CN114047339A - 一种检测黏病毒抗性蛋白a的磁微粒发光法检测试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医学免疫诊断领域，具体涉及一种检测黏病毒抗性蛋白A的磁微粒发光法检测试剂盒及其制备方法和应用，包括实验缓冲液、捕获磁微粒溶液、标记了碱性磷酸酶的检测抗体溶液、化学发光底物溶液。本发明与现有技术相比，具有如下优势：采用真核或者原核表达的黏病毒抗性蛋白A（MxA）作为校准品或者质控品，制作标准曲线，配合使用化学发光仪，可定量检测全血、血清、血浆中黏病毒抗性蛋白A（MxA）的含量，自动化程度高，检测准确率和精度高。
Description
技术领域
本发明属于医学免疫诊断领域，具体涉及一种检测黏病毒抗性蛋白A(MxA)的磁微粒发光法检测试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术
黏病毒抗性蛋白A(Myxovirus resistance protein，MxA)是干扰素(IFN)诱导蛋白之一，该蛋白具有抗多种病毒的活性。
MxA是由Ⅰ型干扰素(IFNα/β)诱导人细胞所产生的78kd的抗病毒蛋白，其具有生物活性稳定，抗病毒作用直接、半衰期较长，特异性好，检测方便等优点。人的MxA蛋白分布于细胞的胞浆内，大量研究资料表明，MxA蛋白与病毒的感染密切相关，对病毒反应非常敏感甚至极少的病毒量即可诱导细胞表达MxA蛋白，因此MxA蛋白可用于病毒感染的早期诊断，也可用于临床病毒感染与细菌或者其他微生物感染的鉴别诊断。
目前MxA的临床检测方法有：酶联免疫吸附实验(ELISA)、荧光层析法、胶乳增强免疫比浊法。这些检测方法自动化程度较低，限制了黏病毒抗性蛋白A的检测推广应用。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供自动化程度高、检测准确率高的检测黏病毒抗性蛋白A(MxA)的磁微粒发光法检测试剂盒及其制备方法和应用。
为实现上述发明目的，本发明的第一方面是提供一种检测黏病毒抗性蛋白A的磁微粒发光法检测试剂盒，包括：
实验缓冲液；
捕获磁微粒溶液，由磁微粒偶联链霉亲和素(SA)制成；
标记了生物素(Biotin)的抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)的单克隆抗体，作为捕获抗体；
标记了碱性磷酸酶的抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)的单克隆抗体，作为检测抗体；化学发光底物。
捕获磁微粒溶液、捕获抗体、检测抗体均为浓缩溶液，实验开始前需用实验缓冲液进行稀释。
或者，一种检测黏病毒抗性蛋白A的磁微粒发光法检测试剂盒，包括：
实验缓冲液；
捕获磁微粒溶液，由磁微粒偶联抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)的单克隆抗体制成；
标记了碱性磷酸酶的抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)的单克隆抗体，作为检测抗体；化学发光底物。
优选的，所述的实验缓冲液，为pH7.2-7.4的Tris-HCL缓冲液；实验缓冲液中含0.5-2％W/V牛血清白蛋白、0.05-0.1％W/V非离子型表面活性剂、0.05％W/V的消泡剂和0.3％W/V的防腐剂。
所述的化学发光底物为酶促化学发光底物，可以为金刚烷衍生物，还可以是APS-5(中文名称:(4-氯苯巯基)(10-甲基-9,10-二氢化吖啶亚甲基)磷酸二钠盐)或者AMPPD(中文名称：3-(2’-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3”-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷)。
所述磁微粒为表面覆有亲水性聚合物(羧基或氨基)的磁微粒，粒径为0.5-6.5μm。
所述非离子型表面活性剂为Tween-20和/或曲拉通X-100。
捕获磁微粒溶液、捕获抗体、检测抗体均为浓缩溶液，实验开始前需用实验缓冲液进行稀释。
本发明的第二方面是提供一种检测黏病毒抗性蛋白A的磁微粒发光法检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
制备实验缓冲液：配制pH7.2-7.4的Tris-HCL缓冲液；且使实验缓冲液含0.5-2％W/V牛血清白蛋白、0.05-0.1％W/V非离子型表面活性剂、0.05％W/V的消泡剂和0.3％W/V的防腐剂；
制备捕获磁微粒溶液：由磁微粒偶联链霉亲和素(SA)制成或由磁微粒偶联抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)的单克隆抗体(作为捕获抗体)制成；
制备标记了碱性磷酸酶的抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)的单克隆抗体，作为检测抗体；
选用合适的化学发光底物；
