CN112710826A - 一种提高试剂稳定性的包被和封闭方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种提高试剂稳定性的包被和封闭方法。具体而言,涉及一种提高胶乳试剂稳定性的包被方法,其特征在于以PEG衍生物作为封闭剂来提高试剂的稳定性,并通过优化工作液的pH来达到最佳效果。本申请以PEG衍生物代替传统的封闭剂(包含BSA、或Tween、或表面活性剂的缓冲体系),提高了胶乳试剂的热稳定性、货架稳定性及开盖稳定性。
Description
技术领域
本申请属于体外诊断医学检验领域,涉及一种提高胶乳试剂稳定性的方法。
背景技术
在典型的免疫分析方法中,基于抗原和抗体之间的特异性识别。亲和作用是一系列非共价相互作用(亲疏水作用、静电作用、氢键等)的总称。通常将抗体或抗原包被到固相载体上,以便于捕获样本中的目标分子。然而,在复杂的样本环境中存在各种非目标分子可能在不同程度上产生吸附,称为非特异性吸附。
例如,固相载体的表面(如ELISA板、NC膜、PVDF膜上)有很多洞,通过电转或包被将靶蛋白转移到膜上、或抗原/抗体固定在板上,蛋白以填补/堆积或吸附、或共价的方式结合于固相载体的表面。要包被的靶蛋白填补进表面的洞里,但并不是连续的,而有很多空隙并没有填进靶蛋白,而样本中其他蛋白也会被吸附在空的洞里,这样就会有很多非特异性的信号。
本领域中为避免这种情况的现有技术是:封闭液中的蛋白可以与表面上的空白位置结合,以避免一抗的非特异结合,所以实现了对固相载体上空白位置的“封闭”。封闭剂应封闭所有的未结合位点,而不替换表面上的靶蛋白、不结合靶蛋白表位、也不与抗体或检测试剂有交叉反应。
本领域中已知的封闭剂包括:
-BSA:是最常用的封闭剂。大部分BSA中有少量的抗体残留,会导致抗原/抗体之间的交叉反应,产生高背景,杂带较多或使得本底水平增高。
-脱脂奶粉:优点是成本低,但是由于成分相对复杂,所以适用范围窄,而且封闭后的固相载体不易长期保存。
-酪蛋白:和BSA作用类似。
-血清:封闭血清的原理包括:第一是待检样本会有些与蛋白非特异性结合的物质,可以用BSA或血清封闭掉这部分非特异性的结合;第二是待检样本中可能有Fc受体可以和抗体的恒定区结合;封闭血清中的抗体可以封闭Fc受体。但封闭血清中不能含有待测目标,且不应与一抗来源相同。
-非蛋白化合物:例如,甲醛用于封闭PVDF,使之失去结合蛋白的疏水力;吐温20对非特异性吸附有洗脱作用,可以降低蛋白间的疏水作用,可提高特异性抗体的识别能力。
以胶乳增强免疫比浊法(LTIA)为例,它是一种检测样本中蛋白含量或水平的均相免疫比浊方法。LTIA利用胶乳凝集作用放大样本中抗原与抗体的结合反应,用已知浓度的检测物测出的吸光度变化量,作出剂量-反应曲线,未知浓度的检测物可以从该曲线推算出来。LTIA是在均相反应体系中进行抗原抗体的反应和结果的测定,抗原-抗体反应后直接测定反应液的吸光度值,省却了ELISA法反复孵育和洗板等繁琐的操作步骤。此外,胶乳增强免疫比浊法试剂盒的使用步骤简化,避免了许多人为操作因素和试剂,环境等外界因素的干扰,准确性和重复性都较好。
在LTIA反应体系中,结合有靶向成分(如单抗)的固相载体是胶乳颗粒。现有技术中,在胶乳颗粒和靶向成分(如单抗)结合之后,通常加入惰性蛋白(如牛血清白蛋白BSA或卵清蛋白OVA)以封闭胶乳颗粒上未结合靶向成分(如单抗)的位置,但仍会产生较高的背景信号,影响检测结果。
现有的胶乳增强免疫比浊试剂盒还面临各种稳定性问题,例如热稳定性、开盖稳定性、4℃长期稳定性(也作货架稳定性)等。
因此,有必要提供一种新的包被或封闭方法以提高试剂的稳定性。
发明内容
基于本领域的需求,本公开提供了一种PEG衍生物其作为封闭剂的新用途。还提供了PEG衍生物在制备封闭剂中的用途。
所述封闭剂是指固相载体的封闭剂。具体而言,本公开的封闭剂是指在临床检测、诊断、生化分析、生物技术、生物制品、生物材料领域中,用于封闭固相载体表面上未结合目标分子的空白位点的试剂。
