CN104614537A - 血管紧张素ⅱ检测试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于检测血管紧张素Ⅱ的化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法,所述试剂盒包括组分A和组分B,所述组分A为血管紧张素Ⅱ抗原或血管紧张素Ⅱ抗原与蛋白载体的连接物,组分B为和抗血管紧张素Ⅱ抗体,所述组分A和组分B中的一种标记示踪标记物,另一种包被磁球。本发明进一步涉及一种使用该试剂盒来检测血管紧张素Ⅱ浓度的方法。根据本发明,使用所提供的试剂盒测定血管紧张素Ⅱ的浓度,能够获得高的检测灵敏度和准确性。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测试剂盒,具体涉及一种用于检测血管紧张素Ⅱ的化学发光免疫检测试剂盒。本发明还涉及该试剂盒的制备方法,以及使用该试剂盒来检测血管紧张素Ⅱ浓度的方法。
背景技术
血管紧张素Ⅱ(AⅡ)是经血管紧张素转化酶(Angiotensin0Converting Emzyme,ACE)剪切C-末端两个氨基酸残基形成,是一种8肽物质。
肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)是一个激素系统,当大量失血或血压下降时,肾脏分泌肾素,肾素催化血管紧张素原水解产生血管紧张素Ⅰ(AⅠ),AⅠ基本没有生物学活性。AⅡ具有高效的收缩血管作用,从而使血压升高。AⅡ也能刺激肾上腺皮质分泌醛固酮,醛固酮能促进肾脏对水和钠离子的重吸收,继而增加体液容量,升高血压。
目前,临床上测定AⅡ的方法主要有放射性免疫法、酶联免疫法等。例如,北京北方生物技术研究所生产的碘[125I]血管紧张素Ⅱ放射免疫分析药盒采用竞争法原理测定血浆中的AⅡ含量。加入样本和兔抗-AⅡ抗体(蓝色)及125I-AⅡ标记物(红色)后,125I-AⅡ标记物与样本中的AⅡ竞争结合兔抗-AⅡ抗体,加入驴抗兔免疫分离剂,充分摇匀后,室温放置15min,3000转/分离心15min,去上清,测沉淀管的放射性计数(cpm)。样本中的AⅡ浓度依据由校准品浓度和对应的放射性计数建立的Log-Logit数学模型进行定量,从而检测样本中的AⅡ含量。
然而,放射性免疫法及酶联免疫法存在诸多不足。例如,上述放射性免疫法存在放射性污染、标记物半衰期短、对操作者具有放射性损伤,且操作繁琐,耗时长,灵敏度低,检测范围窄,且不能实现全自动化的缺陷。传统的放射性免疫法或酶联免疫法方法检测时间长,同时主要依靠纯手工加样等系列繁琐操作,效率低,容易导致实验结果误差大;由于酶促反应不够彻底,且易受外部干扰因素影响,如温度、时间及材料浓度影响,因此检测时特异性低,灵敏度差,检测范围窄。因此,本领域亟需一种在灵敏度高的同时提高检测试剂的安全性和稳定性,操作更加简便,还能够借助分析仪器实现检测过程全自动化的检测AⅡ的检测试剂盒。
发明内容
为了解决上述现有技术中存在的问题,本发明的目的是提供一种用于检测AⅡ的化学发光免疫检测试剂盒,以获得高的检测灵敏度和准确性,还能提高检测试剂的稳定性,延长检测试剂的保存时间。
本发明还提供用于检测AⅡ的化学发光免疫检测试剂盒的制备方法。
另外,本发明还提供了根据本发明提供的AⅡ化学发光免疫检测试剂盒的应用,尤其是采用所述试剂盒,通过全自动化学发光法进行AⅡ检测的方法,减少操作时间,降低人为操作误差,同时利用化学示踪标记物的特异性,提高检测灵敏度。
根据本发明,提供了一种用于检测AⅡ的化学发光免疫检测试剂盒,所述试剂盒包括组分A和组分B,所述组分A为AⅡ抗原或AⅡ抗原与蛋白载体的连接物,组分B为抗AⅡ抗体,所述组分A和组分B中的一种标记示踪标记物,另一种包被磁球。
应理解,在本发明提供的上述试剂盒中,所述抗AⅡ抗体可以是一种或多种抗AⅡ单克隆抗体和/或抗AⅡ多克隆抗体。实际上,在本发明中所提及的抗体都可以是单克隆抗体和/或多克隆抗体。
本发明适用的蛋白载体可以选自本领域常用的蛋白载体中的至少一种。例如,所述蛋白载体选自牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、兔血清白蛋白(RSA)、血蓝蛋白(KLH)、牛IgG、人IgG、卵清蛋白(OVA)、肌红蛋白和甲状腺球蛋白中的至少一种。
根据本发明,所述示踪标记物可以选自本领域中常用于标记抗原或抗体的示踪标记物,例如选自金刚烷、鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺及其衍生物、吖啶酯、碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶中的至少一种,优选为N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)。
根据本发明,所述示踪标记物直接标记或者间接标记AⅡ抗原(或其与蛋白载体的连接物)或抗AⅡ抗体。其中,间接标记包括但不限于通过异硫氰酸荧光素(FITC)与抗FITC抗体体系或链霉亲和素(SA)与生物素(Biotin)体系间接标记AⅡ抗原(或其与蛋白载体的连接物)或抗AⅡ抗体。所述“直接标记”是指示踪标记物直接与AⅡ抗原(或AⅡ抗原与蛋白载体连接物)或针对待测抗原的抗体连接进行标记;所述“间接标记”是指通过中间媒介链接体系使得示踪标记物标记AⅡ抗原(或其与蛋白载体的连接物)或抗AⅡ抗体,所述中间媒介链接体系包括但不限于FITC与抗FITC抗体体系或链霉亲和素与生物素体系。本发明人发现,间接标记有利于减弱空间效应,有利于信号的放大,使得检测更加灵敏。
