CN102539419A - 用于检测血管紧张素ii的磁微粒化学发光试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测血管紧张素II的磁微粒化学发光试剂盒，包括偶联有兔抗血管紧张素II抗体的磁微粒混悬液，校准品，生物素偶联的血管紧张素II抗原，辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，化学发光底物A、化学发光底物B以及洗液。本发明的优点在于可实现操作的简便性、自动化性，检测结果具有更好的重复性和准确性，检测时间短，稳定性可达12个月，不存在放射污染。测试时采用一步法加样，即将参与反应的磁微粒混悬液、待测样本、生物素偶联的血管紧张素II抗原、辣根过氧化物酶标记链霉亲和素在一个操作步骤中加入反应杯中，减少了操作步骤和反应时间，降低了操作过程引入的误差。
Description
技术领域
本发明涉及医用诊断试剂领域，尤其是涉及一种利用化学发光技术结合磁微粒偶联和分离技术检测血管紧张素II含量的试剂盒。
背景技术
血管紧张素是一种能够收缩血管升高血压的多肽，它是肾素-血管紧张素-醛固酮系统的一部分。许多降血压药物以血管紧张素为靶分子。血管紧张素也能够刺激肾上腺皮质分泌醛固酮。醛固酮促进远端肾单位的钠潴留，同时也能够升高血压。
血管紧张素II是肾素-血管紧张素-醛固酮系统调节血压的一个直接作用物质。同时，血管紧张素II也能够作为促生长因子直接促进血管内皮细胞的增生。最近的研究发现，血管紧张素II直接和血管内皮细胞增生，血管狭窄和动脉血管阻力增加有直接关系。因此，血管紧张素II用于高血压的诊断和治疗效果的检测被越来越重视。
摄取ACEI后，活性肾素和ANG1的水平会立即升高，同时伴有血浆血管紧张素II水平的降低。因此，短期内血浆血管紧张素II的水平体现了RAS系统对ACEI的一个调整和适应过程。长期ACEI的治疗通常会伴有血浆血管紧张素II水平的反弹。这可能主要是由于血管紧张素II的其他合成途径的代偿升高。血管紧张素II的水平反弹提示，在高血压的长期治疗过程中，要对血管紧张素II的水平进行连续和不间断的监测。
血管紧张素II的检测是一个非常有帮助的工具，能够监测药物的作用和效果，评价疗效。同时对于充血性心力衰竭和高血压的治疗可以起到很好的评价和指导作用。
目前检测血管紧张素II的方法以放射免疫技术为主，采用放射免疫技术测定血管紧张素II，其灵敏度和抗干扰能力严重不足，由于在测定血管紧张素II方面操作方法的复杂性，操作过程不易控制，造成测定结果的重复性差、变异大，另外放射免疫方法存在检测时间长、稳定性差的缺陷，同时还存在放射源污染的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速准确且污染小的用于检测血管紧张素II的磁微粒化学发光试剂盒。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的用于检测血管紧张素II的磁微粒化学发光试剂盒，包括偶联有兔抗血管紧张素II抗体的磁微粒混悬液，校准品，生物素偶联的血管紧张素II抗原，辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，化学发光底物A、化学发光底物B以及洗液。
所述偶联有兔抗血管紧张素II抗体的磁微粒先包被羊抗兔IgG，再间接包被兔抗血管紧张素II抗体。
所述校准品以0.05M的Tris-NaCl和2%的酪蛋白组成pH7.4的缓冲液为基质，加入血管紧张素II纯品配制而成。
所述生物素偶联的血管紧张素II抗原以0.01M的PBS和2%BSA作为缓冲液基质，工作浓度为1:10000。
所述辣根过氧化物酶标记链霉亲和素以0.01M的PBS和2%BSA作为缓冲液基质，工作浓度为1:6000。
所述化学发光底物A由Luminol 0.15mM、羟基香豆素0.59 mM、没食子酸0.35 mM、Tris-HCl缓冲液0.2M组成，最后调pH7.4；化学发光底物B 由0.2M乙酸-乙酸盐缓冲液、维生素C 0.12 mM、氨基酸氧化酶0.85 mM组成，最后调pH7.4。
本发明的优点在于可实现操作的简便性、自动化性，检测结果具有更好的重复性和准确性，检测时间短，稳定性可达12个月，不存在放射污染。
附图说明
图1是本发明试剂盒检测血管紧张素II的校准曲线图。
具体实施方式
本发明所述的用于检测血管紧张素II的磁微粒化学发光试剂盒，包括偶联有兔抗血管紧张素II抗体的磁微粒混悬液，校准品，生物素偶联的血管紧张素II抗原，辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，化学发光底物A、化学发光底物B以及洗液。
偶联有兔抗血管紧张素II抗体的磁微粒上先偶联羊抗兔IgG，再间接免疫偶联兔抗血管紧张素II抗体，采用氨基戊二醛法；校准品以0.05M的Tris-NaCl和2%的酪蛋白组成pH7.4的缓冲液为基质加入血管紧张素II纯品配制而成；生物素偶联的血管紧张素II抗原以0.01M的PBS和2%BSA作为缓冲液基质稀释到1:10000的工作浓度；辣根过氧化物酶标记链霉亲和素以0.01M的PBS和2%BSA为缓冲液基质稀释至1:6000的工作浓度；
