160

Gln Thr Ala Ala Leu Arg Asn Ser Leu Ser Asp Lys Pro Ala Lys Asn

165 170 175

Ile Ile Leu Leu Ile Gly Asp Gly Met Gly Asp Ser Glu Ile Thr Ala

180 185 190

Ala Arg Asn Tyr Ala Glu Gly Ala Gly Gly Phe Phe Lys Gly Ile Asp

195 200 205

Ala Leu Pro Leu Thr Gly Gln Tyr Thr His Tyr Ala Leu Asn Lys Lys

210 215 220

Thr Gly Lys Pro Asp Tyr Val Thr Asp Ser Ala Ala Ser Ala Thr Ala

225 230 235 240

Trp Ser Thr Gly Val Lys Thr Tyr Asn Gly Ala Leu Gly Val Asp Ile

245 250 255

His Glu Lys Asp His Pro Thr Ile Leu Glu Met Ala Lys Ala Ala Gly

260 265 270

Leu Ala Thr Gly Asn Val Ser Thr Ala Glu Leu Gln Asp Ala Thr Pro

275 280 285

Ala Ala Leu Val Ala His Val Thr Ser Arg Lys Cys Tyr Gly Pro Ser

290 295 300

Ala Thr Ser Gln Lys Cys Pro Gly Asn Ala Leu Glu Lys Gly Gly Lys

305 310 315 320

Gly Ser Ile Thr Glu Gln Leu Leu Asn Ala Arg Ala Asp Val Thr Leu

325 330 335

Gly Gly Gly Ala Lys Thr Phe Ala Glu Thr Ala Thr Ala Gly Glu Trp

340 345 350

Gln Gly Lys Thr Leu Arg Glu Glu Ala Glu Ala Arg Gly Tyr Gln Leu

355 360 365

Val Ser Asp Ala Ala Ser Leu Asn Ser Val Thr Glu Ala Asn Gln Gln

370 375 380

Lys Pro Leu Leu Gly Leu Phe Ala Asp Gly Asn Met Pro Val Arg Trp

385 390 395 400

Leu Gly Pro Lys Ala Thr Tyr His Gly Asn Ile Asp Lys Pro Ala Val

405 410 415

Thr Cys Thr Pro Asn Pro Gln Arg Asn Asp Ser Val Pro Thr Leu Ala

420 425 430

Gln Met Thr Asp Lys Ala Ile Glu Leu Leu Ser Lys Asn Glu Lys Gly

435 440 445

Phe Phe Leu Gln Val Glu Gly Ala Ser Ile Asp Lys Gln Asn His Ala

450 455 460

Ala Asn Pro Cys Gly Gln Ile Gly Glu Thr Val Asp Leu Asp Glu Ala

465 470 475 480

Val Gln Arg Ala Leu Glu Phe Ala Lys Lys Glu Gly Asn Thr Leu Val

485 490 495

Ile Val Thr Ala Asp His Ala His Ala Ser Gln Ile Val Ala Pro Asp

500 505 510

Thr Lys Ala Pro Gly Leu Thr Gln Ala Leu Asn Thr Lys Asp Gly Ala

515 520 525

Val Met Val Met Ser Tyr Gly Asn Ser Glu Glu Asp Ser Gln Glu His

530 535 540

Thr Gly Ser Gln Leu Arg Ile Ala Ala Tyr Gly Pro His Ala Ala Asn

545 550 555 560

Val Val Gly Leu Thr Asp Gln Thr Asp Leu Phe Tyr Thr Met Lys Ala

565 570 575

Ala Leu Gly Leu Lys

580

<210> 6

<211> 589

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Leu Gly Leu Val Gln Ala Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Asn Ser Ser Thr Val Ser Ile Ala

20 25 30

Arg Ile Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Arg Glu Leu Val Ala Ala Ile

35 40 45

Asn Ile Tyr Asn Ser Arg Asp Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Ser Arg

