CN117214443B - 一种荧光微球的活化方法、定量检测血清淀粉样蛋白a的试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医学检测技术领域，特别涉及一种荧光微球的活化方法、定量检测血清淀粉样蛋白A的试剂盒及其制备方法，荧光微球的活化方法包括以下步骤：S10、将荧光微球分散于缓冲液中，得荧光微球溶液；S20、将活化液与所述荧光微球溶液混合，得荧光微球活化液；其中，所述活化液包括碳二亚铵溶液、N‑羟基硫代琥珀酰亚胺钠溶液及二异丙基碳二亚胺溶液。本发明提供的技术方案中，采用EDC、NHS及DIC作为活化液的主要成分，能够增加荧光微球蛋白分子上结合NHS分子的个数，从而提高荧光微球蛋白的活化程度，降低SAA的最低检出限，进而具有更高的灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，特别涉及一种荧光微球的活化方法、定量检测血清淀粉样蛋白A的试剂盒及其制备方法。
背景技术
血清淀粉样蛋白A（serum amyloid A protein，SAA）是一种正向急性时相反应蛋白，是载脂蛋白家族中的一种异质类蛋白质，相对分子量约为12000。SAA是一种急性相蛋白并与血浆高密度脂蛋白（HDL）结合。
SAA是个灵敏的参数，它在炎性反应大约8h后开始升高，且超过参考范围上限时间早于C-反应蛋白（C-reactive protein，CRP），然而CRP在正常人中的中位数值与参考范围上限的差距，大约有10倍。在SAA中仅有5倍。轻微感染，例如，许多病毒感染，SAA升高要比CRP更为常见。在感染性疾病中，SAA的绝对上升要高于CRP，因此SAA测定，尤其对“正常”与微小急性相反应可提供更好的鉴别。通常约2/3感冒患者SAA升高，但少于1/2的患者相同表现CRP升高。在病毒感染病例中，SAA和CRP浓度升高见于腺病毒感染者。SAA和CRP的反应形式在急性感染的恢复阶段是平行的，这同时适用于细菌和病毒感染。
目前现有技术中，通常采用免疫分析技术检测SAA，而标记分子的活化程度低，结合抗体的能力低，对SAA的检测灵敏度低，仅能进行静脉血SAA的检测，未涉及指尖血SAA的检测，样本类型具有局限性。
发明内容
本发明的目的是提供一种荧光微球的活化方法、定量检测血清淀粉样蛋白A的试剂盒及其制备方法，旨在解决无法检测指尖血SAA的技术问题。
为实现上述目的，本发明提出一种荧光微球的活化方法，包括以下步骤：
S10、将荧光微球分散于缓冲液中，得荧光微球溶液；
S20、将活化液与所述荧光微球溶液混合，得荧光微球活化液；
其中，所述活化液包括碳二亚铵溶液、N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠溶液及二异丙基碳二亚胺溶液。
可选地，步骤S20包括：
S201、将碳二亚铵溶液与二异丙基碳二亚胺溶液混合，得混合液一；
S202、将N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠溶液与荧光微球溶液混合，得混合液二；
S203、将混合液一与混合液二混合，得荧光微球活化液。
本发明还提出一种定量检测血清淀粉样蛋白A的试剂盒，用于检测待测血液样本中血清淀粉样蛋白A的含量，所述定量检测血清淀粉样蛋白A的试剂盒包括试纸条、荧光微球标记结合物垫抗体及检测垫抗体；其中，所述荧光微球标记结合物垫抗体，包被于所述试纸条，用于与血清淀粉样蛋白A结合以形成“结合物垫抗体-血清淀粉样蛋白A”复合体，所述荧光微球标记结合物垫抗体中的荧光微球包括采用如上述荧光微球的活化方法获得的荧光微球；所述检测垫抗体，包被于所述试纸条，用于与“结合物垫抗体-血清淀粉样蛋白A”复合体结合，以形成“结合物垫抗体-血清淀粉样蛋白A-检测垫抗体”复合体。
