CN108508001B - 化学发光检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种化学发光检测试剂盒，所述试剂盒包括试剂1和试剂2，所述试剂1包括缓冲液、磁微粒、生物素标记的待检测抗原的第一抗体和多羟基醇；和所述试剂2包括缓冲液、吖啶酯标记的待检测抗原的第二抗体和多羟基糖。本发明的化学检测试剂盒灵敏度高、准确度好并且能降低检测成本。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断试剂领域，具体涉及一种化学发光检测试剂盒。
背景技术
化学发光检测试剂盒是利用两种检测物(抗体、抗原或其它对特定待测物有亲和作用的分子)来测定样本中的某种物质。其中一种检测物包被在固体表面(以下简称固相)，另一种检测物标记酶或化学发光物质(以下简称标记物)。当前化学发光免疫试剂盒的使用分析方法是以发光剂作为抗体或抗原的标记物，直接通过发光反应检测待测标本中抗原或抗体的含量。试剂盒使用的原理步骤为：①将待测样本加入至反应杯，保温反应一段时间，使其形成磁微粒子抗原抗体复合物②将表面包被了能与被测物质发生特异性反应的抗原或抗体的磁性微粒子加入到反应杯中③将反应杯置于特定的洗涤装置或仪器上进行多次冲洗，彻底洗除游离的未结合物质及干扰物，使反应杯中仅剩下磁微粒子抗原抗体复合物④再将吖啶酯(或其它能发光示踪的物质)标记的特异性抗体或抗原液加入反应杯，保温反应一段时间，使其形成抗原抗体免疫复合物⑤再将反应杯置于特定的洗涤装置或仪器上进行多次冲洗，彻底洗除游离的未结合物质及干扰物，使其反应杯中仅剩下磁微粒子抗原抗体免疫复合物⑥加入稀碱溶液作为激发液，激发吖啶酯(或其他能发光示踪的物质)产生发光反应，根据对发光强度的监测，计算出样本的分析物的浓度。
当前化学发光免疫试剂盒所述的洗涤条件限制所带来的必须为实验配套昂贵设备，以及当前试剂盒实验操作步骤繁琐一些化学发光检测试剂盒灵敏度较低，试剂成本高，目前一般只在三甲医院有开展，在三甲以下医院开展较少，因此有待开发对敏度高、准确度好并且能降低检测成本的化学发光试剂盒。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种化学发光检测试剂盒，所述试剂盒包括试剂1和试剂2，所述试剂1包括缓冲液、磁微粒、生物素标记的待检测抗原的第一抗体和多羟基醇；和所述试剂2包括缓冲液、吖啶酯标记的待检测抗原的第二抗体和多羟基糖。
在一种实施方式中，所述试剂1包括0.2mg/mL～0.6mg/mL磁微粒、4μg/mL～12μg/mL生物素标记的待检测抗原的第一抗体和5g/L～50g/L甘露醇或山梨糖醇；和所述试剂2包括2.0μg/mL～6.0μg/mL吖啶酯标记的待检测抗原的第二抗体和5g/L～50g/L海藻糖或蔗糖。
在一种实施方式中，所述试剂1包括缓冲液、0.2mg/mL～0.6mg/mL磁微粒、4μg/mL～12μg/mL生物素标记的待检测抗原的第一抗体和5g/L～50g/L甘露醇或山梨糖醇；和所述试剂2包括缓冲液、2.0μg/mL～6.0μg/mL吖啶酯标记的待检测抗原的第二抗体和5g/L～50g/L海藻糖或蔗糖。在一些实施方式中，可以是0.3mg/mL～0.5mg/mL磁微粒；可以是6μg/mL～10μg/mL生物素标记的待检测抗原的第一抗体；和10g/L～40g/L甘露醇或山梨糖醇、20g/L～30g/L甘露醇或山梨糖醇。
在一些实施方式中，缓冲液是pH6.0～8.0、5mM～100mM的PBS缓冲液。在一些实施方式中，缓冲液可以是pH7.0～7.5、20mM～80mM的PBS缓冲液、20mM～60mM、20mM～40mM的PBS缓冲液。
在一些实施方式中，所述试剂1还包括1g/L～50g/L牛血清白蛋白、5mL/L～20mL/L丙三醇、0.05mL/L～0.2mL/L TritonX-100、10mg/L～50mg/L 4-氨基安替比林和0.5mL/L～5mL/L proclin-300。在一些实施方式中，可以是5g/L～40g/L牛血清白蛋白、10g/L～30g/L牛血清白蛋白、15g/L～25g/L牛血清白蛋白；10mL/L～15mL/L丙三醇；0.1mL/L～0.2mL/LTritonX-100、0.15mL/L～0.2mL/L TritonX-100；20mg/L～40mg/L 4-氨基安替比林、15mg/L～30mg/L 4-氨基安替比林；和1mL/L～5mL/L proclin-300、2mL/L～4mL/L proclin-300。试剂中各组份是组合起来发挥作用，有效降低了试剂背景信号，提高了试剂的灵敏度、稳定性。