在一些实施方案中,提供了一种PEG衍生物作为封闭剂的用途,所述PEG衍生物选自以下的一项或组合:聚醚胺、聚赖氨酸、聚乙二醇单甲醚、聚乙二醇月桂酸酯、聚氧乙烯双胺。
在一些实施方案中,提供了PEG衍生物在制备封闭剂中的用途,所述PEG衍生物选自以下的一项或组合:聚醚胺、聚赖氨酸、聚乙二醇单甲醚、聚乙二醇月桂酸酯、聚氧乙烯双胺。
在一些实施方案中,所述PEG衍生物的分子(平均分子量)是200至20000,例如200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000、20000±10%;优选2000至5000。
本领域技术人员,可以根据已知方法确定聚醚多元醇的分子量。例如但不限于GB/T 12008.3-2009聚醚多元醇中第3部分关于羟值的测定,从而间接确定分子量。
在一些实施方案中,所述固相载体选自以下的一项或组合:微孔板、膜、玻璃、微流控芯片、胶乳颗粒、磁颗粒、非磁性高分子颗粒、金属纳米颗粒、无机颗粒、荧光纳米颗粒。
在一些具体的实施方案中,所述固相载体是胶乳颗粒。
在一些具体的实施方案中,聚苯乙烯胶乳颗粒。
在一些具体的实施方案中,所述固相载体是微孔板。
在一些具体的实施方案中,所述固相载体是膜,比如NC膜、PVDF膜。
在一些具体的实施方案中,所述固相载体是磁颗粒。
在一些具体的实施方案中,所述固相载体是芯片。
在一些实施方案中,固相载体上带有选自以下一种的官能团或组合:羧基、羟基、氨基、甲苯磺酰基、醛基、酰肼、硅羟基、琥珀酰亚胺酯、环氧基。
在一些实施方案中,所述固相载体上包被有兴趣分子,所述兴趣分子选自以下的一项或组合:抗体、抗原结合片段、抗原。
在一些实施方案中,抗原选自以下的一项或组合:分子量大于等于10000Da的蛋白、分子量小于10000Da的多肽、激素、糖、多核苷酸、脂质、小分子药物。
在优选的实施方案中,兴趣分子是分子量大于等于10000Da的蛋白、分子量小于10000Da的多肽、抗体、抗原结合片段。
根据一些实施方案,本公开提供了一种将兴趣分子包被到固相载体的方法,包括步骤:
1)提供固相载体,使所述固相载体与活化剂接触得到活化的固相载体;
2)提供兴趣分子;
3)在PEG衍生物存在时,使所述兴趣分子与所述活化的固相载体接触,得到包被有兴趣分子的固相载体;
4)使所述包被有兴趣分子的固相载体与PEG衍生物接触,得到经封闭的包被有兴趣分子的固相载体。
在一些包被方法的实施方案中,步骤1)和步骤2)能够互换顺序或并行。
在一些包被方法的实施方案中,所述兴趣分子选自以下的一项或组合:抗体、抗原结合片段、抗原。
在一些包被方法的实施方案中,所述抗原选自以下的一项或组合:分子量大于等于10000Da的蛋白、分子量小于10000Da的多肽、激素、糖、多核苷酸、脂质、小分子药物。
在一些包被方法的实施方案中,所述PEG衍生物选自以下的一项或组合:聚醚胺、聚赖氨酸、聚乙二醇单甲醚、聚乙二醇月桂酸酯、聚氧乙烯双胺。
在一些包被方法的实施方案中,所述PEG衍生物的分子量是200至20000,优选2000至5000。
在一些包被方法的实施方案中,所述固相载体选自以下的一项或组合:微孔板、膜、玻璃、微流控芯片、胶乳颗粒、磁颗粒、非磁性高分子颗粒、金属纳米颗粒、无机颗粒、荧光纳米颗粒。
在一些包被方法的实施方案中,所述固相载体带有选自以下的活性官能团:羧基、羟基、氨基、甲苯磺酰基、醛基、酰肼、硅羟基、琥珀酰亚胺酯、环氧基、或其组合。
在一些包被方法的实施方案中,所述活化剂的当量是所述固相载体的活性官能团的1倍至2倍。
在一些包被方法的实施方案中,所述活化剂选自以下的一项或组合:EDC、NHS、DCC、DIC。
在一些包被方法的实施方案中,当所述固相载体选自以下的一项或组合时,在缓冲液中提供所述固相载体:胶乳颗粒、磁颗粒、非磁性高分子颗粒、金属纳米颗粒、无机颗粒、荧光纳米颗粒。