本发明还提出一种定量检测血清淀粉样蛋白A的试剂盒的制备方法，用于制备上述的定量检测血清淀粉样蛋白A的试剂盒，包括以下步骤：
S100、将检测垫抗体包被在硝酸纤维素膜上，得检测垫；
S200、将荧光微球标记在结合物垫抗体上，得荧光微球标记的结合物垫抗体，将荧光微球标记的结合物垫抗体包被在另一硝酸纤维素膜上，得结合物垫；
S300、将样本垫、结合物垫、检测垫及吸水垫依次抵接并贴合在背板上，得试纸条；
其中，所述检测垫抗体包括第二检测抗体及第二质控抗体；
所述结合物垫抗体包括第一检测抗体及第一质控抗体；
所述荧光微球的活化方法包括以下步骤：
S10、将荧光微球分散于缓冲液中，得荧光微球溶液；
S20、将活化液与所述荧光微球溶液混合，得荧光微球活化液；
所述活化液包括碳二亚铵溶液、N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠溶液及二异丙基碳二亚胺溶液。
可选地，第一检测抗体包括血清淀粉样蛋白A第一抗体，第二检测抗体包括血清淀粉样蛋白A第二抗体；
第一质控抗体包括羊抗鸡IgY抗体，第二质控抗体包括鸡IgY抗体。
可选地，步骤S200中制备荧光微球标记的结合物垫抗体的步骤包括：
S210、将荧光微球分散于缓冲液中，得荧光微球溶液；
S220、将活化液与荧光微球溶液混合，得荧光微球活化液；
S230、将第一检测抗体及第一质控抗体分别与荧光微球活化液混合，得荧光微球偶联液；
S240、将封闭液与荧光微球偶联液混合，得荧光微球标记的结合物垫抗体；
其中，所述活化液包括碳二亚铵溶液、N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠溶液及二异丙基碳二亚胺溶液。
可选地，步骤S220包括：
S221、将碳二亚铵溶液与二异丙基碳二亚胺溶液混合，得混合液一；
S222、将N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠溶液与荧光微球溶液混合，得混合液二；
S223、将混合液一与混合液二混合，得荧光微球活化液。
可选地，荧光微球偶联液中，第一检测抗体及第一质控抗体的蛋白终浓度均为90~110ug/mL。
可选地，步骤S100包括：
S110、用缓冲液将第二检测抗体及第二质控抗体稀释至浓度为1.8~2.2mg/mL，包被于硝酸纤维素膜上，烘干。
可选地，步骤S200中将荧光微球标记的结合物垫抗体包被在另一硝酸纤维素膜上的步骤包括：
S250、用蛋白保护液将荧光微球标记的结合物垫抗体稀释90~110倍，包被于硝酸纤维素膜上，烘干。
本发明提供的技术方案中，通过采用碳二亚铵溶液（EDC溶液）、N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠溶液（NHS溶液）及二异丙基碳二亚胺溶液（DIC溶液）作为活化液，EDC首先与荧光微球蛋白结合，初步活化后荧光微球蛋白上仍有多个结合位点，EDC分子较大，难以与剩余的结合位点结合，而DIC分子较小，可与这些结合位点结合，以形成EDC-荧光微球蛋白-DIC结合物，在NHS的作用下，荧光微球蛋白上的EDC及DIC被NHS置换，形成NHS-荧光微球蛋白结合物，即活化荧光微球；采用EDC、NHS及DIC作为活化液的主要成分，能够增加荧光微球蛋白分子上结合NHS分子的个数，从而提高荧光微球蛋白的活化程度，降低SAA的最低检出限，进而具有更高的灵敏度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本发明一实施例中荧光微球的活化方法的流程示意图；
图2为本发明一实施例中荧光微球与活化液的混合方法的流程示意图；
图3为根据实施例1及对比例1对指尖血SAA的检测结果绘制的折线图；