在一些实施方式中，试剂1包括0.4mg/mL磁微粒、8μg/mL生物素标记的待检测抗原的第一抗体、20mM pH7.4PBS缓冲溶液、10g/L牛血清白蛋白、20g/L甘露醇或山梨糖醇、10mL/L丙三醇、0.1mL/L TritonX-100、20mg/L4-氨基安替比林和1mL/L proclin-300。
在一些实施方式中，所述试剂2还包括5g/L～20g/L酪蛋白、5mL/L～20mL/L丙三醇、0.05mL/L～0.2mL/L TritonX-100、0.5mL/L～5mL/L proclin-300和10mg/L～50mg/L4-氨基安替比林。在一些实施方式中，所述试剂2可以包括5g/L～10g/L酪蛋白、10g/L～15g/L酪蛋白、15g/L～20g/L酪蛋白；5mL/L～20mL/L丙三醇、5mL/L～100mL/L丙三醇、10mL/L～20mL/L丙三醇；0.05mL/L～0.2mL/L TritonX-100、0.05mL/L～0.1mL/L TritonX-100、0.1mL/L～0.2mL/L TritonX-100；0.5mL/L～5mL/L proclin-300、0.5mL/L～1mL/Lproclin-300、1mL/L～2mL/L proclin-300、2mL/L～4mL/L proclin-300；和10mg/L～20mg/L 4-氨基安替比林、20mg/L～30mg/L 4-氨基安替比林、30mg/L～40mg/L 4-氨基安替比林、40mg/L～50mg/L 4-氨基安替比林。试剂中各组份是组合起来发挥作用，有效降低了试剂背景信号，提高了试剂的灵敏度、稳定性。
在一些实施方式中，所述试剂2包括4.0μg/mL吖啶酯标记的待检测抗原的第二抗体、20mM pH7.4PBS缓冲溶液、10g/L酪蛋白、10g/L海藻糖或蔗糖、10mL/L丙三醇、0.1mL/LTritonX-100、1mL/L proclin-300和20mg/L4-氨基安替比林。在一些实施方式中，所述试剂盒还包括校准品，所述校准品包括PBS缓冲液、待检测抗原、酪蛋白、牛血清白蛋白、海藻糖或蔗糖、丙三醇、TritonX-100、proclin-300和4-氨基安替比林。
在一些实施方式中，所述校准品包括不同浓度的待检测的抗原、5mM～100mM、pH6.0～8.0PBS缓冲溶液、5g/L～20g/L酪蛋白、20g/L～100g/L牛血清白蛋白、5g/L～50g/L海藻糖或蔗糖、5mL/L～20mL/L丙三醇、0.05mL/L～0.2mL/L TritonX-100、0.5mL/L～5mL/Lproclin-300和10mg/L～50mg/L 4-氨基安替比林。在一些实施方式中，可以是10g/L～20g/L酪蛋白、15g/L～20g/L酪蛋白；30g/L～80g/L牛血清白蛋白、40g/L～60g/L牛血清白蛋白；10g/L～40g/L海藻糖或蔗糖、20g/L～30g/L海藻糖或蔗糖；5mL/L～10mL/L丙三醇、10mL/L～20mL/L丙三醇、15mL/L～20mL/L丙三醇；0.1mL/L～0.2mL/L TritonX-100、0.1mL/L～0.15mL/L TritonX-100；1mL/L～4mL/L proclin-300、2mL/L～4mL/L proclin-300；和10mg/L～40mg/L 4-氨基安替比林、20mg/L～40mg/L 4-氨基安替比林、30mg/L～40mg/L 4-氨基安替比林
在一些实施方式中，所述校准品包括20mM pH7.4PBS缓冲液、10g/L酪蛋白、50g/L牛血清白蛋白、20g/L海藻糖或蔗糖、10mL/L丙三醇、0.1mL/L TritonX-100、1mL/Lproclin-300和20mg/L 4-氨基安替比林。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括化学发光底物液，所述化学发光底物液包括A液和B液；所述A液为H2O2溶液，所述B液为NaOH溶液。