当捕获磁微粒溶液由磁微粒偶联链霉亲和素(SA)制成，再加上制备标记了生物素(Biotin)的抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)的单克隆抗体的步骤。
由磁微粒偶联抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)的单克隆抗体制成捕获磁微粒溶液的具体步骤为：将磁微粒、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)、EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)以一定质量比混合，并加入MES(2-(N-吗啉)乙磺酸)溶液；使磁微粒浓度为1mg/ml，恒温孵育活化，活化温度为37℃，反应时间为30min；将活化后的磁微粒与抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)的单克隆抗体进行偶联，恒温孵育活化，活化温度为37℃，反应时间为2小时；洗涤并保存。
标记了生物素(Biotin)的抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)的单克隆抗体(计算MxA抗体与生物素的质量和)与磁微粒偶联链霉亲和素(SA)制成的捕获磁微粒(计算SA和磁微粒的质量和)的质量比为3:1；
抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)单克隆抗体与碱性磷酸酶的偶联采用戊二醛交联法。
本发明的第三方面是提供检测试剂盒在制备病毒感染诊断试剂中的应用。
本试剂盒检验原理为：
采用双抗体夹心法原理，用磁微粒偶联了链霉亲和素(SA)或者抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)的单克隆抗体制成固相载体，利用化学发光法与化学发光类测定仪器配合，检测人体血清/血浆中的黏病毒抗性蛋白A(MxA)的含量。
磁微粒偶联了链霉亲和素(SA)结合生物素(Biotin)标记的抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)抗体或者磁微粒偶联了抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)的单克隆抗体与待测物结合，再与标记了碱性磷酸酶的抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)的单克隆抗体形成双抗体夹心复合物，在外加磁场的作用下将复合物分离，充分洗涤后加入酶促化学发光底物。底物在酶的作用下被催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时发出光子，形成发光反应，即可使用化学发光检测仪检测反应的发光强度。在测定波长范围内，发光强度与样本的黏病毒抗性蛋白A(MxA)的含量成正比，仪器发光值带入标准曲线即可计算出样本中黏病毒抗性蛋白A(MxA)的含量。
实验缓冲液，为pH7.2-7.4的Tris-HCL缓冲液，其中包含了牛血清白蛋白、非离子型表面活性剂、消泡剂和防腐剂。
捕获磁微粒溶液，其中的磁微粒偶联了链霉亲和素(SA)或者抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)的单克隆抗体(作为捕获抗体)；
标记了生物素(Biotin)的抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)的单克隆抗体为捕获抗体，配合偶联了链霉亲和素(SA)的磁微粒使用。
标记了碱性磷酸酶的抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)的单克隆抗体为检测抗体，配合偶联了抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)的单克隆抗体(作为捕获抗体)的磁微粒使用。
标记了碱性磷酸酶的抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)的单克隆抗体为检测抗体，配合捕获抗体为生物素(Biotin)标记的抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)单克隆抗体和偶联了链霉亲和素(SA)的磁微粒使用。
化学发光底物为酶促化学发光底物，为金刚烷衍生物。
捕获磁微粒溶液、捕获抗体、检测抗体均为浓缩溶液，实验开始前需用实验缓冲液进行稀释。
原核或者真核表达的不同浓度的黏病毒抗性蛋白A(MxA)作为标准品和质控品，其实验溶剂为实验缓冲液。
本发明的试剂盒的使用方法包括如下步骤：
(1)使用实验缓冲液对捕获磁微粒溶液、捕获抗体、检测抗体进行稀释。稀释倍数均为200倍。
(2)取全血、血清或血浆加入反应孔中，再加入捕获磁微粒溶液，如使用的是磁微粒偶联了链霉亲和素(SA)，再加入生物素(Biotin)的抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)的单克隆抗体为捕获抗体。上述溶液温育反应。