图4为本发明一实施例中检测血清淀粉样蛋白A的试纸条的平面示意图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
目前现有技术中，通常采用免疫分析技术检测SAA，而标记分子的活化程度低，结合抗体的能力低，对SAA的检测灵敏度低，仅能进行静脉血SAA的检测，未涉及指尖血SAA的检测，样本类型具有局限性。
鉴于上述问题，本发明提出一种荧光微球的活化方法，请参阅图1，包括以下步骤：
S10、将荧光微球分散于缓冲液中，得荧光微球溶液；
S20、将活化液与所述荧光微球溶液混合，得荧光微球活化液；
其中，所述活化液包括碳二亚铵溶液、N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠溶液及二异丙基碳二亚胺溶液。
需要说明的是，缓冲液可以是三羟基氨基甲烷、磷酸盐缓冲溶液、醋酸、磷酸、磷酸盐、氯化钾、硼酸、硼酸-硼砂、柠檬酸、柠檬酸盐、Tris、4-吗啉乙磺酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸及哌嗪-1,4-二乙磺酸中的至少一种，在此不做限定，只要能够缓冲pH避免荧光微球变性即可；此外，荧光微球作为一种标记蛋白，可替换为胶体金标记或磁微粒标记，本发明在此不再一一赘述。
本发明提供的技术方案中，通过采用碳二亚铵溶液（EDC溶液）、N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠溶液（NHS溶液）及二异丙基碳二亚胺溶液（DIC溶液）作为活化液，EDC首先与荧光微球蛋白结合，初步活化后荧光微球蛋白上仍有多个结合位点，EDC分子较大，难以与剩余的结合位点结合，而DIC分子较小，可与这些结合位点结合，以形成EDC-荧光微球蛋白-DIC结合物，在NHS的作用下，荧光微球蛋白上的EDC及DIC被NHS置换，形成NHS-荧光微球蛋白结合物，即活化荧光微球；采用EDC、NHS及DIC作为活化液的主要成分，能够增加荧光微球蛋白分子上结合NHS分子的个数，从而提高荧光微球蛋白的活化程度。
进一步地，请参阅图2，步骤S20包括：
S201、将碳二亚铵溶液与二异丙基碳二亚胺溶液混合，得混合液一；
S202、将N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠溶液与荧光微球溶液混合，得混合液二；
S203、将混合液一与混合液二混合，得荧光微球活化液。
通过将EDC溶液及DIC溶液混合为混合液一，以使得混合液一与混合液二混合时EDC与DIC可同时参与对荧光微球的活化进程，提高荧光微球的活化程度；通过预先将NHS溶液与荧光微球溶液混合，可提前将NHS分散于荧光微球溶液中，以使得加入混合液一与混合液二混合时，NHS溶液可快速置换EDC及DIC，避免出现混合液一与荧光微球溶液混合后再加入NHS溶液导致的NHS置换不彻底的现象，从而提高荧光微球蛋白的活化程度。
本发明还提出一种定量检测血清淀粉样蛋白A的试剂盒，用于检测待测血液样本中血清淀粉样蛋白A的含量，所述定量检测血清淀粉样蛋白A的试剂盒包括：试纸条、荧光微球标记结合物垫抗体、检测垫抗体；其中，所述荧光微球标记结合物垫抗体，包被于所述试纸条，用于与血清淀粉样蛋白A结合以形成“结合物垫抗体-血清淀粉样蛋白A”复合体，所述荧光微球标记结合物垫抗体中的荧光微球包括采用如上述荧光微球的活化方法获得的荧光微球；所述检测垫抗体，包被于所述试纸条，用于与“结合物垫抗体-血清淀粉样蛋白A”复合体结合，以形成“结合物垫抗体-血清淀粉样蛋白A-检测垫抗体”复合体。
所述定量检测血清淀粉样蛋白A的试剂盒具有所述荧光微球的活化方法的所有技术方案，因而具有所述荧光微球的活化方法的所有有益效果，本发明在此不再一一赘述。