本发明中通过试剂1和试剂2中各个组分的选择，不仅使本发明试剂盒在使用中信号背景大大降低，而且信号强度显著增加；试剂盒的灵敏度、准确性和重复性显著增加。特别是试剂1中甘露醇或山梨糖醇和试剂2中海藻糖或蔗糖的存在，显著增加了本发明试剂盒的灵敏度。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合下面结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。
实施例一:肾素化学发光检测试剂盒的制备及灵敏度实验
一、肾素单克隆抗体包被的亲和素化的磁微粒(试剂1)的制备
1.生物素化的肾素单克隆抗体制备
取1.0mg肾素单克隆抗体，用磷酸盐缓冲液稀释至0.5mg/mL，然后加入13.3μL浓度为2.5mM/L的生物素酯，室温下反应30min，再加入20μL浓度为1M的Tris溶液，室温下反应10min，最后用20mM pH为7.4的磷酸盐缓冲液透析16-24小时，取透析后的液体即得到生物素化的肾素单克隆抗体。
2.生物素化抗体包被亲和素磁微粒
取50mg亲和素化的磁微粒悬浮液，磁分离去上清，用连接缓冲液(20mM PBS，10g/LBSA，20g/L甘露醇，10mL/L丙三醇，0.1mL/L TritonX-100，1mL/L proclin-300，20mg/L 4-氨基安替比林)清洗三次，然后用25mL连接缓冲液重悬，加入1.0mg生物素化的肾素单克隆抗体，室温下混悬30min，磁分离去上清，用连接缓冲液清洗一次后再重悬至25mL，然后加入0.5mL磁微粒封闭液(10μM/mL生物素，封闭液中按体积是50％丙三醇，50％二甲基亚砜)室温下混悬30min，磁分离去上清，用连接缓冲液清洗三次后重悬至125mL，即得到0.4mg/mL肾素单克隆抗体包被的亲和素化的磁微粒。
依此方法也制备了0.2mg/mL和0.6mg/mL肾素单克隆抗体包被的亲和素化的磁微粒。并且制备了包括4μg/mL、8μg/mL和12μg/mL生物素标记的抗肾素单克隆抗体的试剂2。
二、吖啶酯标记的肾素单克隆抗体(试剂2)制备
取1.0mg肾素单克隆抗体，用20mM磷酸盐缓冲液稀释至2.0mg/mL，然后加入20μL浓度为10mM/L的吖啶酯，室温下避光混匀反应30min，然后加入100μL浓度10mg/mL的赖氨酸溶液，室温下避光混匀反应10min，然后用脱盐柱离心脱盐纯化。收集离心管中的液体，即得到吖啶酯标记的肾素单克隆抗体。然后将上述得到的吖啶酯标记的肾素单克隆抗体用标记物稀释液稀释至浓度为4.0μg/mL即得到试剂2，标记物稀释液是20mM pH7.4的PBS溶液，含有10g/L酪蛋白、10g/L海藻糖、10mL/L丙三醇、0.1mL/L TritonX-100、1mL/L proclin-300和20mg/L 4-氨基安替比林。
另外，依此方法制备了包括2.0μg/mL和6.0μg/mL吖啶酯标记的抗肾素单克隆抗体。
三、肾素校准品制备
用校准品稀释液将肾素抗原配制成浓度为10μIU/mL、100μIU/mL，分装为1.0mL/瓶后冻干。肾素校准品可溯源至WHO国际标准(WHO International Standard RENIN,Human，NIBSC code：68/356)。校准品稀释液20mM pH7.4PBS溶液，含有10g/L酪蛋白、50g/L牛血清白蛋白、20g/L海藻糖、10mL/L丙三醇、0.1mL/L TritonX-100、1mL/L proclin-300和20mg/L4-氨基安替比林。
四、肾素测定试剂盒的灵敏度测试实验
试剂灵敏度是根据最低检测限(LOB)来确定的，最低检测限按下述实验方法进行。检测零浓度校准品20次，得到20次测定结果的信号值(RLU)，计算其平均值M和标准差SD，得出M+2SD所对应的RLU值，根据零浓度校准品与相邻浓度校准品(相邻浓度是5μIU/mL)之间的浓度-RLU值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD所对应的RLU值带入上述方程中，计算得出对应的浓度，即最低检测限(LOB)。
以下表1-3中三个批次的实施列，按上述方法检测试剂最低检测限(LOB)均低于0.5μIU/mL，根据此结果确定试剂灵敏度可达到0.5μIU/mL以下。
表1肾素测定试剂盒的灵敏度测定结果1
当将试剂1中甘露醇替换为山梨糖醇，试剂盒中其它成分保持不变时，根据上述相同方法得当的试剂盒灵敏度为0.2597；当将试剂中海藻糖替换为蔗糖，试剂盒中其它成分保持不变时，试剂盒灵敏度为0.2402，如下表所示。
表2肾素测定试剂盒的灵敏度测定结果2