50 55 60

Asp Asn Ala Lys Arg Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro

65 70 75 80

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Met Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser

85 90 95

Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

100 105 110

Ala Ser Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala

115 120 125

Ser Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Arg Leu Ser Cys Thr Pro Glu Met

130 135 140

Pro Val Leu Glu Asn Arg Ala Ala Gln Gly Asn Ile Thr Ala Pro Gly

145 150 155 160

Gly Ala Arg Arg Leu Thr Gly Asp Gln Thr Ala Ala Leu Arg Asn Ser

165 170 175

Leu Ser Asp Lys Pro Ala Lys Asn Ile Ile Leu Leu Ile Gly Asp Gly

180 185 190

Met Gly Asp Ser Glu Ile Thr Ala Ala Arg Asn Tyr Ala Glu Gly Ala

195 200 205

Gly Gly Phe Phe Lys Gly Ile Asp Ala Leu Pro Leu Thr Gly Gln Tyr

210 215 220

Thr His Tyr Ala Leu Asn Lys Lys Thr Gly Lys Pro Asp Tyr Val Thr

225 230 235 240

Asp Ser Ala Ala Ser Ala Thr Ala Trp Ser Thr Gly Val Lys Thr Tyr

245 250 255

Asn Gly Ala Leu Gly Val Asp Ile His Glu Lys Asp His Pro Thr Ile

260 265 270

Leu Glu Met Ala Lys Ala Ala Gly Leu Ala Thr Gly Asn Val Ser Thr

275 280 285

Ala Glu Leu Gln Asp Ala Thr Pro Ala Ala Leu Val Ala His Val Thr

290 295 300

Ser Arg Lys Cys Tyr Gly Pro Ser Ala Thr Ser Gln Lys Cys Pro Gly

305 310 315 320

Asn Ala Leu Glu Lys Gly Gly Lys Gly Ser Ile Thr Glu Gln Leu Leu

325 330 335

Asn Ala Arg Ala Asp Val Thr Leu Gly Gly Gly Ala Lys Thr Phe Ala

340 345 350

Glu Thr Ala Thr Ala Gly Glu Trp Gln Gly Lys Thr Leu Arg Glu Glu

355 360 365

Ala Glu Ala Arg Gly Tyr Gln Leu Val Ser Asp Ala Ala Ser Leu Asn

370 375 380

Ser Val Thr Glu Ala Asn Gln Gln Lys Pro Leu Leu Gly Leu Phe Ala

385 390 395 400

Asp Gly Asn Met Pro Val Arg Trp Leu Gly Pro Lys Ala Thr Tyr His

405 410 415

Gly Asn Ile Asp Lys Pro Ala Val Thr Cys Thr Pro Asn Pro Gln Arg

420 425 430

Asn Asp Ser Val Pro Thr Leu Ala Gln Met Thr Asp Lys Ala Ile Glu

435 440 445

Leu Leu Ser Lys Asn Glu Lys Gly Phe Phe Leu Gln Val Glu Gly Ala

450 455 460

Ser Ile Asp Lys Gln Asn His Ala Ala Asn Pro Cys Gly Gln Ile Gly

465 470 475 480

Glu Thr Val Asp Leu Asp Glu Ala Val Gln Arg Ala Leu Glu Phe Ala

485 490 495

Lys Lys Glu Gly Asn Thr Leu Val Ile Val Thr Ala Asp His Ala His

500 505 510

Ala Ser Gln Ile Val Ala Pro Asp Thr Lys Ala Pro Gly Leu Thr Gln

515 520 525

Ala Leu Asn Thr Lys Asp Gly Ala Val Met Val Met Ser Tyr Gly Asn

530 535 540

Ser Glu Glu Asp Ser Gln Glu His Thr Gly Ser Gln Leu Arg Ile Ala

545 550 555 560

Ala Tyr Gly Pro His Ala Ala Asn Val Val Gly Leu Thr Asp Gln Thr

565 570 575

Asp Leu Phe Tyr Thr Met Lys Ala Ala Leu Gly Leu Lys

580 585

<210> 7

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser

20 25 30

Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe

35 40 45

Val Ala Val Val Asn Trp Ser Gly Arg Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Asn