需要说明的是，待测血液样本可以是静脉血，也可以是指尖血，其中，静脉血中SAA的含量较高，指尖血中SAA的含量较低。
通过应用活化程度高的荧光微球，使得荧光微球在制成试纸条时，能够提高荧光微球结合抗体的能力，从而增加单个荧光微球所标记抗体的数量，以提高抗体结合SAA并产生荧光的能力，进而提高对SAA的检测灵敏性，从而能够应用于SAA含量较低的指尖血中SAA的检测。
本发明还提出一种定量检测血清淀粉样蛋白A的试剂盒，用于制备上述的定量检测血清淀粉样蛋白A的试剂盒，所述定量检测血清淀粉样蛋白A的试剂盒的制备方法包括以下步骤：
S100、将检测垫抗体包被在硝酸纤维素膜上，得检测垫；
S200、将荧光微球标记在结合物垫抗体上，得荧光微球标记的结合物垫抗体，将荧光微球标记的结合物垫抗体包被在另一硝酸纤维素膜上，得结合物垫；
S300、将样本垫、结合物垫、检测垫及吸水垫依次抵接并贴合在背板上，得试纸条；
其中，所述检测垫抗体包括第二检测抗体及第二质控抗体；
所述结合物垫抗体包括第一检测抗体及第一质控抗体；
所述荧光微球的活化方法包括以下步骤：
S10、将荧光微球分散于缓冲液中，得荧光微球溶液；
S20、将活化液与所述荧光微球溶液混合，得荧光微球活化液；
所述活化液包括碳二亚铵溶液、N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠溶液及二异丙基碳二亚胺溶液。
通过将荧光微球标记的结合物垫抗体包被于硝酸纤维素膜形成结合物垫，以使得荧光微球标记的结合物垫抗体能在层析过程中先后与SAA及检测垫抗体结合形成复合物并附着于检测垫上，未结合的荧光微球标记的结合物垫抗体层析至吸水垫，不影响检测垫上的荧光强度，从而提高SAA的检测准确性。
进一步地，第一检测抗体包括血清淀粉样蛋白A第一抗体，第二检测抗体包括血清淀粉样蛋白A第二抗体；
第一质控抗体包括羊抗鸡IgY抗体，第二质控抗体包括鸡IgY抗体。
如此设置，在样本层析至结合物垫时，荧光微球标记的SAA第一抗体首先与SAA结合，形成“SAA-一抗-荧光微球”复合物，当样本层析至结合物垫时，上述复合物与SAA第二抗体结合，形成“二抗-SAA-一抗-荧光微球”复合物，分段结合能够保证SAA与荧光标记的SAA第一抗体完全结合后再与二抗结合，避免发生SAA未及时与一抗结合导致样本中SAA未附着在检测垫上的现象，进一步提高SAA的检测准确性。
此外，步骤S200中制备荧光微球标记的结合物垫抗体的步骤包括：
S210、将荧光微球分散于缓冲液中，得荧光微球溶液；
S220、将活化液与荧光微球溶液混合，得荧光微球活化液；
S230、将第一检测抗体及第一质控抗体分别与荧光微球活化液混合，得荧光微球偶联液；
S240、将封闭液与荧光微球偶联液混合，得荧光微球标记的结合物垫抗体；
其中，所述活化液包括碳二亚铵溶液、N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠溶液及二异丙基碳二亚胺溶液。
需要说明的是，封闭液包括牛血清白蛋白及酪蛋白中的至少一种。通过采用EDC、NHS及DIC作为活化液的主要成分，能够增加荧光微球蛋白分子上结合NHS分子的个数，以使得活化的荧光微球蛋白能够与多个抗体偶联，从而提高荧光微球标记抗体与SAA结合时产生的荧光强度，进而提高SAA检测的灵敏度，降低SAA的最低检出限，以应用于指尖血SAA的检测。
进一步地，步骤S220包括：
S221、将碳二亚铵溶液与二异丙基碳二亚胺溶液混合，得混合液一；
S222、将N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠溶液与荧光微球溶液混合，得混合液二；
S223、将混合液一与混合液二混合，得荧光微球活化液。