根据本发明,AⅡ抗原(或其与蛋白载体的连接物)或抗AⅡ抗体直接包被磁球,或者通过FITC与抗FITC抗体体系或链霉亲和素与生物素体系间接包被磁球。所述“直接包被”是指利用AⅡ抗原(或其与蛋白载体的连接物)或抗AⅡ抗体直接对磁球进行包被;所述“间接包被”是指通过中间媒介链接体系,使得AⅡ抗原(或其与蛋白载体的连接物)或抗AⅡ抗体对磁球进行包被,所述中间媒介链接体系包括但不限于FITC与抗FITC抗体体系或链霉亲和素与生物素体系。同样,间接包被的优点在于,有利于减弱空间效应,有利于信号的放大,使得检测更加灵敏。
适用于本发明的磁球也称为磁珠,可以是本领域中常用的磁性微球。优选的是,本发明使用的磁球,是将纳米级的Fe2O3或Fe3O4磁性粒子和有机高分子材料进行复合,形成具有超顺磁性和极大量蛋白吸附容量的微米级的固相微球,具有在外加磁场作用下可迅速被磁化,在撤走磁场后剩磁为零的属性。其中,所述有机高分子材料的种类没有特别限制,可根据需要进行选择。
本发明所使用的磁性微球应能满足直径为0.1-5μm,磁性微球还可以通过表面改性而带有多种活性功能基团,包括但不限于-OH、-COOH、-NH2。
在一个具体实施例中,所述磁球为Fe2O3或Fe3O4磁性纳米粒子与有机高分子材料的复合体,并具有0.1-5μm的粒径;并且,所述磁球任选地通过表面改性而带有多种活性功能基团。
根据本发明的一些实施方案,所述试剂盒包括选自组分A1和组分A2中的任意一种的组分,以及选自组分B1、组分B2和组分B3中的任意一种的组分;其中,组分A1为ABEI直接标记的AⅡ抗原(或其与蛋白载体的连接物);组分A2为链霉亲和素标记的ABEI和生物素化的AⅡ抗原(或其与蛋白载体的连接物);组分B1为抗AⅡ抗体直接包被的磁球;组分B2为生物素化的抗AⅡ抗体和链霉亲和素包被的磁球;以及组分B3为抗AⅡ抗体标记的FITC和抗FITC抗体包被的磁球。
根据本发明的另一些实施方案,所述试剂盒包括选自组分C1和组分C2中的任意一种的组分,以及选自组分D1、组分D2和组分D3中的任意一种的组分;其中,组分C1为ABEI直接标记的抗AⅡ抗体;组分C2为链霉亲和素标记的ABEI和生物素化的抗AⅡ抗体;组分D1为AⅡ抗原(或其与蛋白载体的连接物)直接包被的磁球;组分D2为生物素化的AⅡ抗原(或其与蛋白载体的连接物)和链霉亲和素包被的磁球;以及组分D3为AⅡ抗原(或其与蛋白载体的连接物)标记的FITC和抗FITC抗体包被的磁球。
根据本发明,所述试剂盒还可以包括AⅡ抗原的低点校准品和高点校准品,并任选地包括缓冲液。本发明所述低点校准品与高点校准品是两者相对而言,其中“低点校准品”,是指将AⅡ抗原用50%牛血清制品稀释成浓度为10-60pg/ml得到的校准品;而“高点校准品”是指将AⅡ抗原用50%牛血清制品稀释成浓度为400-800pg/ml得到的校准品。
根据本发明提供的试剂盒,所包含的各成分浓度优选如下:AII抗原或血管紧张素Ⅱ抗原与蛋白载体的连接物为0.002-0.01mg/ml;抗AII抗体为0.05-1mg/ml;磁球为0.05-1mg/ml;FITC为0.002-0.01mg/ml;抗FITC抗体为0.05-1mg/ml;链霉亲和素为0.05-1mg/ml;生物素为0.002-0.01mg/ml;示踪标记物为0.2-1mg/l;以及如果使用了蛋白载体,其浓度为2-10mg/l。上述各成分的浓度均基于包含该成分的单独的试剂盒组分的量计。
在本发明的一种实施方案中,在本发明的试剂盒中,在AⅡ抗原(或其与蛋白载体的连接物)上标记ABEI,并用抗AⅡ抗体包被磁球。
例如,在本发明的一个具体的实施例中,所述试剂盒包括AⅡ抗原(或其与蛋白载体的连接物)标记的ABEI、抗AⅡ抗体包被的磁球、低点校准品和高点校准品。
例如,在本发明的一个具体的实施例中,所述试剂盒包括AⅡ抗原(或其与蛋白载体的连接物)标记的ABEI、生物素化的抗AⅡ抗体、链霉亲和素包被的磁球、低点校准品和高点校准品。
例如,在本发明的一个具体的实施例中,所述试剂盒包括AⅡ抗原(或其与蛋白载体的连接物)标记的ABEI、抗AⅡ抗体标记的FITC、抗FITC多克隆抗体包被的磁球、低点校准品和高点校准品。
例如,在本发明的一个具体的实施例中,所述试剂盒包括生物素化的AⅡ抗原(或其与蛋白载体的连接物)、链霉亲和素标记的ABEI、抗AⅡ抗体包被的磁球、低点校准品和高点校准品。
在本发明的另一种实施方案中,在本发明的试剂盒中,在抗AⅡ抗体上标记ABEI,并用AⅡ抗原(或其与蛋白载体的连接物)包被磁球。
例如,在本发明的一个具体的实施例中,所述试剂盒包括抗AⅡ抗体标记的ABEI、AⅡ抗原(或其与蛋白载体的连接物)包被的磁球、低点校准品和高点校准品。
例如,在本发明的一个具体的实施例中,所述试剂盒包括抗AⅡ抗体标记的ABEI、AⅡ抗原(或其与蛋白载体的连接物)标记的FITC、抗FITC多克隆抗体包被的磁球、低点校准品和高点校准品。
例如,在本发明的一个具体的实施例中,所述试剂盒包括生物素化的抗AⅡ抗体、链霉亲和素标记的ABEI、AⅡ抗原(或其与蛋白载体的连接物)包被的磁球、低点校准品和高点校准品。
例如,在本发明的一个具体的实施例中,所述试剂盒包括抗AⅡ抗体标记的ABEI、生物素化的AⅡ抗原(或其与蛋白载体的连接物)、链霉亲和素包被的磁球、低点校准品和高点校准品。
本发明还提供了一种用于制备如上所述的试剂盒的方法,包括:将组分A(AⅡ抗原或其与蛋白载体的连接物)和组分B(抗AⅡ抗体)中的一种直接或间接标记示踪标记物,将另一种直接或间接包被磁球。
根据本发明提供的方法,所述间接标记包括将示踪标记物通过异硫氰酸荧光素与抗异硫氰酸荧光素抗体体系或链霉亲和素与生物素体系标记所述AⅡ抗原(或其与蛋白载体的连接物)或抗AⅡ抗体。