在一些包被方法的实施方案中,所述缓冲液的pH是6至9;例如6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0±10%;优选7.0至8.5。
在一些包被方法的实施方案中,所述缓冲液选自:Hepes、PIPES、MES、甘氨酸缓冲液。
在一些包被方法的实施方案中,步骤1)中,在18℃至40℃,优选22℃至37℃(如,22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃±10%),使所述固相载体与所述活化剂接触20min至3h(如20min、22min、24min、26min、28min、30min、35min、40min、45min、50min、55min、60min±10%)。
在一些包被方法的实施方案中,步骤3)中,在18℃至40℃,优选22℃至37℃使所述兴趣分子与所述活化的固相载体接触2h至5h(如2、2.5、3、3.5、4、4.5、5h±10%)。
在一些包被方法的实施方案中,步骤4)中,在18℃至40℃,优选22℃至37℃使所述包被有兴趣分子的固相载体与所述PEG衍生物接触12h至24h(如12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24h±10%)。
在一些包被方法的实施方案中,步骤2)中,所述兴趣分子的量是0.5mg/每平方米至5mg/每平方米固相载体表面积(如0.5mg、1mg、1.5mg、2mg、2.5mg、3mg、3.5mg、4mg、4.5mg、5mg/每平方米±10%);优选1.5mg/每平方米至2.5mg/每平方米固相载体表面积。
应当理解,待包被的兴趣分子随着分子的结构不同,分子量差异较大;技术人员根据检测需要,结合载体表面的大小选择适当的兴趣分子浓度/用量范围,以有利于实现与待检物的结合/捕获。
在一些包被方法的实施方案中,在步骤3)中,所述PEG衍生物和所述兴趣分子(如,蛋白(抗原、抗体)或多肽时)的比例为按质量计0.6:1至4:1(如0.6:1、0.7:1、0.8:1、0.9:1、1:1、1.1:1、1.2:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1),优选1.2:1至2:1。
在一些包被方法的实施方案中,在步骤4)中,所述PEG衍生物的量足以封闭固相载体上的未结合位点。
作为非限制性示例,在一些具体的实施方案中,在步骤4)中当固相载体是胶乳颗粒时,所述PEG衍生物与所述包被有兴趣分子的固相载体的比例为按质量计0.1:1至10:1(如0.1:1、0.2:1、0.3:1、0.4:1、0.5:1、0.6:1、0.7:1、0.8:1、0.9:1、1:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1),优选0.3:1至3:1。
本公开提供了一种包被有兴趣分子的固相载体,其是通过前述方法制备所得的。
本公开提供了一种包被有兴趣分子的固相载体,其包含以下或由其组成:如前所述的兴趣分子、如前所述的固相载体、如前所述的PEG衍生物;所述兴趣分子和所述PEG衍生物分别共价结合至所述固相载体的表面。
附图说明
图1:本申请的方法和对照方法所制备的试剂之间标准曲线的比较。◆制备例1;●制备例2;▲制备例3;■制备例4(对照)。
具体实施方式
为了使本申请易于理解,下面以胃蛋白酶原I(PGI)的抗体为具体示例,进一步阐述本申请的制备方法。
除非另有指明,“%”表示质量/体积。以下提供了本申请实施方式中所使用的具体材料及其来源。但是,应当理解的是,这些仅仅是示例性的,并不意图限制。与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本申请的技术方案。
制备例
制备例1:包被颗粒的制备方法1