通过将EDC溶液及DIC溶液混合为混合液一，以使得混合液一与混合液二混合时EDC与DIC可同时参与对荧光微球的活化进程，提高荧光微球的活化程度；通过预先将NHS溶液与荧光微球溶液混合，可提前将NHS分散于荧光微球溶液中，以使得加入混合液一与混合液二混合时，NHS溶液可快速置换EDC及DIC，避免出现混合液一与荧光微球溶液混合后再加入NHS溶液导致的NHS置换不彻底的现象，从而提高荧光微球蛋白的活化程度。
此外，荧光微球偶联液中，第一检测抗体及第一质控抗体的蛋白终浓度均为90~110ug/mL。
如此设置，保证结合物垫上的第一检测抗体及第一质控抗体的蛋白浓度适中，便于应用；若蛋白终浓度高于110ug/mL，则检测过程中发出的荧光强度过高，第一检测抗体对应的T线荧光强度及第一质控抗体对应的C线荧光强度升高，T/C比值的精度下降，导致检测灵敏度下降；若蛋白终浓度低于90ug/mL，则第一检测抗体与SAA的结合能力降低，导致SAA的结合不彻底，检测准确度下降。优选地，在本发明的一些实施例中，第一检测抗体及第一质控抗体的蛋白终浓度可以均为100ug/mL。
进一步地，步骤S100包括：
S110、用缓冲液将第二检测抗体及第二质控抗体稀释至浓度为1.8~2.2mg/mL，包被于硝酸纤维素膜上，烘干。
如此设置，用缓冲液稀释后包被于硝酸纤维素膜上，可将第二检测抗体及第二质控抗体固定在硝酸纤维素膜上，以使得“SAA-第一检测抗体-荧光微球”复合物及第一质控抗体能分别与第二检测抗体及第二质控抗体结合，并附着在硝酸纤维素膜上；同时，将第二检测抗体及第二质控抗体稀释至浓度为1.8~2.2mg/mL，使得各抗体之间不相互影响，便于应用；若浓度高于2.2mg/mL，则硝酸纤维素膜上的抗体密度提高，“SAA-第一检测抗体-荧光微球”复合物与第二检测抗体的结合率降低，最大检出限不变，第二检测抗体的应用效率降低，提高了成本而无实际效果；若浓度低于1.8mg/mL，则酸纤维素膜上的抗体密度降低“SAA-第一检测抗体-荧光微球”复合物与第二检测抗体的结合数量减少，导致最大检出限降低。优选地，在本发明的一实施例中，用0.01M磷酸盐缓冲液将第一检测抗体及第一质控抗体分别稀释到2mg/mL，用划膜仪均匀地划在硝酸纤维素膜上，60℃烘干。
此外，步骤S200中将荧光微球标记的结合物垫抗体包被在另一硝酸纤维素膜上的步骤包括：
S250、用蛋白保护液将荧光微球标记的结合物垫抗体稀释90~110倍，包被于硝酸纤维素膜上，烘干。
通过采用蛋白保护液稀释荧光微球标记的结合物垫抗体，避免结合物垫上的抗体在应用过程中暴露在空气中变性失活。优选地，在本发明的一实施例中，用蛋白保护液将荧光微球标记的结合物垫抗体稀释100倍，60℃烘干。
以下结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
提供一种血清淀粉样蛋白A的试剂盒，所述试剂盒应用了一种荧光微球的活化方法，包括以下步骤：
S10、将荧光微球分散于缓冲液中，得荧光微球溶液；
S20、将活化液与所述荧光微球溶液混合，得荧光微球活化液；
其中，所述活化液包括EDC、DIC及NHS。
实施例1还提供一种血清淀粉样蛋白A试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S110、用0.01M磷酸盐缓冲液将SAA第二抗体及鸡IgY分别稀释到2mg/mL，用划膜仪均匀地划在硝酸纤维素膜上，60℃烘干，得到检测垫。
S210、将荧光微球分散于缓冲液中，得荧光微球溶液：
取800uL100mM吗啉乙磺酸溶液（pH值6.0±0.05）及200uL荧光微球于离心管中，混匀，使用超声波细胞粉碎机使得荧光微球均匀分散于溶液，超声波细胞粉碎机10％功率，超3秒停3秒，共1分钟，得荧光微球溶液；
S220、将活化液与荧光微球溶液混合，得荧光微球活化液：