具体实验方案与试剂盒的灵敏度实验方案类似，根据实验结果可以得出在试剂1中加入甘露醇后试剂的灵敏度有明显提高，下表为试剂1不含甘露醇或山梨糖醇时检测LOB为1.0787，而在上述试剂灵敏实施例中LOB均小于0.5μIU/mL。
表3肾素测定试剂盒的试剂1不含甘露醇时灵敏度检测结果
依照上述方法，当试剂盒中其它组分不变时，改变试剂1中甘露醇浓度时，试剂盒灵敏度数据如下：
表4试剂1含不同浓度甘露醇时灵敏度检测结果
实验方案与上述灵敏度检测方案类似，下表为试剂2不含海藻糖或蔗糖时检测LOB为1.5864，而在上述试剂灵敏度实施例中LOB均小于0.5μIU/mL；根据实验结果可以得出在试剂2中加入海藻糖后试剂的灵敏有明显提高。
表5试剂2中不含海藻糖时灵敏度检测结果
依照上述方法，当试剂盒中其它组分不变时，改变试剂2中海藻糖浓度时，试剂盒灵敏度数据如下：
表6试剂2中含不同浓度海藻糖时灵敏度检测结果
由以上结果可见，当海藻糖浓度为5g/L～50g/L时，试剂盒灵敏度较好。
实施例二:甲状腺球蛋白化学发光检测试剂盒的制备及灵敏度实验
一、抗甲状腺球蛋白抗体包被的亲和素化的磁微粒(试剂1)的制备
1.生物素化的抗甲状腺球蛋白抗体制备
取1.0mg抗甲状腺球蛋白抗体，用磷酸盐缓冲液稀释至1.0mg/mL，然后加入3.33μL浓度为10mM/L的生物素酯，室温下反应30min，再加入10μL浓度为1M的Tris溶液，室温下反应10min，最后用20mM、pH为7.4的磷酸盐缓冲液透析16-24小时，取透析后的液体即得到生物素化的抗甲状腺球蛋白抗体。
2.生物素化抗体包被亲和素磁微粒
取100mg亲和素化的磁微粒悬浮液，磁分离去上清，用连接缓冲液(20mM PBS，10g/L BSA，20g/L甘露醇，10mL/L丙三醇，0.1mL/L TritonX-100，3mL/L proclin-300，20mg/L4-氨基安替比林)清洗三次，然后用50mL连接缓冲液重悬，加入1.0mg生物素化的抗甲状腺球蛋白抗体，室温下混悬30min，磁分离去上清，用连接缓冲液清洗一次后再重悬至50mL，然后加入5mL磁微粒封闭液(10μM/mL生物素，封闭液中按体积是50％丙三醇，50％二甲基亚砜)室温下混悬15min，磁分离去上清，用连接缓冲液清洗三次后重悬至250mL，即得到0.4mg/mL抗甲状腺球蛋白抗体包被的亲和素化的磁微粒。
依照此方法也制备了0.2mg/mL和0.6mg/mL抗甲状腺球蛋白抗体包被的亲和素化的磁微粒。同时也制备了4μg/mL、8μg/mL和12μg/mL生物素标记的抗甲状腺球蛋白单克隆抗体。
二、吖啶酯标记的抗甲状腺球蛋白抗体(试剂2)制备
取0.5mg抗甲状腺球蛋白抗体，用20mM磷酸盐缓冲液稀释至1.0mg/mL，然后加入2.5μL浓度为10mM/L的吖啶酯，室温下避光混匀反应30min，然后加入50μL浓度10mg/mL的赖氨酸溶液，室温下避光混匀反应10min，然后用脱盐柱离心脱盐纯化。收集离心管中的液体，即得到吖啶酯标记的抗甲状腺球蛋白抗体。将吖啶酯标记的抗甲状腺球蛋白抗体用标记物缓冲液(20mM PBS，10g/L酪蛋白，10g/L海藻糖，10mL/L丙三醇，0.1mL/L TritonX-100，3mL/L proclin-300，20mg/L 4-氨基安替比林)按1/1000的比例稀释配制成吖啶酯标记物工作液。
依此方法，制备了包括2.0μg/mL、4.0μg/mL和6.0μg/mL吖啶酯标记的抗甲状腺球蛋白单克隆抗体的试剂2。
三、甲状腺球蛋白校准品制备
用校准品稀释液(20mM PBS，10g/L酪蛋白，20g/L海藻糖，10mL/L丙三醇，0.1mL/LTritonX-100，3mL/L proclin-300，20mg/L 4-氨基安替比林)将甲状腺球蛋白抗原配制成浓度为1ng/mL、100ng/mL的校准品1和校准品2。甲状腺球蛋白校准品可溯源至欧洲共同体标准物质局(BCR)的有证参考物质(CRM)457。
四、甲状腺球蛋白测定试剂盒的灵敏度实验
试剂灵敏度是根据最低检测限(LOB)来确定的，最低检测限按下述实验方法进行。检测零浓度校准品20次，得到20次测定结果的信号值(RLU)，计算其平均值M和标准差SD，得出M+2SD所对应的RLU值，根据零浓度校准品与0.2ng/mL相邻浓度校准品之间的浓度-RLU值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD所对应的RLU值带入上述方程中，计算得出对应的浓度，即最低检测限(LOB)。以下表1中是一次实验的具体数据，按上述方法检测试剂最低检测限(LOB)均低于0.1ng/mL，根据此结果确定试剂灵敏度可达到0.020ng/mL。