1)将150μl的聚苯乙烯胶乳颗粒(羧基修饰)与1.5mL 50mM的Hepes缓冲液(pH8)混合均匀,放置摇床升温至37℃;摇床转速150rpm;
2)现称0.0100g碳化二亚胺溶解于1mL 50mM的Hepes缓冲液(pH8)中,向混合充分的聚苯乙烯胶乳颗粒中加入碳化二亚胺溶液30μl并迅速摇匀,37℃活化1h,得到活化的聚苯乙烯胶乳颗粒;
3)将0.5mg PGI抗体与30μL浓度2%的PEG衍生物(聚(L-赖氨酸)-PEG-SH,平均分子量2000)混匀后(相当于1.2:1),与活化的聚苯乙烯胶乳颗粒进行交联,37℃振荡3.5h;离心,去上清液;
4)对步骤3)得到的胶乳颗粒用0.3mL浓度2%的PEG衍生物进行封闭,放置37℃振荡12至24小时;
5)离心,去上清液,超声分散后置于8mL工作液(0.5%BSA、8%蔗糖、0.05%NaN3、50mM甘氨酸缓冲液pH8.0)中形成第二试剂。
制备例2:包被颗粒的制备方法2
和制备例1相比,区别仅在于步骤1)至步骤4)中的温度替换为室温(18至25℃)。
制备例3:包被颗粒的制备方法3
和制备例2相比,区别仅在于工作液pH替换为7.0。
制备例4:对照制备方法
和制备例1相比,区别仅在于将PEG衍生物替换为BSA(例如1%BSA)。
制备例5:第一试剂
第一试剂组成:0.3M NaCl、0.1%Tween-80、0.2%PEG、0.1%NaN3、pH7.5。
制备例6:试剂盒的组装
试剂盒1:第一试剂+制备例1的第二试剂;
试剂盒2:第一试剂+制备例2的第二试剂;
试剂盒3:第一试剂+制备例3的第二试剂;
试剂盒4:第一试剂+制备例4的第二试剂。
测试例
测试例1:热稳定性
本申请方法所得包被颗粒的试剂盒与对照方法所得包被颗粒的试剂盒进行稳定性比较。
表1.热稳定性
由表1可得知本申请方法制备的包被颗粒所得试剂盒其37℃热稳定性明显优于对照方法。37℃放置7天后吸光度下降均低于10%。
测试例2:开盖稳定性
连续两周,对浓度在30ng/ml至70ng/ml的血清样本进行开盖实验,比较本申请方法(制备例1、2、3)与对照方法制备的试剂盒其测值变化率情况如下表。
表2.开盖稳定性(4℃)
天数 | 制备例1 | 制备例2 | 制备例3 | 对照 |
0天 | 0.5% | 0.0% | 1.2% | 2.4% |
2天 | 0.6% | 1.5% | 1.9% | 1.7% |
4天 | -1.0% | -0.9% | 1.8% | 1.8% |
7天 | 0.8% | 1.0% | 2.3% | 2.6% |
9天 | 1.2% | 0.2% | 1.9% | 2.7% |
11天 | -0.6% | 0.7% | 2.5% | 3.0% |
13天 | 1.2% | -0.6% | 2.1% | 2.6% |
16天 | -0.5% | -1.5% | 2.8% | 3.1% |
由表2得本申请方法与对照方法制备的试剂盒开盖稳定性均在5%以下,都在可接受范围内。但是比较可见,本申请方法制备的试剂盒开盖稳定性显著优于对照试剂。
测试例3:货架稳定性
表3.制备例3的结果
表4.对照的结果
由表3和表4可知,本申请方法制备的试剂在4℃放置4个月其吸光度下降低于5%;对照试剂4℃放置4个月吸光度下降大于10%。本申请方法制备的试剂货架稳定性明显优于对照试剂。制备例1、2、3结果相近,此处仅提供了制备例3和对照试剂的结果。
由本申请方法生产的试剂盒,其热稳定性和开盖稳定性都优于对照试剂盒,使试剂在保存和使用过程导致的变化更小,使得测值结果更有保障,进一步保证了检验结果的精准。
对比例
对比例A:
相比于制备例1,区别在于将PEG衍生物替换为分子量1000(或更小)或6000(或更高)的PEG衍生物,制得的试剂盒按照测试例1进行测试,其热稳定性和试剂盒4无统计学显著差异(数据未显示),不如分子量为2000至5000时。
对比例B:
相比于制备例1,区别在于将PEG衍生物和抗体的比例(按质量计)替换为0.5:1(或更低)或5:1(或更高),发现显著影响包被效果,不如比例范围在1.2:1至2:1之间时。比例过低,则观察到非特异性吸附,背景信号偏高,同时稳定性测试结果和试剂盒4无统计学显著差异;过高时,稳定性测试尚可,但试剂灵敏度不足(数据未显示)。
本申请采用的是不同于常规的封闭方法,提供了新型封闭剂,使封闭效果大大提升。以往的交联方法待包被的抗体与BSA在缓冲液中混合后再与活化的胶乳颗粒反应。而本申请所用的方法,用与PEG衍生物接触过的抗体,包被碳化二亚胺活化过的苯乙烯胶乳颗粒。不限于具体理论,例如当PEG衍生聚合物的一端含有活性基团(例如氨基)时,可以通过共价结合固定在带有基团修饰(例如羧基等)的固相表面;此外,带有氨基的部分带有正电荷,可以通过静电作用吸附在带负电荷的固相表面或蛋白上,而实现包被。与常规的胶乳增强免疫比浊方法相比,本申请方法得到稳定性更佳的试剂。
Claims (10)
1.一种将兴趣分子包被到固相载体的方法,包括步骤:
1)提供固相载体,使所述固相载体与活化剂接触得到活化的固相载体;
2)提供兴趣分子;
3)在PEG衍生物存在时,使所述兴趣分子与所述活化的固相载体接触,得到包被有兴趣分子的固相载体;
4)使所述包被有兴趣分子的固相载体与PEG衍生物接触,得到经封闭的包被有兴趣分子的固相载体;
步骤1)和步骤2)能够互换顺序或并行;
所述兴趣分子选自以下的一项或组合:抗体、抗原结合片段、抗原;
优选地,所述抗原选自以下的一项或组合:分子量大于等于10000Da的蛋白、分子量小于10000Da的多肽、激素、糖、多核苷酸、脂质、小分子药物;
所述PEG衍生物选自以下的一项或组合:聚醚胺、聚赖氨酸、聚乙二醇单甲醚、聚乙二醇月桂酸酯、聚氧乙烯双胺;
所述PEG衍生物的分子量是200至20000,优选2000至5000;
所述固相载体选自以下的一项或组合:微孔板、膜、玻璃、微流控芯片、胶乳颗粒、磁颗粒、非磁性高分子颗粒、金属纳米颗粒、无机颗粒、荧光纳米颗粒;
优选地,所述固相载体是胶乳颗粒;
优选地,所述固相载体带有选自以下的活性官能团:羧基、羟基、氨基、甲苯磺酰基、醛基、酰肼、硅羟基、琥珀酰亚胺酯、环氧基、或其组合;
所述活化剂的当量是所述固相载体的活性官能团的1倍至2倍;
优选,所述活化剂选自以下的一项或组合:EDC、NHS、DCC、DIC。
2.根据权利要求1所述的方法,其中:
当所述固相载体选自以下的一项或组合时,在缓冲液中提供所述固相载体:胶乳颗粒、磁颗粒、非磁性高分子颗粒、金属纳米颗粒、无机颗粒、荧光纳米颗粒;
所述缓冲液的pH是6至10,优选7.0至8.5;
所述缓冲液选自:Hepes、PIPES、MES、甘氨酸缓冲液。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中:
步骤1)中,在18℃至40℃,优选22℃至37℃,使所述固相载体与所述活化剂接触20min至3h;
和/或
步骤3)中,在18℃至40℃,优选22℃至37℃使所述兴趣分子与所述活化的固相载体接触2h至5h;
和/或
步骤4)中,在18℃至40℃,优选22℃至37℃使所述包被有兴趣分子的固相载体与所述PEG衍生物接触12h至24h。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其中:
步骤2)中,所述兴趣分子的量是0.5mg/每平方米至5mg/每平方米固相载体表面积;优选1.5mg/每平方米至2.5mg/每平方米固相载体表面积。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中:
在步骤3)中,所述PEG衍生物和所述兴趣分子的比例为按质量计0.6:1至4:1,优选1.2:1至2:1;
和/或