向荧光微球溶液中加入100uL1mg/L NHS溶液混匀，再加入100uL1mg/L EDC溶液、100uL1mg/L DIC溶液混匀，将混合液于常温下置于摇床160r避光振荡30min，再置于离心机(14000r/m,25分钟)中离心，去除上清液，用100mM吗啉乙磺酸溶液（7.5±0.05）复溶，14000r/m离心25分钟后用洗涤液洗涤，得荧光微球活化液；
S230、将SAA第一抗体及羊抗鸡IgY分别与荧光微球活化液混合，得荧光微球偶联液：
将荧光微球活化液超声分散，分别加入SAA第一抗体及羊抗鸡IgY，使得蛋白终浓度为100ug/mL，常温下置于摇床160r避光振荡2.5h，得到荧光微球偶联液；
S240、将封闭液与荧光微球偶联液混合，得荧光微球标记的结合物垫抗体：
将10%牛血清白蛋白溶液加入溶液中封闭。每200uL荧光微球加入100uL10%牛血清白蛋白溶液，常温下置于摇床160r避光振荡1h，置于离心机中离心(14000r/m,25分钟)，去除上清液后用洗涤液复溶，离心(14000r/m,25分钟)洗涤1次，加入洗液体积减半复溶保存（保存体积是目标标记体积的一半），超声分散使荧光微球均匀分散于溶液中，超声分散，做好标识，置于2～8℃保存，得到荧光微球标记的结合物垫抗体；
S250、用蛋白保护液分别将荧光微球标记的SAA第一抗体及荧光微球标记的羊抗鸡IgY稀释100倍后，用喷垫仪均匀喷到另一硝酸纤维素膜上，60℃烘干，得到结合物垫。
S300、将吸水纸、硝酸纤维素膜、结合物垫、样本垫按图4贴在一起后，组成荧光板，然后用切条机将荧光板切成4mm宽的试纸条，试纸条装进塑料卡壳中，即完成了检测卡组装。
需要说明的是，500mL所述洗涤液包括0.0619g硼酸、0.5g聚乙二醇20000及定容至500mL的纯化水；100mL所述蛋白保护液包括0.5g酪蛋白、5g海藻糖及定容至100mL的所述洗涤液。
对比例1
提供一种血清淀粉样蛋白A的试剂盒，所述试剂盒所述试剂盒应用了一种荧光微球的活化方法，包括以下步骤：
S10、将荧光微球分散于缓冲液中，得荧光微球溶液；
S20、将活化液与所述荧光微球溶液混合，得荧光微球活化液；
其中，所述活化液包括EDC及NHS。
指尖血SAA检测实验
选取SAA浓度为1~160mIU/mL的指尖血40组，分别用实施例1及对比例1提供的试剂盒进行检测，记录检测得到的T线信号值及C线信号值，并计算得到T/C比值，实施例1及对比例1对指尖血SAA的检测结果如表1所示。
表1 实施例1及对比例1对指尖血SAA的检测结果
根据表1中SAA浓度及T/C比值绘制折线图，如图3所示，由图3不难发现，对比例1在指尖血SAA的浓度低于40mIU/mL时，T/C比值无明显变化，说明应用对比例1提供的试剂盒时，难以根据T/C比值检测浓度在40mIU/mL以下的指尖血SAA的具体浓度；而实施例1在指尖血SAA的浓度范围为5~40mIU/mL时，T/C比值具有明显的变化，说明应用实施例1所提供的试剂盒可以根据T/C比值测得SAA浓度范围为5~40mIU/mL的具体浓度。从而可以说明应用了本发明的荧光微球活化方法的实施例1所提供的试剂盒，具有更低的最低检出限，进而具有更高的灵敏度。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (9)
1.一种荧光微球的活化方法，其特征在于，包括以下步骤：
S10、将荧光微球分散于缓冲液中，得荧光微球溶液；
S201、将碳二亚铵溶液与二异丙基碳二亚胺溶液混合，得混合液一；
S202、将N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠溶液与荧光微球溶液混合，得混合液二；
S203、将混合液一与混合液二混合，得荧光微球活化液。
2.一种定量检测血清淀粉样蛋白A的试剂盒，用于检测待测血液样本中血清淀粉样蛋白A的含量，其特征在于，包括：