表7甲状腺球蛋白化学发光检测试剂盒的灵敏度测定结果1
当将试剂1中甘露醇替换为山梨糖醇，试剂盒中其它成分保持不变时，根据上述相同方法得当的试剂盒灵敏度为0.0727ng/mL；当将试剂中海藻糖替换为蔗糖，试剂盒中其它成分保持不变时，试剂盒灵敏度为0.0571ng/mL，如下表所示。
表8甲状腺球蛋白化学发光检测试剂盒的灵敏度测定结果2
1.试剂1中甘露醇对试剂盒灵敏度影响的实验
具体实验方案与试剂盒的灵敏度实验方案类似，根据实验结果可以得出在试剂1中加入甘露醇后试剂的灵敏有明显提高，下表为试剂1不含甘露醇或山梨糖醇时检测LOB为0.3028ng/mL，而在上述试剂灵敏实施例中LOB均小于0.1ng/mL。
表9试剂1不含甘露醇时灵敏度检测结果
依照上述方法，当试剂盒中其它组分不变时，改变试剂1中甘露醇浓度时，试剂盒灵敏度数据如下：
表10试剂1含不同浓度甘露醇时灵敏度检测结果
由以上结果可见，当甘露醇浓度为5g/L～50g/L时，试剂盒灵敏度较好。
2.试剂2中海藻糖对试剂灵敏度影响的实验
用去掉海藻糖的标记物缓冲液(20mM PBS，10g/L酪蛋白，10mL/L丙三醇，0.1mL/LTritonX-100，3mL/L proclin-300，20mg/L 4-氨基安替比林)配制免疫标记物(试剂2)，检测试剂盒灵敏度；没有海藻糖的试剂盒灵敏度降低了。
表11试剂2中不含海藻糖时灵敏度检测结果
依照上述方法，当试剂盒中其它组分不变时，改变试剂2中海藻糖浓度时，试剂盒灵敏度数据如下：
表12试剂2中含不同浓度海藻糖时灵敏度检测结果
由以上结果可见，当海藻糖浓度为5g/L～50g/L时，试剂盒灵敏度较好。
实施例三:乙肝前S1抗原化学发光检测试剂盒的制备及灵敏度实验
一、抗PreS1-Ag单克隆抗体包被的亲和素化的磁微粒(试剂1)的制备
1.生物素化的抗PreS1-Ag单克隆抗体制备
取1.0mg抗PreS1-Ag单克隆抗体，用磷酸盐缓冲液稀释至1.0mg/mL，然后加入13.3μL浓度为10mM/L的生物素酯，室温下反应30min，再加入10μL浓度为1M的Tris溶液，室温下混匀10min终止反应，最后用20mM、pH为7.4的磷酸盐缓冲液透析16-24小时，取透析后的液体即得到生物素化的抗PreS1-Ag单克隆抗体。
2.生物素化抗体包被亲和素磁微粒
取50mg亲和素化的磁微粒悬浮液，磁分离去上清，用连接缓冲液(20mMPBS，10g/LBSA，20g/L甘露醇，10mL/L丙三醇，20mg/L 4-氨基安替比林，0.1mL/L TritonX-100，1mL/Lproclin-300)清洗三次，然后用25mL连接缓冲液重悬，加入0.05mg生物素化的抗PreS1-Ag单克隆抗体，室温下混悬30min，磁分离去上清，用连接缓冲液清洗一次后再重悬至25mL，然后加入25μL磁微粒封闭液(10mmol/L生物素酯)室温下混悬15min，磁分离去上清，用连接缓冲液清洗三次后重悬至125mL，即得到0.4mg/mL抗PreS1-Ag单克隆抗体包被的亲和素化的磁微粒及为试剂1。
依照此类似方法，制备0.2mg/mL和0.6mg/mL抗PreS1-Ag单克隆抗体包被的亲和素化的磁微粒。同时制备了4μg/mL、8μg/mL和12μg/mL生物素标记的抗乙肝前S1抗原单克隆抗体。
二、吖啶酯标记的抗HBsAg多克隆抗体(试剂2)制备
取1.0mg抗HBsAg多克隆抗体，用20mmol/L磷酸盐缓冲液稀释至1.0mg/mL，然后加入100μL浓度为2mmol/L的吖啶酯，室温下避光混匀反应30min，然后加入100μL浓度10mg/mL的赖氨酸溶液，室温下避光混匀反应10min，然后用脱盐柱离心脱盐纯化。收集离心管中的液体，即得到吖啶酯标记的抗HBsAg多克隆抗体加入等体积甘油-20℃以下保存。
取100mL的缓冲液(20mM磷酸盐、9.00g/L氯化钠、10.00g/L酪蛋白、10.00g/L海藻糖、20mg/L 4-氨基安替比林、0.1mL/L Triton X-100、10mL/L丙三醇、1.00mL/L proclin-300)向其中加入10μL上述吖啶酯标记的抗HBsAg多克隆抗体，混匀，即得到试剂2。依此方法制备了含2.0μg/mL、4.0μg/mL和6.0μg/mL吖啶酯标记的抗乙肝前S1抗原多克隆抗体。