所述化学发光底物A由Luminol 0.15mM、羟基香豆素0.59 mM、没食子酸0.35 mM、Tris-HCl缓冲液0.2M组成，最后调pH7.4；化学发光底物B 由0.2M乙酸-乙酸盐缓冲液、维生素C 0.12 mM、氨基酸氧化酶0.85 mM组成，最后调pH7.4。
洗液由0.1M磷酸盐缓冲液和1%Tween20配制而成，使用时用蒸馏水20倍稀释。
使用本发明试剂盒检测血管紧张素II的使用操作程序如下：
1、在反应杯中依次加入100μl校准品、100μl待测样本、20μl磁微粒混悬液、50μl生物抗原、50μl酶标记物；
2、将反应杯中溶液混合均匀，37℃温育30分钟；
3、使用磁分离器洗涤设备，将反应杯中的磁微粒用洗液洗涤3次；
4、加入化学发光底物A和化学发光底物B各50μl，混匀后室温避光反应5分钟；
5、使用化学发光检测仪检测发光信号值并记录；
6、采用四参数拟合方式，建立定标曲线，计算测定结果。
检测时采用一步法加样，即将参与反应的磁微粒混悬液、待测样本、生物素偶联的血管紧张素II抗原、辣根过氧化物酶标记链霉亲和素在一个操作步骤中加入反应杯中，减少了操作步骤和反应时间，降低了操作过程引入的误差。
使用本发明试剂盒检测血管紧张素II，所用时间较短，测定结果仅需40分钟即可得出，方便快捷。使用本试剂盒检测血管紧张素II时可达到如下指标：
校准曲线范围：0pg/ml—1000pg/ml；
校准曲线线性：浓度值和检测发光值以四参数拟和方式进行线性拟合，线性系数R>0.999，见图1，图1原始数据，用四参数拟合，X为浓度值，Y为发光值取log；
| 浓度值（X） | 发光值 |
| 0 | 12495 |
| 10 | 8266 |
| 50 | 5536 |
| 250 | 2888 |
| 500 | 2000 |
| 1000 | 1231 |
灵敏度：用稀释液测定20次，最低检出量小于2.0pg/ml；
精密度：分析内精密度平均7.29%（n=10），分析间精密度平均8.03%（n=30），见下表 1：
| Q1 | Q2 | Q3 | |
| 样品浓度(pg/ml) | 35.23 | 130.47 | 264.82 |
| 分析内（CV%） | 8.44 | 6.52 | 6.91 |
| 分析间（CV%） | 9.31 | 7.39 | 7.38 |
准确性：回收试验，回收率（实测浓度与理论浓度的比值）为82%-116%，见表2（单位：pg/ml）：
Claims (6)
1.用于检测血管紧张素II的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于：包括偶联有兔抗血管紧张素II抗体的磁微粒混悬液，校准品，生物素偶联的血管紧张素II抗原，辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，化学发光底物A、化学发光底物B以及洗液。
2.根据权利要求1所述的用于检测血管紧张素II的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于：所述偶联有兔抗血管紧张素II抗体的磁微粒先包被羊抗兔IgG，再间接包被兔抗血管紧张素II抗体。
3.根据权利要求1所述的用于检测血管紧张素II的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于：所述校准品以0.05M的Tris-NaCl和2%的酪蛋白组成pH7.4的缓冲液为基质，加入血管紧张素II纯品配制而成。
4.根据权利要求1所述的用于检测血管紧张素II的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于：所述生物素偶联的血管紧张素II抗原以0.01M的PBS和2%BSA作为缓冲液基质，工作浓度为1:10000。
5.根据权利要求1所述的用于检测血管紧张素II的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于：所述辣根过氧化物酶标记链霉亲和素以0.01M的PBS和2%BSA作为缓冲液基质，工作浓度为1:6000。
6.根据权利要求1所述的用于检测血管紧张素II的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于：所述化学发光底物A由Luminol 0.15mM、羟基香豆素0.59 mM、没食子酸0.35 mM、Tris-HCl缓冲液0.2M组成，最后调pH7.4；化学发光底物B 由0.2M乙酸-乙酸盐缓冲液、维生素C 0.12 mM、氨基酸氧化酶0.85 mM组成，最后调pH7.4。
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