根据本发明提供的方法,所述间接包被包括将所述AⅡ抗原(或其与蛋白载体的连接物)或抗AⅡ抗体通过异硫氰酸荧光素与抗异硫氰酸荧光素抗体体系或链霉亲和素与生物素体系间接包被磁球。
在一些具体实施方案中,用于制备所述试剂盒的方法包括以下步骤:i)AⅡ抗原标记步骤,利用示踪标记物直接或间接地标记AⅡ抗原(或其与蛋白载体的连接物);和ii)抗AⅡ抗体包被磁球步骤,将抗AⅡ抗体直接或间接地包被磁球。
在另一些具体实施方案中,用于制备所述试剂盒的方法包括以下步骤:i’)抗AⅡ抗体标记步骤,利用示踪标记物直接或间接地标记抗AⅡ抗体;和ii’)AⅡ抗原(或其与蛋白载体的连接物)包被磁球步骤,将AⅡ抗原(或其与蛋白载体的连接物)直接或间接地包被磁球。
在一些实施方案,在步骤i)中,将示踪标记物通过FITC与抗FITC抗体体系或链霉亲和素与生物素体系间接标记AⅡ抗原(或其与蛋白载体的连接物);和/或在步骤ii)中,将抗AⅡ抗体通过FITC与抗FITC抗体体系或链霉亲和素与生物素体系间接包被磁球。
在一些实施方案,在步骤i’)中,将示踪标记物通过FITC与抗FITC抗体体系或链霉亲和素与生物素体系间接标记抗AⅡ抗体;和/或在步骤ii’)中,将AⅡ抗原(或其与蛋白载体的连接物)通过FITC与抗FITC抗体体系或链霉亲和素与生物素体系间接包被磁球。
根据本发明的试剂盒制备方法还可以包括低点校准品和高点校准品的配制,还可以进一步包括试剂盒的组装。
根据本发明,还提供了一种检测AⅡ浓度的方法,所述方法包括使用如上所述的试剂盒通过化学发光免疫法对待测样品中的AⅡ浓度进行检测。
在一个实施方案中,所述检测AⅡ浓度的方法包括使用如上所述的试剂盒,通过化学发光免疫分析仪检测AⅡ浓度。在本发明的一个优选的实施方案中,所述方法全自动地进行。根据本发明,所述化学发光免疫分析仪优选为Maglumi系列化学发光免疫分析仪(深圳新产业生物医学工程股份有限公司生产)。
具体地,针对AⅡ抗原(或其与蛋白载体的连接物)上标记示踪标记物,利用抗AⅡ抗体包被磁球的情况,进行化学发光检测的检测步骤可以包括:1)获取待测样本。待测样本可为直接得到的血清、血浆及全血,也可以是通过抽取人体血样进行分离得到,或经过酶抑制剂处理后的样本;2)利用标记有示踪标记物的AⅡ抗原(或其与蛋白载体的连接物)和包被有抗AⅡ抗体的磁球与待测样本混合后进行温育,得到反应产物;3)清洗后上机检测化学发光信号,得到相应的光信号数据;4)分析相应光信号数据,得到AⅡ抗原含量。
针对抗AⅡ抗体上标记示踪标记物,利用AⅡ抗原(或其与蛋白载体的连接物)包被磁球的情况,进行化学发光检测的检测步骤可以包括:1)获取待测样本。待测样本可为直接得到的血清、血浆及全血,也可以是通过抽取人体血样进行分离得到,或经过酶抑制剂处理后的样本;2)将标记有示踪标记物的抗AⅡ抗体和包被有AⅡ抗原(或其与蛋白载体的连接物)的磁球与待测样本混合后进行温育,得到反应产物;3)清洗后上机检测化学发光信号,得到相应的光信号数据;4)分析相应光信号数据,得到AⅡ含量。
本发明的有益效果在于:
1.特异性高,灵敏度好,检测范围较宽。
2.操作更加简便易行,同时本发明的试剂盒能够与化学发光免疫分析仪(尤其是Maglumi系列化学发光免疫分析仪)配套使用,在样本测定过程中实现了全自动化,使得AⅡ浓度的检测可以简单、方便、快速、批量地进行,同时保证检测的系统误差较小。
3.本发明通过化学发光免疫法来检测AⅡ,避免使用污染环境、危害人体健康的放射性标记物,更加安全,对环境友好;同时,本发明的标记物不仅安全,还很稳定,克服了放射性免疫法等现有技术方法中存在的标记物的半衰期短的问题。
具体实施方式
以下结合非限制性实施例来对本发明作进一步的解释和说明。然而,需要注意的是,本发明的下列具体实施方式并不对本发明作出任何的限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
以下实施例中:
AⅡ抗原:购自Sigma公司;
抗AⅡ抗体:购自Biogenesis公司;
羊抗FITC多克隆抗体:购自美国Jackson公司;
FITC:购自上海纪宁实业有限公司;
生物素、链霉亲和素:均购自美国Biosources公司;
ABEI:由深圳市新产业生物医学工程股份有限公司生产;
磁性微球由深圳市新产业生物医学工程股份有限公司生产,80%粒径分布为1-5μm,磁化强度为4000高斯时沉淀时间为10-15秒,BSA为30mg时蛋白吸附浓度为0.8mg-1.2mg;
Maglumi 2000化学发光分析仪由深圳市新产业生物医学工程股份有限公司提供。
实施例1
(1)AⅡ抗原的标记,具体步骤如下:
透析液(F溶液)的配制:在5000ml容器中加入Na2CO314.31g和NaHCO326.46g,加纯化水稀释至4500ml,将配制好的F溶液置于磁力搅拌器上备用。
选用合适截留量(常用分子量14000)的透析袋,量取足够容纳F溶液的尺寸,润湿后扎紧一端,纯化水试漏3次(需无漏液)。
取100μg AⅡ抗原用0.1mol/L pH9.5的碳酸缓冲液(F溶液)调整到1ml。放入透析液中,室温搅拌透析2小时,将透析好的溶液加入300μg ABEI活化酯,37℃反应2小时。
通过G-25凝胶柱纯化AⅡ抗原与ABEI的连接产物。
D2溶液的配制:在2000ml烧杯中加入200ml的0.5M磷酸盐缓冲液(P001溶液)、20g BSA、8g NaN3、2g MgCl2·6H2O、600ml甘油,加纯化水稀释到2000ml,过滤。
将纯化好的连接产物用D2溶液对倍稀释,即得到标记有ABEI的AⅡ抗原。