三、PreS1-Ag校准品制备
将乙型肝炎病毒前S1抗原用缓冲液(20mM pH7.4PBS，10g/L酪蛋白，20g/L海藻糖，10mL/L丙三醇，0.5mL/L吐温，1mL/L proclin-300)配制成浓度为0μg/mL和10μg/mL，即为校准品1和校准品2。
四、乙型肝炎病毒前S1抗原测定试剂盒的灵敏度测试
1.试剂盒的灵敏度实验
通过四川大家医学检验中心收集到两例小三阳样本记为Sa1、Sa2，分别用达安基因公司的乙型肝炎病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)、科华生物和英科新创公司生产的乙型肝炎病毒前S1抗原检测试剂盒(酶联免疫法)及本发明试剂盒检测结果如下：
表13试剂盒的灵敏度实验结果1
说明：S/CO值≥1即为阳性，S/CO值<1为阴性
经对比该两份低值样本只有本发明试剂盒能检出perS1-Ag为阳性，符合HBV-DNA检测结果。
当将试剂1中甘露醇替换为山梨糖醇，试剂盒中其它成分保持不变时，根据上述相同方法得当的试剂盒也能检测出Sa1和Sa2样本；当将试剂2中海藻糖替换为蔗糖，试剂盒中其它成分保持不变时，试剂盒两份样本同样能检出，如下表所示。
表14本发明试剂盒的灵敏度实验结果2
| 样品 | 甘露醇替换为山梨糖醇 | 海藻糖替换为蔗糖 |
| Sa1 | 1.242 | 1.124 |
| Sa2 | 2.595 | 1.853 |
2.试剂1中甘露醇对试剂盒灵敏度影响的实验
具体实验方案与试剂盒的灵敏度实验方案类似，根据实验结果可以得出在试剂1中加入甘露醇后试剂的灵敏有明显提高，下表为试剂1不含甘露醇或山梨糖醇时检测样本Sa1为阴性。
表15试剂1不含甘露醇时灵敏度检测结果
| 样本 | 试剂1中不含甘露醇时S/CO值 |
| Sa1 | 0.596 |
| Sa2 | 1.132 |
依照上述方法，当试剂盒中其它组分不变时，改变试剂1中甘露醇浓度时，试剂盒灵敏度数据如下：
表16试剂1含不同浓度甘露醇时灵敏度检测结果
由以上结果可见，当甘露醇浓度为5g/L～50g/L时，试剂盒灵敏度较好。
3.试剂2中海藻糖对试剂灵敏度影响的实验
实验方案与上述灵敏度检测方案类似，下表为试剂2不含海藻糖或蔗糖时检测样本Sa1与Sa2均为阴性；根据实验结果可以得出在试剂2中加入海藻糖后试剂的灵敏有明显提高。
表17试剂2中不含海藻糖时灵敏度检测结果
| 样品 | 试剂2中不含海藻糖时S/CO值 |
| Sa1 | 0.472 |
| Sa2 | 0.821 |
表18试剂2中含不同浓度海藻糖灵敏度结果
由以上结果可见，当海藻糖浓度为5g/L～50g/L时，试剂盒灵敏度较好。
实施例四:肾素测定试剂盒不同组分对性能的影响实验
1.试剂1中缓冲液对于试剂盒性能影响的实验
在试剂1中其他组份不变和其它实验条件不变的情况下，分别改变其缓冲液、蛋白、表面活性剂，比较检测校准品结果的信号值和信噪比，筛选出其中信号值和信噪比最优的条件。
表19试剂1不同缓冲液筛选的结果
| 不同缓冲液筛选 | PBS | Tris | MES | HEPES |
| 校准品(μIU/mL) | RLU | RLU | RLU | RLU |
| 0 | 241 | 229 | 253 | 257 |
| 5.0 | 2087 | 1038 | 424 | 1370 |
| 10.0 | 4616 | 2282 | 702 | 2850 |
| 20.0 | 10430 | 6200 | 2153 | 7585 |
| 50.0 | 31840 | 16751 | 6573 | 21975 |
| 125.0 | 93595 | 50300 | 15063 | 61606 |
| 500.0 | 401078 | 211071 | 68088 | 271003 |
从上述实验结果表面，试剂1中选用PBS缓冲液较Tris、MES和HEPES缓冲液，从灵敏度、信号强度和线性关系来说，PBS缓冲液的效果最好；PBS缓冲液的pH值7.4，Tris缓冲液的pH值8.0，MES缓冲液的pH值6.0，HEPES缓冲液的pH值7.0。
表20不同蛋白筛选的结果
从上述实验结果表面，试剂1中选用BSA较Casein，从灵敏度、信号强度和线性关系来说，BSA缓冲液的效果最好；各蛋白使用的浓度是10g/L。
表21不同表面活性剂筛选的结果
| 不同表面活性剂筛选 | TritonX-100 | Tween-20 | Brij35 |