85 90 95

Cys Ala Ala Gly Lys Trp Asp Gly Ser Tyr Tyr Gly Ala Pro Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Leu Glu His His His

115 120 125

His His His

130

<210> 8

<211> 392

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgcagctgc aactggttga atctggtggt ggtctggttc aagcaggtgg ttccctgcgt 60

ctgtcttgcg ctgcgagcgg tcgtaccttc tctagctacg gatgggttgg ttccgtcagg 120

ctccgggtaa agaacgcgag ttcgttgcgg tagttaactg gtctggtcgt cgcacttact 180

acgctgactc cgtaaaaggt cgttttacca tttctcgtga caatgcaaaa aacaccgtct 240

acctgcagat gaattccctg aaaccggaag ataccgccgt ctacaactgc gccgcgggta 300

aatgggatgg ttcttactac ggcgcaccag attactgggg tcagggcacc caggttactg 360

ttagctctct ggagcaccac catcaccacc ac 392

Claims

1.一种真菌毒素磁化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括链霉亲和素磁微粒、生物素标记的真菌毒素抗原、真菌毒素标准品溶液、真菌毒素纳米抗体-碱性磷酸酶双功能融合蛋白、样本稀释液、洗涤液、底物液；

所述真菌毒素纳米抗体-碱性磷酸酶双功能融合蛋白是以碱性磷酸酶作为生物发光的催化剂，将真菌毒素纳米抗体与碱性磷酸酶融合表达获得；所述真菌毒素纳米抗体选自骆驼科或鲨鱼科动物的重链抗体；

所述真菌毒素纳米抗体-碱性磷酸酶双功能融合蛋白的氨基酸序列如以下中的任一种或多种：

脱氧雪腐镰刀菌烯醇纳米抗体-碱性磷酸酶双功能融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示；

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的真菌毒素纳米抗体-碱性磷酸酶双功能融合蛋白是通过下述方法制备的：

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磁微粒是以四氧化三铁或三氧化二铁超顺磁性材料为内核，外围包覆聚苯乙烯或葡聚糖，通过物理或化学的方法活化使磁微粒表面产生氨基、甲苯磺酰基、羧基或环氧基基团，粒径为1-2μm。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述链霉亲和素磁微粒是将链霉亲和素与磁微粒偶联。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的真菌毒素抗原是先将真菌毒素和牛血清白蛋白偶联，再将得到的牛血清白蛋白-真菌毒素复合物和生物素偶联。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述真菌毒素标准品溶液是将真菌毒素标准品溶于甲醇-水混合溶液中配制而成。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述甲醇-水混合溶液中，甲醇与水的体积比为20:80-80:20。

8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述底物液是浓度为0.5-2mmol/L的(4-氯苯巯基)(10-甲基-9,10-二氢化吖啶亚甲基)磷酸二钠盐溶液。

9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述样本稀释液由0.01M磷酸盐缓冲液、0.1％吐温20和0.5％牛血清白蛋白组成。

10.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液由0.01MTris-HCl缓冲液和0.1％吐温20组成。

11.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反应管。

12.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述反应管的材料为透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。

13.权利要求1-12任一所述的试剂盒在检测真菌毒素中的应用。

14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述试剂盒在检测食用油、食品、粮食、饲料或中草药中真菌毒素的应用。

15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述食用油包括花生油、玉米油、大豆油、菜籽油、葵花籽油、油菜籽油、芝麻油、橄榄油中的一种。

16.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，使用真菌毒素全自动分析仪进行真菌毒素检测。

17.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述真菌毒素包括黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、伏马毒素、赭曲霉毒素A、T-2毒素中的一种或多种。