(2)抗AⅡ抗体包被磁球,具体步骤如下:
A溶液的配制:称取2.55g三水合乙酸钠放入5000ml烧杯中,用量筒量取4500ml纯化水倒入烧杯,待溶解后再加入14ml乙酸混匀后,加纯化水稀释至5000ml(pH为3.6)。
向小白瓶中加入5倍于包被体积的A溶液,放入超声波仪器中一边超声一边搅拌清洗2-3分钟,然后置于磁铁上,待上清液清亮后,倒出上清液。该步骤重复三次。
将粒径为1μm磁球加入与包被体积等量的pH3.6醋酸缓冲液中,使磁球的悬浮浓度为20mg/ml,再加入CMC(浓度为10mg/ml),加入纯化的抗AⅡ抗体
将磁球悬浮液放入恒温震荡水浴箱中37℃反应24小时(震荡水浴锅振摇速度:260rpm)。
以P001:纯化水=1:9体积比率配制pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)500ml加入2.5g BSA混匀混匀溶解,即为磁球清洗液。
将温浴好的磁球悬浮液倒入烧杯中,然后置于磁铁上沉淀后,倒掉上清,加入5倍体积的磁球清洗液搅拌清洗,然后放置在磁铁上,待上清液清亮后倒掉上清液,重复该清洗步骤四次。
C溶液配制:称取MC(甲基纤维素)160g倒入5000ml烧杯中,加纯化水至4000ml,至于90℃的水浴箱中加热搅溶2小时。另取4000ml0.5M磷酸盐缓冲液,加入80gNaN3(分析纯),80ml吐温-20(分析纯),混匀,过滤。将此两份溶液充分混匀后加入200g BSA,加水至40000ml。
将清洗完毕后的磁球悬浮于C溶液中,悬浮浓度为20mg/ml,即得到抗AⅡ抗体包被的磁球,此悬浮液体积即为本步骤所述包被体积。
将上述磁球悬浮液进一步稀释至以磁球计为0.1mg/ml的悬浮液,备用。
(3)AⅡ低点校准品、高点校准品的制备
将AⅡ抗原用50%牛血清制品按不同比例稀释成浓度分别为613.238pg/ml及32.614pg/ml的两个高、低校准品定标点。
(4)组装
将上述试剂成分分装后组装成试剂盒,储存于2~8℃。
实施例2
(1)AⅡ抗原的标记,具体步骤如下:
透析液(F溶液)的配制:在5000ml容器中加入Na2CO314.31g,NaHCO326.46g,加纯化水稀释至4500ml。配制好的F溶液置于磁力搅拌器上备用。
选用合适截留量(常用分子量14000)的透析袋,量取足够容纳F溶液的尺寸,润湿后扎紧一端,纯化水试漏3次(需无漏液)。
取100μg AⅡ抗原用0.1mol/L pH9.5的碳酸缓冲液(F溶液)调整到1ml。放入透析液中,室温搅拌透析2小时,将透析好的溶液加入300μg ABEI活化酯,37℃反应2小时。
通过G-25凝胶柱纯化AⅡ抗原与ABEI的连接产物。
D2溶液的配制:在2000ml烧杯中加入200ml 0.5M磷酸盐缓冲液、20g BSA、8g NaN3、2g MgCl2·6H2O、600ml甘油,加纯化水稀释至2000ml,过滤。
纯化好的连接产物体用D2溶液对倍稀释。
(2)羊抗FITC多克隆抗体包被磁球,具体步骤如下:
按实施例1中方法配制好A溶液。
向小白瓶中加入5倍于包被体积的A溶液,放入超声波仪器中一边超声一边搅拌清洗2-3分钟,然后置于磁铁上,待上清液清亮后,倒出上清液。该步骤重复三次。
将磁球加入包被体积等量的pH3.6醋酸缓冲液中,使磁球的悬浮浓度为20mg/ml,再加入CMC(浓度为10mg/ml),加入纯化的羊抗FITC多克隆抗体。
将磁球悬浮液放入恒温震荡水浴箱中37℃反应24小时(震荡水浴锅振摇速度:260rpm)。
以P001:纯化水=1:9体积比率配制pH7.4的PBS缓冲液500ml,加入2.5g BSA混匀溶解,即为磁球清洗液。
将温浴好的磁球悬浮液倒入烧杯中,然后置于磁铁上沉淀后,倒掉上清,加入5倍体积的磁球清洗液搅拌清洗,然后放置在磁铁上,待上清液清亮后倒掉上清液,重复该清洗步骤四次。
按照实施例1的方法制备C溶液。
将清洗完毕后的磁球悬浮在C溶液中,悬浮液浓度为20mg/ml,即得到羊抗FITC多克隆抗体包被的磁球,此悬浮液体积即为本步骤所述包被体积。
将上述磁球悬浮液进一步稀释至以磁球计为0.5mg/ml的悬浮液,备用。
(3)抗AⅡ抗体标记,具体步骤如下:
取1mg抗AⅡ抗体用0.1mol/L pH9.5的碳酸缓冲液(F溶液)调整到1ml。放入透析液中,室温搅拌透析2小时,将透析好的溶液加入300μg FITC,室温边摇边反应24h。
通过G-25凝胶柱纯化抗AⅡ抗体与FITC的连接产物。
C2溶液的配制:加入200ml 0.5M磷酸盐缓冲液、20g BSA、8g NaN38g、2g0MgCl2·6H2O、加纯化水稀释至2000ml(过滤)。配制好C2溶液,以纯化好的连接产物体用C2溶液对倍稀释。
(4)AⅡ低点校准品、高点校准品的制备
将AⅡ抗原用50%牛血清制品按不同比例稀释成浓度为591.578pg/ml及42.260pg/ml两个高、低校准品定标点。
(5)组装
将上述试剂成分分装后组装成试剂盒,储存于2~8℃。
实施例3
(1)抗AⅡ抗体的标记,具体步骤如下:
透析液(F溶液)的配制:在5000ml烧杯中加入Na2CO314.31g,NaHCO326.46g,加纯化水稀释至至4500ml,将配制好的F溶液置于磁力搅拌器上备用。
选用合适截留量(常用分子量14000)的透析袋,量取足以容纳F溶液的尺寸,润湿后扎紧一端,纯化水试漏3次(需无漏液)。
取1mg抗AⅡ抗体用0.1mol/L0pH9.5的碳酸缓冲液(F溶液)调整到1ml。放入透析液中,室温搅拌透析2小时,将透析好的溶液加入300μg ABEI活化酯,37℃反应2小时。