| 校准品(μIU/mL) | RLU | RLU | RLU |
| 0 | 230 | 683 | 996 |
| 5.0 | 2176 | 2122 | 2902 |
| 10.0 | 4398 | 4558 | 3770 |
| 20.0 | 11419 | 9074 | 10710 |
| 50.0 | 33985 | 34404 | 29578 |
| 125.0 | 87199 | 71681 | 84008 |
| 500.0 | 409069 | 356313 | 346335 |
从上述实验结果表面，试剂1中选用从灵敏度、信号强度和线性关系来说，TritonX-100表面活性最优，TritonX-100浓度最优值为0.1mL/L，范围0.05mL/L～0.2mL/L；使用的表面活性剂的浓度是0.1mL/L。
表22不同PBS缓冲液浓度筛选的结果
| PBS缓冲液浓度 | 1mM | 5mM | 20mM | 100mM | 200mM |
| 校准品(μIU/mL) | RLU | RLU | RLU | RLU | RLU |
| 0 | 375 | 221 | 258 | 187 | 237 |
| 5.0 | 550 | 1495 | 1990 | 1233 | 344 |
| 10.0 | 892 | 3114 | 4569 | 2445 | 982 |
| 20.0 | 2519 | 7392 | 11397 | 5184 | 2312 |
| 50.0 | 8453 | 25292 | 28796 | 18347 | 6500 |
| 125.0 | 23277 | 62919 | 100030 | 48338 | 14921 |
| 500.0 | 141979 | 339443 | 427831 | 233750 | 63732 |
从上述实验结果表面，试剂1中选用PBS缓冲液浓度从灵敏度、信号强度和线性关系来说，PBS缓冲液浓度值最优值为20mM，优选范围为5mM～100mM，使用的PBS缓冲液pH值为7.4。
2.试剂1中BSA浓度对于试剂性能的影响实验
在试剂1组份不变，比较试剂1中含不同浓度BSA时检测校准品结果的信号值和信噪比，筛选出其中信号值和信噪比最优的条件。
表23不同BSA浓度筛选的结果
| BSA浓度 | 0.5g/L | 1g/L | 10g/L | 50g/L | 100g/L |
| 校准品(μIU/mL) | RLU | RLU | RLU | RLU | RLU |
| 0 | 1065 | 427 | 231 | 243 | 310 |
| 5.0 | 1886 | 2335 | 1922 | 1342 | 711 |
| 10.0 | 3715 | 4446 | 4557 | 2888 | 1028 |
| 20.0 | 7773 | 10170 | 8897 | 7067 | 1539 |
| 50.0 | 15685 | 31816 | 27094 | 22355 | 5482 |
| 125.0 | 52959 | 74549 | 83290 | 56847 | 21771 |
| 500.0 | 271556 | 421168 | 399411 | 318325 | 134397 |
从上述实验结果表面，试剂1中选用BSA浓度从灵敏度、信号强度和线性关系来说，BSA缓冲液浓度值最优值为10g/L，优选范围为1g/L～50g/L。
3.试剂1中TritonX-100浓度对于试剂性能的影响实验
在试剂1组份不变，比较试剂1中含不同浓度TritonX-100时检测校准品结果的信号值和信噪比，筛选出其中信号值和信噪比最优的条件
表24不同TritonX-100浓度筛选的结果
| TritonX-100浓度 | 0.025mL/L | 0.05mL/L | 0.1mL/L | 0.2mL/L | 0.4mL/L |
| 校准品(μIU/mL) | RLU | RLU | RLU | RLU | RLU |
| 0 | 2124 | 537 | 273 | 247 | 354 |
| 5.0 | 2929 | 2699 | 2157 | 1418 | 754 |
| 10.0 | 4215 | 4715 | 4938 | 2741 | 1270 |
| 20.0 | 8572 | 11133 | 8892 | 6806 | 3241 |