(3)用洗涤缓冲液洗涤上述步骤(1)制得的反应液，接着再加入标记了碱性磷酸酶的抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)的单克隆抗体进行反应。
(4)将上述步骤(2)制得的反应液使用洗涤缓冲液洗涤，然后加入化学发光底物，测定发光值，通过对应上述不同浓度的黏病毒抗性蛋白A(MxA)做的标准品曲线，计算出结果。
本发明与现有技术相比，具有如下优势：本发明用抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)单克隆抗体标记磁微粒；链霉亲和素(SA)标记磁微粒；生物素(Biotin)标记抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)单克隆抗体；碱性磷酸酶标记抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)单克隆抗体；采用真核或者原核表达的黏病毒抗性蛋白A(MxA)作为校准品或者质控品，制作标准曲线，配合使用化学发光仪，可定量检测全血、血清、血浆中黏病毒抗性蛋白A(MxA)的含量，自动化程度高，检测准确率和精度高。
附图说明
图1是黏病毒抗性蛋白A(MxA)的磁微粒发光法检测试剂盒的ELISA检测结果。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
一种检测黏病毒抗性蛋白A(MxA)的磁微粒发光法检测试剂盒包括：实验缓冲液、捕获磁微粒溶液(磁微粒偶联抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)的单克隆抗体)、标记了碱性磷酸酶的检测抗体溶液、化学发光底物，其作为试剂盒一。
或者，一种检测黏病毒抗性蛋白A(MxA)的磁微粒发光法检测试剂盒包括：实验缓冲液、捕获磁微粒溶液(磁微粒偶联链霉亲和素SA)、标记了碱性磷酸酶的检测抗体溶液、化学发光底物、标记了生物素(Biotin)的抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)的单克隆抗体，其作为试剂盒二。
其使用方法步骤为：
(1)使用实验缓冲液对捕获磁微粒溶液、捕获抗体、检测抗体进行稀释。稀释倍数均为200倍。
(2)取全血、血清或血浆加入反应孔中，再加入捕获磁微粒溶液，如使用的是磁微粒偶联了链霉亲和素(SA)，再加入生物素(Biotin)的抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)的单克隆抗体作为捕获抗体。温育反应。
(3)用洗涤缓冲液洗涤上述反应液，接着再加入标记了碱性磷酸酶的抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)的单克隆抗体进行反应。
(4)将上述反应液使用洗涤缓冲液洗涤，然后加入化学发光底物，测定发光值，通过对应上述不同浓度的黏病毒抗性蛋白A(MxA)做的标准品曲线，计算出结果。
实验缓冲液中含1％(W/V)牛血清白蛋白、0.1％(W/V)非离子型表面活性剂、0.05％(W/V)的消泡剂和0.3％(W/V)的防腐剂。
捕获磁微粒溶液，其中磁微粒包被有链霉亲和素(购自BEAVER)或者为含有亲水性聚合物(即羧基)的磁微粒(购自BEAVER)。粒径为0.3-6.5μm。其制备方法为：将含有羧基的磁微粒(购自BEAVER)、NHS、EDC混合，并加入pH为6.0的5mM MES溶液。使含有羧基的磁微粒浓度为1mg/ml，放置在水浴恒温摇床上孵育活化，活化温度为37℃，反应时间为30min；将活化后的磁微粒与抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)的单克隆抗体进行偶联，放置在水浴恒温摇床上孵育活化，活化温度为37℃，反应时间为2小时。将反应后的磁微粒用洗涤缓冲液洗涤3次，加入蛋白保存液中保存。蛋白保存液为pH7.2-7.4的Tris-HCL缓冲液，其包含了牛血清白蛋白、蔗糖、非离子型表面活性剂、消泡剂和防腐剂。其中含有羧基的磁微粒、NHS、EDC和抗黏病毒抗性蛋白A抗体质量比为1：1：1：10。含有羧基的磁微粒即偶联有羧基的磁微粒。
抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)的单克隆抗体标记生物素(Biotin)采用生物标记试剂盒，购自Thermofisher(货号：21935)，制备方法见试剂盒说明书。标记好生物素(Biotin)的抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)单克隆抗体(购自biorbyt，货号为：orb167030)与偶联了链霉亲和素(SA)的磁微粒混合的质量比例为3:1。
抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)单克隆抗体(购自SANTA CRUZ，货号为：sc-271399)与碱性磷酸酶的偶联采用戊二醛交联法。戊二醛是一种常用的型双功能交联剂，它的两个醛基可分别与碱性磷酸酶和抗体的氨基偶联，将两个分子以五碳桥连接起来。本说明书中提及的抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)单克隆抗体均购自SANTACRUZ，货号为：sc-271399。
化学发光底物为酶促化学发光底物，为金刚烷衍生物。
实施例1
实验缓冲液制备：为含1％(W/V)牛血清白蛋白、0.1％(W/V)非离子型表面活性剂(吐温20)、0.05％(W/V)的消泡剂(壬基酚聚氧乙烯醚(NP-4))和0.3％(W/V)的防腐剂(Proclin)的Tris-HCL缓冲液；
捕获磁微粒溶液制备：由磁微粒偶联抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)的单克隆抗体制成；磁微粒为含有亲水性聚合物(即羧基)的磁微粒(购自BEAVER)，粒径为3μm。具体制备方法为：将含有羧基的磁微粒(购自BEAVER)、NHS、EDC混合，并加入pH为6.0的5mM MES溶液；使含有羧基的磁微粒浓度为1mg/ml，放置在水浴恒温摇床上孵育活化，活化温度为37℃，反应时间为30min；将活化后的磁微粒与抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)的单克隆抗体进行偶联，放置在水浴恒温摇床上孵育活化，活化温度为37℃，反应时间为2小时；将反应后的磁微粒用洗涤缓冲液(即Triton X-100和Proclin的磷酸盐缓冲液)洗涤3次，再加入蛋白保存液中保存，即得到捕获磁微粒溶液(偶联抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)的单克隆抗体的磁微粒在捕获磁微粒溶液中的浓度为60mg/ml)。蛋白保存液为pH7.2-7.4的Tris-HCL缓冲液，其包含了1％(W/V)牛血清白蛋白、0.3％(W/V)蔗糖、0.1％(W/V)非离子型表面活性剂(吐温20)、0.05％(W/V)消泡剂(壬基酚聚氧乙烯醚(NP-4))和0.3％(W/V)防腐剂(Proclin)。其中在制备过程中，所用的含有羧基的磁微粒、NHS、EDC和抗黏病毒抗性蛋白A抗体质量比为1：1：1：10。
标记了碱性磷酸酶的检测抗体溶液制备：采用现有的戊二醛交联法制备标记了碱性磷酸酶的检测抗体溶液，浓缩至0.2ml以内，制成100mg/ml的标记碱性磷酸酶的检测抗体溶液；100mg/ml指检测抗体的浓度(碱性磷酸酶质量不在其内，只计算抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)的单克隆抗体在溶液中的浓度)；
化学发光底物：AMPPD(购买)；
使用方法：
(1)使用实验缓冲液对捕获磁微粒溶液、检测抗体进行稀释。稀释倍数均为200倍。
(2)取50μl血清加入反应孔中，再加入30μl捕获磁微粒溶液。温育反应(37℃的条件下反应15min)。
(3)用洗涤缓冲液洗涤上述反应液，接着再加入25μl标记了碱性磷酸酶的抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)的单克隆抗体溶液进行反应(37℃的条件下反应15min)。
(4)将上述反应液使用洗涤缓冲液洗涤，然后加入30μl化学发光底物，测定发光值，通过对应上述不同浓度(为200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL、1.5625ng/mL、0.78125ng/mL、0.390625ng/mL)的黏病毒抗性蛋白A(MxA)做的标准品曲线，计算出结果。
本试剂盒中，采用极少量的捕获抗体和检测抗体，即能实现精确检测，显著降低了检测成本。
本试剂盒(实施例1制得)和BioVendor公司生产的Human MxA ELISA分别对60例样本检测结果进行比对，如下表1所示：
表1：本试剂盒和BioVendor公司生产的Human MxA ELISA的检测结果对比
如图1所示，本试剂盒和BioVendor公司生产的Human MxA ELISA分别对60例样本检测结果进行比对，检测结果的相关性为0.9456。
综上描述了本申请发明的基本原理、主要鉴别特征和应用前景。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本申请发明的原理，在不脱离本发明功能、原则和范围的前提下，本发明还会不断改进和完善，这些完善都要求在保护本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (10)
1.一种检测黏病毒抗性蛋白A的磁微粒发光法检测试剂盒，其特征在于，包括：实验缓冲液；
捕获磁微粒溶液，由磁微粒偶联链霉亲和素(SA)制成；
标记了生物素(Biotin)的抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)的单克隆抗体，作为捕获抗体；