通过G-25凝胶柱纯化抗AⅡ抗体与ABEI的连接产物。
按实施例1中方法配制好D2溶液。
将纯化好的连接产物用D2溶液对倍稀释。
(2)AⅡ抗原包被磁球,具体步骤如下:
按实施例1中的方法配制好A溶液。
向小白瓶中加入5倍于包被体积的A溶液,放入超声波仪器中一边超声一边搅拌清洗2-3分钟,然后置于磁铁上,待上清液清亮后,倒出上清液。该步骤重复三次。
将磁球加入包被体积等量的pH3.6醋酸缓冲液中,使磁球的悬浮浓度为20mg/ml,再加入1-环已基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸盐(CMC),使其浓度为10mg/ml,按一定比率加入纯化的AⅡ抗原
将磁球放入恒温震荡水浴箱中37℃反应24小时(震荡水浴锅振摇速度:260rpm)。
以P001:纯化水=1:9体积比率配制pH7.4PBS缓冲液500ml,加入2.5g BSA混匀混匀溶解,即为磁球清洗液。
将温浴好的磁球悬浮液倒入烧杯中,然后置于磁铁上沉淀后,倒掉上清,加入5倍体积的磁球清洗液搅拌清洗,然后放置在磁铁上,待上清液清亮后倒掉上清液,重复该清洗步骤四次。
按照实施例1的方法制备C溶液。将清洗完毕后的磁球悬浮于C溶液中,悬浮浓度为20mg/ml,即得到抗AⅡ抗体包被的磁球,此悬浮液体积即为本步骤所述包被体积。
将上述磁球悬浮液进一步稀释至以磁球计为1mg/ml的悬浮液,备用。
(3)AⅡ低点校准品、高点校准品
将AⅡ抗原用50%牛血清制品按不同比例稀释成浓度分别为562.34pg/ml及17.78pg/ml的两个高、低校准品定标点。
(4)组装
将上述试剂成分分装后组装成试剂盒,储存于2~8℃。
实施例4
(1)抗AⅡ抗体的标记,具体步骤如下:
透析液(F溶液)的配制:在5000ml烧杯中加入Na2CO314.31g,NaHCO326.46g,加水定容至4500ml.配制好的F溶液置于磁力搅拌器上备用。
选用合适截留量(常用分子量14000)的透析袋,量取足够容纳F溶液的尺寸,润湿后扎紧一端,纯化水试漏3次(需无漏液)。
取1mg抗AⅡ抗体用0.1mol/L pH9.5的碳酸缓冲液(F溶液)调整到1ml。放入透析液中,室温搅拌透析2小时,将透析好的溶液加入300μg ABEI活化酯,37℃反应2小时。
通过G-25凝胶柱纯化抗AⅡ抗体与ABEI的连接产物。
按照实施例1的方法制备D2溶液。
将纯化好的连接产物用D2溶液对倍稀释。
(2)羊抗FITC多克隆抗体包被磁球,具体步骤如下:
按实施例1中方法配制好A溶液。
向小白瓶中加入5倍于包被体积的A溶液,放入超声波仪器中一边超声一边搅拌清洗2-3分钟,然后置于磁铁上,待上清液清亮后,倒出上清液。该步骤重复三次。
将磁球加入包被体积等量的pH3.6醋酸缓冲液中,使磁球悬浮浓度为20mg/ml,再加入CMC(使其浓度为10mg/ml),按一定比率加入纯化的羊抗FITC多克隆抗体。
将磁球放入恒温震荡水浴箱中37℃反应24小时(震荡水浴锅振摇速度:260rpm)。
以P001:纯化水=1:9体积比率配制pH7.4PBS缓冲液500ml,加入2.5g BSA混匀溶解,即为磁球清洗液。
将温浴好的磁球悬浮液倒入烧杯中,然后置于磁铁上沉淀后,倒掉上清,加入5倍体积的磁球清洗液搅拌清洗,然后放置在磁铁上,待上清液清亮后倒掉上清液,重复该清洗步骤四次。
按照实施例1的方法制备C溶液。
将清洗完毕后的羊抗FITC多克隆抗体包被的磁球悬浮在C溶液中,悬浮浓度为20mg/ml,即得到羊抗FITC多克隆抗体包被的磁球,此悬浮液体积即为本步骤所述包被体积。
将上述磁球悬浮液进一步稀释至以磁球计为0.05mg/ml的悬浮液,备用。
(3)AⅡ抗原标记,具体步骤如下:
透析液(F溶液)的配制,在5000ml烧杯中加入Na2CO314.31g,NaHCO326.46g,加水定容至4500ml,配制好的F溶液置于磁力搅拌器上备用。
选用合适截留量(常用14000)的透析袋,量取合适的尺寸,润湿后扎紧一端,纯化水试漏3次(需无漏液)。
取100μg AⅡ抗原用0.1mol/L pH9.5的碳酸缓冲液(F溶液)调整到1ml。放入透析液中,室温搅拌透析2小时,将透析好的溶液加入300μg FITC,室温边摇边反应24h。
通过G-25凝胶柱纯化AⅡ抗原和FITC的连接产物。
C2溶液的配制:加入200ml POO1溶液、20g BSA、8g NaN3、2g MgCl2·6H2O、定容到2000ml(过滤)。
纯化好的连接产物体用C2溶液对倍稀释,即可。
(4)AⅡ低点校准品、高点校准品的制备
将AⅡ抗原用50%牛血清制品按不同比例稀释成浓度分别为645.12pg/ml及46.50pg/ml两个高、低校准品定标点。
(5)组装
将上述试剂成分分装后组装成试剂盒,储存于2~8℃。
实施例5
(1)抗AⅡ抗体的标记,具体步骤如下:
取1mg抗AⅡ抗体用0.1mol/L pH9.5的碳酸缓冲液(F溶液)调整到1ml。放入透析液中,室温搅拌透析2小时,将透析好的溶液加入300μg ABEI活化酯,37℃反应2小时。
通过G-25凝胶柱纯化抗AⅡ抗体和ABEI的连接产物。
按照实施例1的方法配制D2溶液,纯化好的连接产物用D2溶液对倍稀释。
(2)AⅡ抗原生物素化
取100μg Biotin及100μg AⅡ抗原用0.1mol/L pH9.5的碳酸缓冲液(F溶液)调整到1ml。放入透析液中,室温搅拌透析2小时,37℃反应2小时。
通过G-25凝胶柱纯化。
将纯化好的连接产物用D2溶液对倍稀释。
(3)SA包被磁球,具体步骤如下:
按照实施例1的方法配制A溶液。