当固相载体是胶乳颗粒时,在步骤4)中,所述PEG衍生物的量足以封闭所述固相载体上的未结合位点;优选地,当固相载体是胶乳颗粒时,在步骤4)中所述PEG衍生物与所述包被有兴趣分子的固相载体的比例为按质量计0.1:1至10:1,优选0.3:1至3:1。
6.一种包被有兴趣分子的固相载体,其是通过权利要求1至5中任一项所述方法制备所得。
7.一种包被有兴趣分子的固相载体,其包含以下或由其组成:
-兴趣分子;
-固相载体;
-PEG衍生物;
所述兴趣分子和所述PEG衍生物分别共价结合至所述固相载体;
优选地,所述兴趣分子和所述PEG衍生物分别共价结合至所述固相载体的表面;
所述PEG衍生物选自以下的一项或组合:聚醚胺、聚赖氨酸、聚乙二醇单甲醚、聚乙二醇月桂酸酯、聚氧乙烯双胺;
所述PEG衍生物的分子量是200至20000,优选2000至5000;
所述固相载体选自以下的一项或组合:微孔板、膜、玻璃、微流控芯片、胶乳颗粒、磁颗粒、非磁性高分子颗粒、金属纳米颗粒、无机颗粒、荧光纳米颗粒;
优选地,所述固相载体是胶乳颗粒;
优选地,所述固相载体带有选自以下一种的官能团或组合:羧基、羟基、氨基、甲苯磺酰基、醛基、酰肼、硅羟基、琥珀酰亚胺酯、环氧基;
所述兴趣分子选自以下的一项或组合:抗体、抗原结合片段、抗原;
优选地,所述抗原选自以下的一项或组合:分子量大于等于10000Da的蛋白、分子量小于10000Da的多肽、激素、糖、多核苷酸、脂质、小分子药物。
8.PEG衍生物作为封闭剂的用途,其中:
所述PEG衍生物选自以下的一项或组合:聚醚胺、聚赖氨酸、聚乙二醇单甲醚、聚乙二醇月桂酸酯、聚氧乙烯双胺;
所述PEG衍生物的分子量是200至20000,优选2000至5000;
所述封闭剂是指固相载体的封闭剂;
所述固相载体选自以下的一项或组合:微孔板、膜、玻璃、微流控芯片、胶乳颗粒、磁颗粒、非磁性高分子颗粒、金属纳米颗粒、无机颗粒、荧光纳米颗粒;
优选地,所述固相载体是胶乳颗粒;
优选地,所述固相载体带有选自以下一种的官能团或组合:羧基、羟基、氨基、甲苯磺酰基、醛基、酰肼、硅羟基、琥珀酰亚胺酯、环氧基。
9.根据权利要求8所述的用途,其中所述固相载体上包被有兴趣分子,所述兴趣分子选自以下的一项或组合:抗体、抗原结合片段、抗原。
10.根据权利要求9所述的用途,所述抗原选自以下的一项或组合:分子量大于等于10000Da的蛋白、分子量小于10000Da的多肽、激素、糖、多核苷酸、脂质、小分子药物。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN117214443A (zh) * | 2023-11-09 | 2023-12-12 | 深圳市迈科龙生物技术有限公司 | 一种荧光微球的活化方法、定量检测血清淀粉样蛋白a的试剂盒及其制备方法 |
WO2024131903A1 (zh) * | 2022-12-23 | 2024-06-27 | 菲鹏生物股份有限公司 | 聚醚胺化合物及其制备方法和封闭剂 |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1639568A (zh) * | 2001-09-21 | 2005-07-13 | 宝生物工程株式会社 | 用于固定配体的载体 |
WO2006036003A1 (ja) * | 2004-09-28 | 2006-04-06 | Yukio Nagasaki | 生体特異的親和性を有する物質を結合した微粒子及びその使用 |
US20060240438A1 (en) * | 2003-07-28 | 2006-10-26 | Yukio Nagasaki | Surface of base material being inhibited in non-specific adsorption |
CN101381409A (zh) * | 1994-10-12 | 2009-03-11 | 安姆根有限公司 | N-端化学修饰的蛋白质组合物及方法 |