标记了碱性磷酸酶的抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)的单克隆抗体，作为检测抗体；化学发光底物。
2.一种检测黏病毒抗性蛋白A的磁微粒发光法检测试剂盒，其特征在于，包括：实验缓冲液；
捕获磁微粒溶液，由磁微粒偶联抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)的单克隆抗体制成；标记了碱性磷酸酶的抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)的单克隆抗体，作为检测抗体；化学发光底物。
3.根据权利要求1或2所述的一种检测黏病毒抗性蛋白A的磁微粒发光法检测试剂盒，其特征在于，所述的实验缓冲液，为pH7.2-7.4的Tris-HCL缓冲液；实验缓冲液中含0.5-2％W/V牛血清白蛋白、0.05-0.1％W/V非离子型表面活性剂、0.05％W/V的消泡剂和0.3％W/V的防腐剂。
4.根据权利要求1或2所述的一种检测黏病毒抗性蛋白A的磁微粒发光法检测试剂盒，其特征在于，所述的化学发光底物为酶促化学发光底物。
5.根据权利要求1或2所述的一种检测黏病毒抗性蛋白A的磁微粒发光法检测试剂盒，所述磁微粒为表面覆有羧基或氨基的磁微粒，粒径为0.5-6.5μm。
6.根据权利要求5所述的一种检测黏病毒抗性蛋白A的磁微粒发光法检测试剂盒，其特征在于，所述非离子型表面活性剂为Tween-20和/或曲拉通X-100。
7.一种检测黏病毒抗性蛋白A的磁微粒发光法检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
制备实验缓冲液：配制pH7.2-7.4的Tris-HCL缓冲液；使实验缓冲液含0.5-2％W/V牛血清白蛋白、0.05-0.1％W/V非离子型表面活性剂、0.05％W/V的消泡剂和0.3％W/V的防腐剂；
制备捕获磁微粒溶液：由磁微粒偶联链霉亲和素(SA)制成或由磁微粒偶联抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)的单克隆抗体制成；
制备标记了碱性磷酸酶的抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)的单克隆抗体，作为检测抗体；
选用化学发光底物；
当捕获磁微粒溶液由磁微粒偶联链霉亲和素(SA)制成，再加上制备标记了生物素(Biotin)的抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)的单克隆抗体的步骤。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，由磁微粒偶联抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)的单克隆抗体制成捕获磁微粒溶液的具体步骤为：将磁微粒、NHS、EDC以一定质量比混合，并加入MES溶液；使磁微粒浓度为1mg/ml，恒温孵育活化，活化温度为37℃，反应时间为30min；将活化后的磁微粒与抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)的单克隆抗体进行偶联，恒温孵育活化，活化温度为37℃，反应时间为2小时；洗涤并保存。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，标记了生物素(Biotin)的抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)的单克隆抗体与磁微粒偶联链霉亲和素(SA)制成的捕获磁微粒的质量比为3:1；
抗黏病毒抗性蛋白A(MxA)单克隆抗体与碱性磷酸酶的偶联采用戊二醛交联法。
10.权利要求1-6任意一项所述的检测试剂盒在制备病毒感染诊断试剂中的应用。
Priority Applications (1)
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| CN202111331200.1A CN114047339A (zh) | 2021-11-11 | 2021-11-11 | 一种检测黏病毒抗性蛋白a的磁微粒发光法检测试剂盒及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN202111331200.1A CN114047339A (zh) | 2021-11-11 | 2021-11-11 | 一种检测黏病毒抗性蛋白a的磁微粒发光法检测试剂盒及其制备方法和应用 |
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| CN202111331200.1A Withdrawn CN114047339A (zh) | 2021-11-11 | 2021-11-11 | 一种检测黏病毒抗性蛋白a的磁微粒发光法检测试剂盒及其制备方法和应用 |
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