向小白瓶中加入5倍于包被体积的A溶液,放入超声波仪器中一边超声一边搅拌清洗2-3分钟,然后置于磁铁上,待上清液清亮后,倒出上清液。该步骤重复三次。
将磁球加入与包被体积等量的pH3.6醋酸缓冲液中,使磁球的悬浮浓度为20mg/ml,再加入CMC(浓度为10mg/ml),加入纯化的SA。
将磁球悬浮液放入恒温震荡水浴箱中37℃反应24小时(震荡水浴锅振摇速度:260rpm)。
以P001:纯化水=1:9体积比率配制pH7.4的PBS缓冲液500ml,加入2.5g BSA混匀溶解,即为磁球清洗液。
将温浴好的磁球悬浮液倒入烧杯中,然后置于磁铁上沉淀后,倒掉上清,加入5倍体积的磁球清洗液搅拌清洗,然后放置在磁铁上,待上清液清亮后倒掉上清液,重复该清洗步骤四次。
按照实施例1的方法制备C溶液。
将清洗完毕后的SA包被的磁球悬浮在C溶液中,悬浮浓度为20mg/ml,即得到SA包被的磁球,此悬浮液体积即为本步骤所述包被体积。
将上述磁球悬浮液进一步稀释至以磁球计为0.5mg/ml的悬浮液,备用。
(4)AⅡ低点校准品、高点校准品的制备
将AⅡ抗原用50%牛血清制品按不同比例稀释成浓度为563.245pg/ml及15.337pg/ml两个高、低校准品定标点。
(5)组装
将上述试剂成分分装后组装成试剂盒,储存于2~8℃。
实施例6
(1)抗AⅡ抗体生物素化,具体步骤如下:
取100μg Biotin及1mg抗AⅡ抗体用0.1mol/L pH9.5的碳酸缓冲液(F溶液)调整到1ml。放入透析液中,室温搅拌透析2小时,37℃反应2小时。
通过G-25凝胶柱纯化。
配制D2溶液,纯化好的连接产物用D2溶液对倍稀释。
(2)SA的标记
取100μg SA用0.1mol/L pH9.5的碳酸缓冲液(F溶液)调整到1ml。放入透析液中,室温搅拌透析2小时,将透析好的溶液加入300μg ABEI活化酯,37℃反应2小时。
G-25凝胶柱纯化。
纯化好的连接产物用D2溶液对倍稀释,即可。
(3)AⅡ抗原包被磁球,具体步骤如下:
按照实施例1的方法配制好A溶液。
向小白瓶中加入5倍于包被体积的A溶液,放入超声波仪器中一边超声一边搅拌清洗2-3分钟,然后置于磁铁上,待上清液清亮后,倒出上清液。该步骤重复三次。
将磁球加入包被体积等量的pH3.6醋酸缓冲液,使磁球的悬浮浓度为20mg/ml,再加入CMC(浓度为10mg/ml),加入纯化的AⅡ抗原。
将磁球悬浮液放入恒温震荡水浴箱中37℃反应24小时(震荡水浴锅振摇速度:260rpm)。
以P001:纯化水=1:9体积比率配制pH7.4PBS缓冲液500ml加入2.5gBSA混匀混匀溶解,即为磁球清洗液。
将温浴好的磁球悬浮液倒入烧杯中,然后置于磁铁上沉淀后,倒掉上清,加入5倍体积的磁球清洗液搅拌清洗,然后放置在磁铁上,待上清液清亮后倒掉上清液,重复该清洗步骤四次。
按照实施例1的方法配制C溶液。
将清洗完毕后的磁球悬浮在C溶液中,悬浮浓度为20mg/ml,即得到抗AⅡ抗体包被的磁球。
将上述磁球悬浮液进一步稀释至以磁球计为0.5mg/ml的悬浮液,备用。
(4)AⅡ低点校准品、高点校准品
将AⅡ抗原用50%牛血清制品按不同比例稀释成浓度为515.73pg/ml及9.70pg/ml两个高、低校准品定标点。
(5)组装
将上述试剂成分分装后组装成试剂盒,储存于2~8℃。
实施例7:
(1)AⅡ抗原-BSA蛋白连接物的标记,具体步骤如下:
透析液(F溶液)的配制:在5000ml容器中加入Na2CO314.31g,NaHCO326.46g,加纯化水稀释至4500ml。配制好的F溶液置于磁力搅拌器上备用。
选用合适截留量(常用分子量14000)的透析袋,量取足够容纳F溶液的尺寸,润湿后扎紧一端,纯化水试漏3次(需无漏液)。
取100μg AⅡ抗原-BSA蛋白连接物用0.1mol/L pH9.5的碳酸缓冲液(F溶液)调整到1ml。放入透析液中,室温搅拌透析2小时,将透析好的溶液加入300μg ABEI活化酯,37℃反应2小时。
通过G-25凝胶柱纯化AⅡ抗原-BSA蛋白链接物与ABEI的连接产物。
D2溶液的配制:在2000ml烧杯中加入200ml 0.5M磷酸盐缓冲液、20g BSA、8g NaN3、2g MgCl2·6H2O、600ml甘油,加纯化水稀释至2000ml,过滤。
纯化好的连接产物体用D2溶液对倍稀释。
(2)羊抗FITC多克隆抗体包被磁球,具体步骤如下:
按实施例1中方法配制好A溶液。
向小白瓶中加入5倍于包被体积的A溶液,放入超声波仪器中一边超声一边搅拌清洗2-3分钟,然后置于磁铁上,待上清液清亮后,倒出上清液。该步骤重复三次。
将磁球加入包被体积等量的pH3.6醋酸缓冲液中,使磁球的悬浮浓度为20mg/ml,再加入CMC(浓度为10mg/ml),加入纯化的羊抗FITC多克隆抗体。
将磁球悬浮液放入恒温震荡水浴箱中37℃反应24小时(震荡水浴锅振摇速度:260rpm)。
以P001:纯化水=1:9体积比率配制pH7.4的PBS缓冲液500ml,加入2.5gBSA混匀溶解,即为磁球清洗液。
将温浴好的磁球悬浮液倒入烧杯中,然后置于磁铁上沉淀后,倒掉上清,加入5倍体积的磁球清洗液搅拌清洗,然后放置在磁铁上,待上清液清亮后倒掉上清液,重复该清洗步骤四次。
按照实施例1的方法制备C溶液。
将清洗完毕后的磁球悬浮在C溶液中,悬浮液浓度为20mg/ml,即得到羊抗FITC多克隆抗体包被的磁球,此悬浮液体积即为本步骤所述包被体积。
将上述磁球悬浮液进一步稀释至以磁球计为0.5mg/ml的悬浮液,备用。
(3)抗AⅡ抗体标记,具体步骤如下:
取1mg抗AⅡ抗体用0.1mol/L pH9.5的碳酸缓冲液(F溶液)调整到1ml。放入透析液中,室温搅拌透析2小时,将透析好的溶液加入300μg FITC,室温边摇边反应24h。