| 50.0 | 20320 | 33446 | 28026 | 22450 | 8437 |
| 125.0 | 59413 | 79868 | 96250 | 56267 | 33162 |
| 500.0 | 344299 | 444621 | 408520 | 307323 | 142572 |
从上述实验结果表面，试剂1中选用TritonX-100浓度从灵敏度、信号强度和线性关系来说，TritonX-100浓度值最优值为0.1mL/L，优选范围为0.05mL/L～0.2mL/L。
同时，本申请发明人在乙型肝炎病毒前S1抗原测定试剂盒、甲状腺球蛋白测定试剂盒等其他类似试剂盒中对于上述组分进行了类似实验，得到了类似的实验结果。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
Claims (6)
1.化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括试剂1和试剂2，所述试剂1包括缓冲液、0.2mg/mL~0.6mg/mL磁微粒、4μg/mL~12μg/mL生物素标记的待检测抗原的第一抗体和5g/L~50g/L甘露醇或山梨糖醇；和所述试剂2包括缓冲液、2.0μg/mL~6.0μg/mL吖啶酯标记的待检测抗原的第二抗体和5g/L~50g/L海藻糖或蔗糖；所述缓冲液是pH6.0~8.0、5mM~100mM的PBS缓冲液；
所述试剂1还包括5g/L～40g/L牛血清白蛋白；10mL/L～15mL/L丙三醇；0 .1mL/L～0.2mL/LTritonX-100；20mg/L～40mg/L 4-氨基安替比林；和1mL/L～5mL/L proclin-300；
所述试剂盒试剂2还包括5g/L~20g/L酪蛋白、5mL/L~20mL/L丙三醇、0.05mL/L~0.2mL/LTritonX-100、0.5mL/L~5mL/L proclin-300和10mg/L~50mg/L 4-氨基安替比林；
所述化学发光检测试剂盒是肾素化学发光检测试剂盒、甲状球蛋白化学发光检测试剂盒或乙肝前S1抗原化学发光检测试剂盒。
2.根据权利要求1所述的化学发光检测试剂盒，所述试剂1包括0.4mg/mL磁微粒、8μg/mL生物素标记的待检测抗原的第一抗体、20mM pH7.4 PBS缓冲溶液、10g/L牛血清白蛋白、20g/L甘露醇或山梨糖醇、10mL/L丙三醇、0.1mL/L TritonX-100、20mg/L 4-氨基安替比林和1mL/L proclin-300。
3.根据权利要求1所述的化学发光检测试剂盒，所述试剂2包括4.0μg/mL吖啶酯标记的待检测抗原的第二抗体、20mM pH7.4 PBS 缓冲溶液、10g/L酪蛋白、10g/L海藻糖或蔗糖、10mL/L丙三醇、0.1mL/L TritonX-100、1mL/L proclin-300和20mg/L 4-氨基安替比林。
4.根据权利要求1-3任一所述的化学发光检测试剂盒，所述试剂盒还包括校准品，所述校准品包括PBS缓冲液、待检测抗原、酪蛋白、牛血清白蛋白、海藻糖或蔗糖、丙三醇、TritonX-100、proclin-300和4-氨基安替比林；所述校准品包括不同浓度的待检测抗原、5mM~100mM、pH6.0~8.0 PBS缓冲溶液、5g/L~20g/L酪蛋白、20g/L~100g/L牛血清白蛋白、5g/L~50g/L海藻糖或蔗糖、5mL/L~20mL/L丙三醇、0.05mL/L~0.2mL/L TritonX-100、0.5mL/L~5mL/L proclin-300和10mg/L~50mg/L 4-氨基安替比林。
5.根据权利要求4所述的化学发光检测试剂盒，所述校准品包括20mM pH7.4 PBS缓冲液、10g/L酪蛋白、50g/L牛血清白蛋白、20g/L海藻糖或蔗糖、10mL/L丙三醇、0.1mL/LTritonX-100、1mL/L proclin-300和20mg/L 4-氨基安替比林。
6.根据权利要求1-3任一所述的化学发光检测试剂盒，所述试剂盒还包括化学发光底物液，所述化学发光底物液包括A液和B液；所述A液为H2O2溶液，所述B液为NaOH溶液。
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| GR01 | Patent grant | ||
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