JP2009229320A (ja) * | 2008-03-24 | 2009-10-08 | Fujifilm Corp | 担体及びその製造方法 |
WO2010082681A1 (ja) * | 2009-01-16 | 2010-07-22 | 国立大学法人筑波大学 | 免疫ラテックス粒子及びその製造方法 |
US20110020649A1 (en) * | 2008-03-24 | 2011-01-27 | Fujifilm Corporation | Method for immobilization, physiologically active substance-immobilized carrier, carrier for immobilization, carrier, and process for producing carrier |
-
2020
- 2020-11-17 CN CN202011282832.9A patent/CN112710826A/zh active Pending
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101381409A (zh) * | 1994-10-12 | 2009-03-11 | 安姆根有限公司 | N-端化学修饰的蛋白质组合物及方法 |
CN1639568A (zh) * | 2001-09-21 | 2005-07-13 | 宝生物工程株式会社 | 用于固定配体的载体 |
US20060240438A1 (en) * | 2003-07-28 | 2006-10-26 | Yukio Nagasaki | Surface of base material being inhibited in non-specific adsorption |
WO2006036003A1 (ja) * | 2004-09-28 | 2006-04-06 | Yukio Nagasaki | 生体特異的親和性を有する物質を結合した微粒子及びその使用 |
JP2009229320A (ja) * | 2008-03-24 | 2009-10-08 | Fujifilm Corp | 担体及びその製造方法 |
US20110020649A1 (en) * | 2008-03-24 | 2011-01-27 | Fujifilm Corporation | Method for immobilization, physiologically active substance-immobilized carrier, carrier for immobilization, carrier, and process for producing carrier |
WO2010082681A1 (ja) * | 2009-01-16 | 2010-07-22 | 国立大学法人筑波大学 | 免疫ラテックス粒子及びその製造方法 |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2024131903A1 (zh) * | 2022-12-23 | 2024-06-27 | 菲鹏生物股份有限公司 | 聚醚胺化合物及其制备方法和封闭剂 |
CN117214443A (zh) * | 2023-11-09 | 2023-12-12 | 深圳市迈科龙生物技术有限公司 | 一种荧光微球的活化方法、定量检测血清淀粉样蛋白a的试剂盒及其制备方法 |
CN117214443B (zh) * | 2023-11-09 | 2024-01-23 | 深圳市迈科龙生物技术有限公司 | 一种荧光微球的活化方法、定量检测血清淀粉样蛋白a的试剂盒及其制备方法 |
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