通过G-25凝胶柱纯化抗AⅡ抗体与FITC的连接产物。
C2溶液的配制:加入200ml 0.5M磷酸盐缓冲液、20g BSA、8g NaN3、2gMgCl2·6H2O、加纯化水稀释至2000ml(过滤)。配制好C2溶液,以纯化好的连接产物体用C2溶液对倍稀释。
(4)AⅡ低点校准品、高点校准品的制备
将AⅡ抗原用50%牛血清制品按不同比例稀释成浓度为591.578pg/ml及42.260pg/ml两个高、低校准品定标点。
实施例8:利用检测试剂盒进行化学发光检测AⅡ
使用上述实施例1-7制备好的AⅡ检测试剂盒和Maglumi 2000化学发光分析仪,通过化学发光免疫竞争法来检测样本的AⅡ浓度,待测样本为160例临床样本。AⅡ浓度与相对光强度(Relative Light Unit,RLU)成一定的比例关系,可以使用测定仪来自动拟合计算AⅡ浓度。
选取实施例1中所得的试剂盒进行化学发光法检测的具体步骤描述如下:
1、在样本架上依次加载校准品或待测样本,待测样本为经过酶抑制剂处理后的样本。
2、将样本架插入Maglumi 2000化学发光分析仪的样本仓,编辑样本号开始运行试验,具体加样步骤为:校准品或待测样本加100μl,然后加示踪标记物标记的AⅡ抗原溶液50μl,加抗AⅡ抗体包被的磁性微球悬浮液20μl,混匀,37℃温育15分钟,仪器自动清洗两遍后直接进入测量室得到各个样本的光强度信号,通过十点曲线及两点定标自动拟合出待测样本的AⅡ抗原浓度值。检测结果见表1。
选取实施例4中所得的试剂盒进行化学发光法检测的具体步骤描述如下:
1、在样本架上依次加载校准品或待测样本,待测样本为经过酶抑制剂处理后的样本。
2、将样本架插入Maglumi 2000化学发光分析仪的样本仓,编辑样本号开始运行试验,具体加样步骤为:校准品或待测样本加100μl,然后加标记有示踪标记物的抗AⅡ抗体溶液50μl,加AⅡ抗原标记的FITC溶液50μl,加羊抗FITC多克隆抗体包被的磁性微球悬浮液20μl,混匀,37℃温育15分钟,仪器自动清洗两遍后直接进入测量室得到各个样本的光强度信号,通过十点曲线及两点定标自动拟合出待测样本的AⅡ抗原浓度值。检测结果见表1。
选取实施例7中所得的试剂盒进行化学发光法检测的具体步骤描述如下:
1、在样本架上依次加载校准品或待测样本,待测样本为经过酶抑制剂处理后的样本。
2、将样本架插入Maglumi 2000化学发光分析仪的样本仓,编辑样本号开始运行试验,具体加样步骤为:校准品或待测样本加100μl,然后加标记有示踪标记物的抗AⅡ抗体溶液50μl,加AⅡ抗原标记的FITC溶液50μl,加羊抗FITC多克隆抗体包被的磁性微球悬浮液20μl,混匀,37℃温育15分钟,仪器自动清洗两遍后直接进入测量室得到各个样本的光强度信号,通过十点曲线及两点定标自动拟合出待测样本的AⅡ抗原浓度值。检测结果见表1。
对比例1
采用市面上现有的主流商品化放射性免疫试剂盒对实施例8中的160例临床样本进行检测,检测结果见表1。
表1
本次临床对比试验选取的160例临床样本中,145-160号共16例样本为原发性醛固酮增多症确诊患者,其余样本则为体检正常样本。原发性醛固酮增多症患者,由于醛固酮分泌增多,导致钠、水潴留,进而导致细胞外液及血容量增多,使肾小球入球小动脉压力上升,引发球旁细胞及致密斑细胞受抑制,使肾素分泌减少。肾素-血管紧张素系统的活性受抑制,此种病人不仅在基础状态下血管紧张素Ⅱ低下,而且应用刺激肾素开释的力法,如采用立位、低钠膳食或给利尿剂等,血管紧张素Ⅱ均不增加或略有增加。通过本发明实施例试剂盒检测健康个体血管紧张素Ⅱ,95%置信区间为立位:25-60pg/ml,卧位:50-120pg/ml,即正常人的立位和卧位检测值应分别落入上述参考区间内。
如表1所示数据,只有148号样本显示出本发明实施例试剂盒与放射性免疫试剂盒检测结果不一致;除去148号检测结果,将实施例1、实施例4和实施例7试剂盒对其余样本的检测结果分别与用放射性免疫试剂盒对其余样本的检测结果进行直线拟合,对于实施例1线性方程为y=0.998x-0.284,相关系数R=0.9955,对于实施例4线性方程为y=0.998x+0.316,相关系数R=0.9960,对于实施例7线性方程为y=0.996x+0.499,相关系数R=0.9950。可见,本发明提供的检测试剂盒与现有放免试剂盒有较好的一致性。
然而,加上对148号样本的测定结果综合来看,本发明提供的似乎试剂盒和检测方法具有更高的准确性。148号样本为取自原发性醛固酮增多症患者的样本,其立卧位血管紧张素Ⅱ水平一般情况下都会偏低。采用实施例1、实施例4及实施例7制备的试剂盒检测此样本所得结果接近置信区间下限,表示其立卧位血管紧张素Ⅱ水平极低,与此样本的临床诊断相符合。然而,使用放免试剂盒的立、卧位检测结果均接近置信区间上限,这明显与临床实际情况不相符。由此说明本发明提供的试剂盒及其检测方法的检测效果优于所对比的放免试剂盒的检测效果,能够更加准确、真实地反应临床情况。
对于上述其他实施例中制备的试剂盒,均经过临床检验,效果与实施例1、实施例4及实施例7一致,出于节约篇幅考虑,在此不再列出检验数据。
综上,与商品化的某放射性免疫试剂盒相比,根据本发明提供的试剂盒的测量值与实际值符合程度更好,临床符合率更高,说明试剂盒的诊断能力更强。此外,相比于放射性免疫试剂盒,本发明提供的试剂盒具有更高的稳定性、使用安全性和环保性。