试纸条；
荧光微球标记结合物垫抗体，包被于所述试纸条，用于与血清淀粉样蛋白A结合以形成“结合物垫抗体-血清淀粉样蛋白A”复合体；以及，
检测垫抗体，包被于所述试纸条，用于与“结合物垫抗体-血清淀粉样蛋白A”复合体结合，以形成“结合物垫抗体-血清淀粉样蛋白A-检测垫抗体”复合体；
其中，所述荧光微球标记结合物垫抗体中的荧光微球包括采用如权利要求1所述的荧光微球的活化方法获得的荧光微球。
3.一种定量检测血清淀粉样蛋白A的试剂盒的制备方法，用于制备如权利要求2所述的定量检测血清淀粉样蛋白A的试剂盒，其特征在于，包括以下步骤：
S100、将检测垫抗体包被在硝酸纤维素膜上，得检测垫；
S200、将荧光微球标记在结合物垫抗体上，得荧光微球标记的结合物垫抗体，将荧光微球标记的结合物垫抗体包被在另一硝酸纤维素膜上，得结合物垫；
S300、将样本垫、结合物垫、检测垫及吸水垫依次抵接并贴合在背板上，得试纸条；
其中，所述荧光微球包括采用如权利要求1所述的荧光微球的活化方法所活化的荧光微球；
所述检测垫抗体包括第二检测抗体及第二质控抗体；
所述结合物垫抗体包括第一检测抗体及第一质控抗体。
4.如权利要求3所述的定量检测血清淀粉样蛋白A的试剂盒的制备方法，其特征在于，第一检测抗体包括血清淀粉样蛋白A第一抗体，第二检测抗体包括血清淀粉样蛋白A第二抗体；
第一质控抗体包括羊抗鸡IgY抗体，第二质控抗体包括鸡IgY抗体。
5.如权利要求3所述的定量检测血清淀粉样蛋白A的试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤S200中制备荧光微球标记的结合物垫抗体的步骤包括：
S210、将荧光微球分散于缓冲液中，得荧光微球溶液；
S220、将活化液与荧光微球溶液混合，得荧光微球活化液；
S230、将第一检测抗体及第一质控抗体分别与荧光微球活化液混合，得荧光微球偶联液；
S240、将封闭液与荧光微球偶联液混合，得荧光微球标记的结合物垫抗体；
其中，所述活化液包括碳二亚铵溶液、N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠溶液及二异丙基碳二亚胺溶液。
6.如权利要求5所述的定量检测血清淀粉样蛋白A的试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤S220包括：
S221、将碳二亚铵溶液与二异丙基碳二亚胺溶液混合，得混合液一；
S222、将N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠溶液与荧光微球溶液混合，得混合液二；
S223、将混合液一与混合液二混合，得荧光微球活化液。
7.如权利要求5所述的定量检测血清淀粉样蛋白A的试剂盒的制备方法，其特征在于，荧光微球偶联液中，第一检测抗体及第一质控抗体的蛋白终浓度均为90~110ug/mL。
8.如权利要求3所述的定量检测血清淀粉样蛋白A的试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤S100包括：
S110、用缓冲液将第二检测抗体及第二质控抗体稀释至浓度为1.8~2.2mg/mL，包被于硝酸纤维素膜上，烘干。
9.如权利要求3所述的定量检测血清淀粉样蛋白A的试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤S200中将荧光微球标记的结合物垫抗体包被在另一硝酸纤维素膜上的步骤包括：
S250、用蛋白保护液将荧光微球标记的结合物垫抗体稀释90~110倍，包被于硝酸纤维素膜上，烘干。
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