虽然本发明已作了详细描述,但对本领域技术人员来说,在本发明精神和范围内的修改将是显而易见的。此外,应当理解的是,本发明记载的各方面、不同具体实施方式的各部分、和列举的各种特征可被组合或全部或部分互换。在上述的各个具体实施方式中,那些参考另一个具体实施方式的实施方式可适当地与其它实施方式组合,这是将由本领域技术人员所能理解的。此外,本领域技术人员将会理解,前面的描述仅是示例的方式,并不旨在限制本发明。
Claims (14)
1.一种用于检测血管紧张素Ⅱ的化学发光免疫检测试剂盒,所述试剂盒包括组分A和组分B,所述组分A为血管紧张素Ⅱ抗原或血管紧张素Ⅱ抗原与蛋白载体的连接物,组分B为抗血管紧张素Ⅱ抗体,所述组分A和组分B中的一种标记示踪标记物,另一种包被磁球。
2.根据权利要求1所述试剂盒,其特征在于,所述蛋白载体选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、兔血清白蛋白、血蓝蛋白、牛IgG、人IgG、卵清蛋白、肌红蛋白和甲状腺球蛋白中的至少一种。
3.根据权利要求1所述试剂盒,其特征在于,所述示踪标记物选自金刚烷、鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺及其衍生物、吖啶酯、碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶中的至少一种。
4.根据权利要求1所述试剂盒,其特征在于,所述示踪标记物为N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺。
5.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述磁球为Fe2O3或Fe3O4磁性纳米粒子与有机高分子材料的复合体,并具有0.1-5μm的粒径;并且,所述磁球任选地通过表面改性而带有多种活性功能基团。
6.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,在所述试剂盒中,血管紧张素Ⅱ抗原或血管紧张素Ⅱ抗原与蛋白载体的连接物浓度为0.002-0.01mg/ml;抗血管紧张素Ⅱ抗体浓度为0.05-1mg/ml;磁球浓度为0.05-1mg/ml;示踪标记物浓度为0.2-1mg/l。
7.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,
所述示踪标记物直接或间接标记组分A或组分B,所述间接标记的方式包括通过异硫氰酸荧光素与抗异硫氰酸荧光素抗体体系或链霉亲和素与生物素体系间接标记组分A或组分B;
组分A或组分B直接或间接包被磁球,所述间接包被的方式通过异硫氰酸荧光素与抗异硫氰酸荧光素抗体体系或链霉亲和素与生物素体系间接包被磁球。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括选自组分A1和组分A2中的任意一种的组分,以及选自组分B1、组分B2和组分B3中的任意一种的组分;其中
组分A1为N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺直接标记的血管紧张素Ⅱ抗原;
组分A2为链霉亲和素标记的N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺和生物素化的血管紧张素Ⅱ抗原;
组分B1为抗血管紧张素Ⅱ抗体直接包被的磁球;
组分B2为生物素化的抗血管紧张素Ⅱ抗体和链霉亲和素包被的磁球;以及
组分B3为抗血管紧张素Ⅱ抗体标记的异硫氰酸荧光素和羊抗异硫氰酸荧光素抗体包被的磁球。
9.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括选自组分C1和组分C2中的任意一种的组分,以及选自组分D1、组分D2和组分D3中的任意一种的组分;其中
组分C1为N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺直接标记的抗血管紧张素Ⅱ抗体;
组分C2为链霉亲和素标记的N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺和生物素化的抗血管紧张素Ⅱ抗体;
组分D1为血管紧张素Ⅱ抗原直接包被的磁球;
组分D2为生物素化的血管紧张素Ⅱ抗原和链霉亲和素包被的磁球;以及
组分D3为血管紧张素Ⅱ抗原标记的异硫氰酸荧光素和羊抗异硫氰酸荧光素抗体包被的磁球。
10.根据权利要求1-9中任意一项所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括血管紧张素Ⅱ抗原的低点校准品和高点校准品,并任选地包括缓冲液。
11.一种用于制备如权利要求1-10中任意一项所述的试剂盒的方法,所述方法包括:将组分A或组分B中的一种直接或间接标记示踪标记物,将另一种直接或间接包被磁球。
12.根据权利要求11所述的方法,其特征在于,
所述间接标记包括将示踪标记物通过异硫氰酸荧光素与抗异硫氰酸荧光素抗体体系或链霉亲和素与生物素体系标记所述组分A或组分B;
所述间接包被包括将所述组分A或组分B通过异硫氰酸荧光素与抗异硫氰酸荧光素抗体体系或链霉亲和素与生物素体系间接包被磁球。
13.一种检测血管紧张素Ⅱ浓度的方法,其特征在于,所述方法包括使用如权利要求1-10中任意一项所述的试剂盒,通过化学发光免疫法对待测样品中的血管紧张素Ⅱ浓度进行检测。
14.根据权利要求13所述的方法,其特征在于,所述方法包括使用如权利要求1-8中任意一项所述的试剂盒,通过化学发光免疫分析仪检测血管紧张素Ⅱ浓度。
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